蔣成義 汪洪濤 江 濤 許亞佳 夏 林

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，蚌埠233004)

miR-346在鼻咽癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能①

蔣成義 汪洪濤②江 濤 許亞佳 夏 林

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，蚌埠233004)

目的：探討miR-346在鼻咽癌中的表達(dá)及在鼻咽癌中的生物學(xué)功能。方法：收集63例鼻咽癌組織以及34例鼻咽部非癌組織標(biāo)本，Real-time PCR檢測組織和6株人鼻咽癌細(xì)胞系及1株人正常鼻咽部永生化上皮細(xì)胞株NP69中miR-346表達(dá)量，選取人鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)量居中的兩種細(xì)胞系，并轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor，設(shè)置對照組(NC組)并轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒，Real-time PCR檢測兩種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor和對照組miR-346表達(dá)量，細(xì)胞增殖、凋亡分別采用Brdu-ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測，Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲。結(jié)果：與鼻咽非癌組織比較，鼻咽癌組織中miR-346表達(dá)量顯著升高(P=0.000)；以正常人鼻咽部上皮細(xì)胞NP69比較，各鼻咽癌細(xì)胞株中miR-346相對表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。選擇6種鼻咽癌細(xì)胞株中miR-346表達(dá)量居中的兩種，分別為CNE-1和CNE-2，轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor后，兩種鼻咽癌細(xì)胞株miR-346相對表達(dá)量均顯著降低，與NC組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩種鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor下調(diào)miR-346表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞的增殖受到抑制，均在轉(zhuǎn)染第3天差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。下調(diào)miR-346表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和CNE-2的凋亡顯著增加，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，與NC組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：miR-346在鼻咽癌中高表達(dá)，下調(diào)miR-346表達(dá)會抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡，miR-346可能作為一種癌基因在鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

miR-346；鼻咽癌；增殖；凋亡；遷移；侵襲

鼻咽癌起源于鼻咽部上皮細(xì)胞，是常見的頭頸部惡性腫瘤。目前已知的鼻咽癌致病因素包括遺傳易感性、飲食和環(huán)境因素、EB病毒感染[1]。鼻咽癌具有早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和高度局部轉(zhuǎn)移的特征，且起病隱匿，易復(fù)發(fā)，雖然以調(diào)強(qiáng)放射治療技術(shù)為主的放化療綜合治療可以提高鼻咽癌的局控率，但鼻咽癌的5年生存率仍僅維持在70%[2]。深入了解鼻咽癌的癌變分子機(jī)制有助于提高鼻咽癌的早期診斷準(zhǔn)確率，并尋找到其他更有效的治療方法從而延長生存期，改善患者預(yù)后。

microRNA簡稱miRNA，是非編碼RNA分子的一種，長度為19～25 nt。miRNA能夠與下游基因mRNA的3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)特異性結(jié)合影響mRNA的降解和翻譯，從而參與調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、增殖等多種生理及病理過程[3]。miRNA與腫瘤的關(guān)系是近年來研究的熱點，研究發(fā)現(xiàn)超過50%的miRNA基因定位在與腫瘤相關(guān)的脆性位點[4]。miRNA與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管新生等密切相關(guān)[5]，目前已經(jīng)在多種腫瘤中檢測到miRNA 的異常表達(dá)[4，5]。miR-346是miRNA家族中的一種，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)miR-346在炎性腸道疾病[6]和甲狀腺腫[7]等的發(fā)生中具有重要作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-346與宮頸癌的發(fā)生也有關(guān)[8]，miR-346在鼻咽癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能尚不清楚，本研究旨在探討miR-346在鼻咽癌中的表達(dá)，采用細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)認(rèn)為干預(yù)鼻咽癌細(xì)胞中miR-346表達(dá)量，分析miR-346表達(dá)量改變對鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等惡性腫瘤生物學(xué)特征的影響。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma公司，dNTP Mix、Taq DNA Polymerase、GeneRulerTM100 bp DNA Ladder、QIAqucik Gel Extraction Kit、質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)胞裂解液均購自美國Fermentas公司；胰蛋白酶購自美國DIBCO公司；碘化丙啶、超速離心機(jī)購自美國Sigma公司；PCR儀購自美國Bio-Rad公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，酶標(biāo)儀購自上海賽默飛世爾公司，抗BrdU 抗體、miR-346抑制物(Inhibitor)以及陰性對照質(zhì)粒均購自上海吉瑪生物公司；二甲基亞砜(DMSO)購自碧云天生物技術(shù)公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國BD Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1組織獲取和細(xì)胞培養(yǎng) 63例鼻咽癌組織以及34例鼻咽部非癌組織均來自安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科。所有標(biāo)本均為鼻咽部活檢取得，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診，入選者均知情同意，此前均未接受放化療治療，組織獲取后置于液氮中保存。6株人鼻咽癌細(xì)胞系HONE1、6-10B、CNE-1、C666-1、CNE-2、SUNE-1以及1株人正常鼻咽部永生化上皮細(xì)胞株NP69購自上海中科院細(xì)胞所。細(xì)胞均培養(yǎng)于10%胎牛血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：5%CO2、37℃、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱，每隔48～72 h，用0.25%的胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞傳代2～3代用于后續(xù)實驗。

