高原，王越，趙瑩瑩，王曦，李凡，咸玥桐

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱150076）

白藜蘆醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用研究*

高原*，王越，趙瑩瑩，王曦，李凡，咸玥桐

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱150076）

本文探討了白藜蘆醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，以200μmol·L-1的H2O2制備HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，檢測(cè)在不同濃度的白藜蘆醇（0、5、10、20、40μg·mL-1）的保護(hù)作用下，對(duì)細(xì)胞丙二醛（MDA）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力的影響。結(jié)果表明，白藜蘆醇作用于HepG2細(xì)胞后，能夠降低H2O2誘導(dǎo)損傷引起的丙二醛（MDA）升高，提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，表明白藜蘆醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)所致肝細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。

白藜蘆醇；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶；丙二醛

白藜蘆醇（resveratrol）是一種廣泛存在于自然界多種植物中的多酚類化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎、預(yù)防癌癥、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域[1]。氧化還原反應(yīng)存在于機(jī)體的整個(gè)生命過程中，正常情況下處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦體內(nèi)的氧化物大量產(chǎn)生積累或抗氧化系統(tǒng)功能減弱，都會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞的氧化損傷[2]，并引發(fā)多種疾病。有研究表明，白藜蘆醇對(duì)酒精、H2O2、四氯化碳等所致的肝損傷具有一定的保護(hù)作用[3]。HepG2細(xì)胞來源于人類肝胚細(xì)胞瘤，所含生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有同源性，它保留了較完整的生物轉(zhuǎn)化代謝Ⅰ相和Ⅱ相酶，是檢測(cè)肝功能損傷的理想細(xì)胞系[4]。本研究擬通過構(gòu)建HepG2細(xì)胞氧化損傷模型，觀察白藜蘆醇對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，為探討其抗氧化損傷機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

HepG2細(xì)胞（哈爾濱商業(yè)大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所保存）；四甲基氮唑鹽（Sigma公司）；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品≥98%（上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（四季青）；胎牛血清（四季青）；MDA、SOD和GSH-Px試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA223S-CW型分析天平（上海精天電子儀器公司）；HH-ZK型二孔多能水浴鍋（鄭州英裕予華儀器有限公司）；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；酶標(biāo)儀ELx800（BioTek）；CO2培養(yǎng)箱（memmert），生物安全柜（Airstream）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代將在液氮中凍存的細(xì)胞株從液氮罐中取出，迅速置于37℃的水浴中，反復(fù)搖動(dòng)，將凍存管中物質(zhì)全部溶解，置于生物安全柜中。首先，使用75%乙醇將凍存管的管口擦凈，小心開蓋，并用微量移液器吸凈管中液體，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，補(bǔ)充10mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，1500r·min-1離心5min，棄上清。將10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液加入離心管中，混勻后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2孵化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響取處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成1×104個(gè)細(xì)胞·mL-1；將200μL細(xì)胞懸液分別加入96孔板每個(gè)孔中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔中加入設(shè)定濃度的白藜蘆醇，稀釋至需要的工作濃度（0、5、10、20、40、80μg·mL-1）。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。MTT用無血清RPMI1640培養(yǎng)液配成濃度為5mg·mL-1的溶液，每孔中加入20μL，置于37℃5%CO2孵化培養(yǎng)箱中孵育4h。吸出上清，用培養(yǎng)液洗滌3次后加入100μL DMSO溶解沉淀物，用漩渦振蕩器混勻并在OD570nm下進(jìn)行檢測(cè)[5]。按下列公式計(jì)算藥物對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率：

細(xì)胞生長存活率＝（實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD）×100%

1.3.3 白藜蘆醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞抗氧化酶活力等指標(biāo)的影響取處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1×104細(xì)胞，培養(yǎng)約12h后，分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和不同濃度的白藜蘆醇組。陰性對(duì)照組不加受試物；陽性對(duì)照組只加入200μmol·L-1H2O2干預(yù)6h，白藜蘆醇組分別加入濃度為（0、1、5、10、20、40μg·mL-1）預(yù)處理12h，各濃度再加入200μmol·L-1H2O2作用6h，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。干預(yù)結(jié)束后用0.01mol·L-1PBS清洗2次，然后每孔加入1%Triton100的PBS緩沖液0.5mL，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后2000r·min-110min離心取得上清，參照試劑盒要求，測(cè)定細(xì)胞中MDA水平、SOD活性、GSH-PX活性等相關(guān)氧化損傷的指標(biāo)。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及方法應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用ANOVA方差分析并行方差齊性檢驗(yàn)；結(jié)果以X±S表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 MTT法測(cè)定白藜蘆醇對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用

本文選擇HepG2細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定白藜蘆醇對(duì)其抑制情況。與空白對(duì)照組相比白藜蘆醇濃度（0、5、10、20、40、80μg·mL-1）保護(hù)組表現(xiàn)為低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞無明顯抑制作用和高濃度時(shí)具有一定的抑制作用。如圖1所示，在0～40μg·mL-1白藜蘆醇對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率≤3%，說明在0～40μg·mL-1濃度下對(duì)HepG2細(xì)胞無明顯抑制作用，故下一步實(shí)驗(yàn)白藜蘆醇保護(hù)組選擇0～40μg·mL-1的濃度范圍。

圖1白藜蘆醇對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率的測(cè)定（p＜0.05）Fig.1Inhibition rate determination of resveratrol on HepG2 cells（p＜0.05）

2.2 白藜蘆醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞抗氧化酶活力的影響

與空白對(duì)照組比較，H2O2誘導(dǎo)模型組細(xì)胞懸液中SOD活性明顯降低,GSH-Px活性明顯下降，MDA水平明顯升高。白藜蘆醇在0～40μg·mL-1濃度范圍對(duì)HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用下，肝細(xì)胞懸液中SOD活性升高，GSH-Px活性升高，MDA水平明顯上升，且變化趨勢(shì)均呈明顯的劑量依賴性，見圖2～4。

圖2白藜蘆醇對(duì)HepG2細(xì)胞SOD活性的影響（p＜0.05）Fig.2Effect of resveratrol on HepG2 cells SOD activity（p＜0.05）

圖3白藜蘆醇對(duì)HepG2細(xì)胞MDA水平的影響（p＜0.05）Fig.3Effect of resveratrol on HepG2 cells MDA level（p＜0.05）

圖4白藜蘆醇對(duì)HepG2細(xì)胞GSH-Px活性的影響（p＜0.05）Fig.4Effect of resveratrol on HepG2 cells GSH-Px activity（p＜0.05）

3 結(jié)論

當(dāng)生物體內(nèi)正常的氧化還原反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí)，往往會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞的氧化損傷。丙二醛（MDA）是肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，MDA的測(cè)定可以用于評(píng)價(jià)氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活力反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力[6]。GSH-Px能夠有效的清除脂質(zhì)和其他的有機(jī)的氫過氧化物，是氧化應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)作用的重要酶[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的白藜蘆醇能抑制H2O2所誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，白藜蘆醇對