1.2.2實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR) 取凍存的組織約0.1 g，置于冰凍的研缽中加液氮充分研磨成細(xì)粉，放入離心管并加入裂解液，離心后靜置；用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞加入裂解液，靜置10 min至細(xì)胞裂解完全。收集細(xì)胞裂解液并按照試劑盒提取細(xì)胞和組織中總RNA，配制miRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液對總RNA中的miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。冰上配制miR-346的qPCR反應(yīng)液，混勻后加入PCR反應(yīng)管中，離心并將混合物加入多孔板，多孔板置于PCR儀中，兩步法進(jìn)行退火反應(yīng)：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，擴(kuò)增40個循環(huán)。繪制光譜和溶解曲線，軟件分析樣品的Ct值，以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算miR-346表達(dá)量。

1.2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 為了研究miR-346的生物學(xué)功能，本研究選取人鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)量居中的兩種細(xì)胞系。另外，由于鼻咽癌組織和鼻咽癌細(xì)胞系中miR-346均高表達(dá)，因此采取miR-346 inhibitor進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-346 inhibitor為miR-346抑制物，是一種慢病毒載體，可以通過感染腫瘤細(xì)胞將外源的shRNA或外源基因整合并抑制miR-346表達(dá)，由上海吉瑪生物公司合成，序列：上游：5′-TTACTCCAGAGGGCGTCACTCATGTTCAAGAGACATGAGTGAC-GCCCTCTGGAGTATTTTTTC-3′下游：5′-TCGAGA-AAAAATACTCCAGAGGGGCGTCACTCATGTCTCTT-GAACATGAGTGACGCCCTCTGGAGTAA-3′。具體方法為：將細(xì)胞種植于多孔板中，取兩個EP管，分別加入5 μl LipofectamineTM2000+100 pmol miR-346 inhibitor和5 μl LipofectamineTM2000+陰性質(zhì)粒(對照組)，加入培養(yǎng)基至終體積為2 ml。取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞重復(fù)Real-time PCR實驗。

1.2.4Brdu-ELISA 對數(shù)生長期細(xì)胞，胰腺酶消化后制備細(xì)胞單懸液，控制濃度為1×105個/ml，加入多孔板，每孔加入1 ml，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后加入BrdU標(biāo)記液，室溫孵育4 h后加入抗BrdU 抗體，PBS洗滌3次，加入底物液顯色并終止反應(yīng)。每組設(shè)5個副孔用于測定轉(zhuǎn)染后1～5 d細(xì)胞增殖情況。采用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光值。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù) 將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞用PBS洗滌，超速離心機(jī)離心后棄上清液，孵育緩沖液洗滌后離心，100 μl Binding buffer重懸細(xì)胞，加入PI，避光4℃孵育20 min并不時振動。制備單細(xì)胞懸液，濃度為1×105個/ml，采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡百分比。

1.2.6Transwell小室實驗 Matrigel預(yù)先放入4℃冰箱融化過夜，無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel至1 mg/ml，每孔加入100 μl稀釋液至Transwell小室，包被1 h后洗滌。分別向鋪設(shè)(侵襲試驗)和未鋪設(shè)(遷移試驗)Matrigel的培養(yǎng)嵌室上部加入轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞懸液，每孔加入100 μl約2.5×104個，底部為正常培養(yǎng)基，5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)24 h后吸去嵌室內(nèi)的液體并用聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS漂洗，倒置顯微鏡下選取5個視野計算細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1組織和各細(xì)胞株中miR-346表達(dá)量比較 與鼻咽非癌組織比較，鼻咽癌組織中miR-346表達(dá)量顯著升高(3.124±0.832 vs 5.993±1.139,t=2.493,P=0.000，圖1A)；與正常人鼻咽部上皮細(xì)胞NP69比較，各鼻咽癌細(xì)胞株中miR-346相對表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

2.2轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor對兩種鼻咽癌細(xì)胞株miR-346表達(dá)量的影響 選擇6種鼻咽癌細(xì)胞株中miR-346表達(dá)量居中的兩種，分別為CNE-1和CNE-2，轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor后，CNE-1(圖2A)和CNE-2(圖2B)兩種鼻咽癌細(xì)胞株miR-346相對表達(dá)量均顯著降低，與NC組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 組織和各細(xì)胞株中miR-346表達(dá)量比較Fig.1 miR-346 expression in tissue and cells of naso-pharyngeal carcinomaNote:*.P<0.05.

2.3下調(diào)miR-346表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響 Brdu-ELISA檢測結(jié)果顯示，CNE-1(圖3A)和CNE-2(圖3B)兩種鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor下調(diào)miR-346表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞的增殖受到抑制，在第3天差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4下調(diào)miR-346表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，下調(diào)miR-346表達(dá)后CNE-1和CNE-2兩種鼻咽癌細(xì)胞的凋亡顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5下調(diào)miR-346表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞遷移的影響 由圖5可知，下調(diào)miR-346表達(dá)后CNE-1和CNE-2兩種鼻咽癌細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)均明顯低于NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6下調(diào)miR-346表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞侵襲的影響 由圖6可知，下調(diào)miR-346表達(dá)后CNE-1和CNE-2兩種鼻咽癌細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯低于NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor降低鼻咽癌細(xì)胞株miR-346表達(dá)Fig.2 Expression of miR-346 reduced after transfection miR-346 inhibitor in nasopharyngeal carcinoma cell linesNote:*.P<0.05.

圖3 下調(diào)miR-346表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖Fig.3 Down-regulate of miR-346 significantly suppressed growth of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

圖4 下調(diào)miR-346表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡Fig.4 Down-regulate of miR-346 significantly promoted apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

圖5 下調(diào)miR-346表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移Fig.5 Down-regulate of miR-346 significantly suppressed migration of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

圖6 下調(diào)miR-346表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲Fig.6 Down-regulate of miR-346 significantly suppressed invasion of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

3 討論

作為一種頭頸部常見惡性腫瘤，鼻咽癌主要發(fā)生于鼻咽頂?shù)膫?cè)壁和前壁，能夠早期侵犯顱底和出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。隨著診療技術(shù)水平的提高，早期鼻咽癌經(jīng)過規(guī)范化綜合治療后5年生存率可超過70%，但晚期鼻咽癌的5年生存率不足30%。目前臨床對于鼻咽癌的早期診斷以及預(yù)后評估尚缺乏特異性生物學(xué)標(biāo)志物，了解鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并找尋差異性表達(dá)的預(yù)測分子標(biāo)志物，通過研究其在鼻咽癌中的生物學(xué)功能，從而有望提高鼻咽癌的診治水平，延長生存期，改善患者預(yù)后。

目前腫瘤常見的生物學(xué)行為包括潛力無限的復(fù)制能為、抗生長信號的不敏感、抵抗細(xì)胞死亡、組織浸潤和轉(zhuǎn)移、基因組的穩(wěn)定和突變等[9]，但腫瘤究竟是如何發(fā)生和發(fā)展的，其中的具體機(jī)制仍然不明確。一般而言，腫瘤是一種基因疾病，致癌因素引起基因的改變，造成對腫瘤生長的失調(diào)。新近研究發(fā)現(xiàn)，除了常見的蛋白編碼基因，一些非編碼的基因與腫瘤的關(guān)系也越來越密切[10]。miRNA是一類非編碼RNA，在進(jìn)化上高度保守，通過特異性結(jié)合下游多個靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)，影響轉(zhuǎn)錄后基因水平。miRNA參與了包括細(xì)胞增殖、分化、生長、發(fā)育、凋亡等幾乎所有的生命活動，與包括腫瘤在內(nèi)的人類大多數(shù)疾病密切相關(guān)，而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，miRNA扮演著促癌基因或者抑癌基因的角色[11]。

miRNA表達(dá)改變受多種因素的影響，包括基因重排、染色體異常、基因突變和基因丟失。miRNA表達(dá)異常會影響受其調(diào)控的mRNA，從而調(diào)控編碼蛋白的表達(dá)。miRNA與腫瘤的關(guān)系，同一種miRNA或者同一個家族miRNA可以參與多種腫瘤的發(fā)生[12-14]。同一種miRNA在不同的腫瘤中能發(fā)揮抑癌或者癌基因不同的作用[15，16]。在同一種腫瘤中可以有多種miRNA表達(dá)異常[17，18]。

miRNA正是通過這種全方位多層次的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的生長、分化、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)控，參與包括鼻咽癌在內(nèi)的幾乎所有惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前已知有超過30多種miRNA參與鼻咽癌的發(fā)病，而關(guān)于miR-346在鼻咽癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能尚不清楚。本研究通過Real-time PCR檢測并比較了鼻咽癌組織和鼻咽部非腫瘤組織，6種鼻咽癌細(xì)胞系和正常人鼻咽部上皮細(xì)胞中miR-346表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織miR-346表達(dá)量高于鼻咽部非腫瘤組織，6種鼻咽癌細(xì)胞系miR-346表達(dá)量高于正常人鼻咽部上皮細(xì)胞。說明miR-346在鼻咽癌中高表達(dá)，可能發(fā)揮癌基因作用。為了進(jìn)一步進(jìn)行驗證，采用細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor抑制鼻咽癌細(xì)胞中miR-346，分別對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲四種生物學(xué)行為進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-346表達(dá)會抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡。以往研究認(rèn)為[7]，miR-346能夠調(diào)節(jié)卵泡輔助T細(xì)胞(Tfh)參與包括甲狀腺功能亢進(jìn)在內(nèi)的自身免疫性疾病中，miR-346在甲亢患者血清中呈低表達(dá)，且與CD4(+)CXCR5(+) T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，而上調(diào)miR-346表達(dá)會導(dǎo)致CD4(+)CXCR5(+) T細(xì)胞衰減。近年來miR-346與腫瘤的關(guān)系逐漸被發(fā)現(xiàn)和重視，Guo和他的同事[8]對miR-346在宮頸癌中的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-346在宮頸癌中高表達(dá)，能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且能夠增強(qiáng)調(diào)節(jié)蛋白Argonaute2(Ago2)的表達(dá)。本研究與Guo等的研究得到相似的觀點，認(rèn)為miR-346在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著癌基因的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果初步表明，miR-346作為一種癌基因參與鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展，人為干預(yù)miR-346表達(dá)會影響鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。本研究尚存在以下不足：首先，未進(jìn)行體內(nèi)動物實驗進(jìn)一步驗證miR-346在鼻咽癌中的生物學(xué)功能；其次，未對miR-346在鼻咽癌中發(fā)揮作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測和驗證，這將會在今后研究的中進(jìn)一步改善。

[1] Dawson CW,Port RJ,Young LS.The role of the EBV-encoded latent membrane proteins LMP1 and LMP2 in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma (NPC)[J].Semin Cancer Biol,2012,22(2):144-153.

[2] Atighechi S,Ahmadpour Baghdadabad MR,Mirvakili SA,etal.Human papilloma virus and nasopharyngeal carcinoma:pathology,prognosis,recurrence and mortality of the disease[J].Exp Oncol,2014,36(3):215-216.

[3] Sperber H,Beem A,Shannon S,etal.miRNA sensitivity to Drosha levels correlates with pre-miRNA secondary structure[J].RNA,2014,20(5):621-631.

[4] Zhang J,Zhao H,Gao Y,etal.Secretory miRNAs as novel cancer biomarkers[J].Biochim Biophys Acta,2012,1826(1):32-43.

[5] Rocci A,Hofmeister CC,Pichiorri F.The potential of miRNAs as biomarkers for multiple myeloma[J].Expert Rev Mol Diagn,2014,14(8):947-959.

[6] Chen Y,Du J,Zhang Z,etal.MicroRNA-346 mediates tumor necrosis factor α-induced downregulation of gut epithelial vitamin D receptor in inflammatory bowel diseases[J].Inflamm Bowel Dis,2014,20(11):1910-1918.

[7] Chen J,Tian J,Tang X,etal.MiR-346 regulates CD4+CXCR5+T cells in the pathogenesis of Graves′ disease[J].Endocrine,2015,49(3):752-760.

[8] Guo J,Lv J,Liu M,etal.miR-346 up-regulates argonaute 2 (AGO2) protein expression to augment the activity of other microRNAs (miRNAs) and contributes to cervical cancer cell malignancy[J].J Biol Chem,2015,290(51):30342-30350.

[9] Gadbail AR,Mankar Gadbail MP,Hande A,etal.Tumor angiogenesis:role in locally aggressive biological behavior of ameloblastoma and keratocystic odontogenic tumor[J].Head Neck,2013,35(3):329-334.

[10] Yu W,Qiao Y,Tang X,etal.Tumor suppressor long non-coding RNA,MT1DP is negatively regulated by YAP and Runx2 to inhibit FoxA1 in liver cancer cells[J].Cell Signal,2014,26(12):2961-2968.

[11] Tutar Y.miRNA and cancer;computational and experimental approaches[J].Curr Pharm Biotechnol,2014,15(5):429.

[12] Hu CB,Li QL,Hu JF,etal.miR-124 inhibits growth and invasion of gastric cancer by targeting ROCK1[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(16):6543-6546.

[13] Wan HY,Li QQ,Zhang Y,etal.MiR-124 represses vasculogenic mimicry and cell motility by targeting amotL1 in cervical cancer cells[J].Cancer Lett,2014,355(1):148-158.

[14] Feng T,Shao F,Wu Q,etal.miR-124 downregulation leads to breast cancer progression via LncRNA-MALAT1 regulation and CDK4/E2F1 signal activation[J].Oncotarget,2016,7(13):16205-16216.

[15] Xie H,Lee L,Scicluna P,etal.Novel functions and targets of miR-944 in human cervical cancer cells[J].Int J Cancer,2015,136(5):E230-E241.

[16] Christensen LL,Tobiasen H,Holm A,etal.MiRNA-362-3p induces cell cycle arrest through targeting of E2F1,USF2 and PTPN1 and is associated with recurrence of colorectal cancer[J].Int J Cancer,2013,133(1):67-78.

[17] Tang H,Deng M,Tang Y,etal.miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J].Clin Cancer Res,2013,19(20):5602-5612.

[18] Zhu ED,Li N,Li BS,etal.miR-30b,down-regulated in gastric cancer,promotes apoptosis and suppresses tumor growth by targeting plas minogen activator inhibitor-1[J].PLoS One,2014,9(8):e106049.

[收稿2016-11-03 修回2017-01-05]

(編輯 張曉舟)

ExpressionandbiologicalfunctionsofmiR-346innasopharyngealcarcinoma

JIANGCheng-Yi,WANGHong-Tao,JIANGTao,XUYa-Jia,XIALin.DepartmentofOtorhinolaryngology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China

Objective:To explore the expression and biological functions of miR-346 in nasopharyngeal carcinoma.Methods:63 cases nasopharyngeal carcinoma tissue and 34 cases nasopharyngeal non-cancer tissues were collected,the miR-346 expression were detected by Real-time PCR between nasopharyngeal carcinoma tissue and nasopharyngeal non-cancer tissues,6 strains of human nasopharyngeal carcinoma cell lines and 1 strain of normal nasopharyngeal epithelial cell immortalized NP69.Two cell lines with middle expression levels in human nasopharyngeal carcinoma cells lines were selected,and transfected into miR-346 inhibitor，the control group (NC group) were with negative control plasmid transfection,miR-346 expression in two groups were detected by Real-time PCR,the proliferation,apoptosis were detected by Brdu-ELISA and flow cytometry,the migration and invasion were detected by Transwell Chambers experiments.Results:Compared with the nasopharyngeal non-cancer tissues,the miR-346 expression in nasopharyngeal carcinoma tissues was significantly increased (P=0.000);compared with the normal nasopharyngeal epithelial cells NP69.the miR-346 expression in human nasopharyngeal carcinoma cell lines was significantly increased (P<0.05).The CNE-1 and CNE-2 were chose,after the miR-346 inhibitor transfection,the miR-346 expression were significantly lower compared with NC group,the difference was statistically significant (P<0.05).The proliferation of two kinds of nasopharyngeal carcinoma cell CNE-1 and CNE-2 were restrained after transfection,the difference showed statistically significant 3 days after transfection (P<0.05).The apoptosis increased significantly,and the migration cell numbers and invasion cell numbers decreased significantly compared with NC group,the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion:miR-346 is overexpression in nasopharyngeal carcinoma,down-regu-lation of miR-346 inhibits the proliferation,migration,invasion,promotes the apoptosis,miR-346 may act as a oncogene and play an important role in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma.

miR-346;Nasopharyngeal carcinoma;Proliferation;Apoptosis;Migration;Invasion

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.006

①本文受2015年度安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究一般項目(No.KJ2015B019by)資助。

②蚌埠醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，蚌埠233030。

蔣成義(1975年-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事耳鼻咽喉頭頸外科腫瘤診治研究，E-mail：jiangchengyi23@163.com。

R739.63

A

1000-484X(2017)06-0833-05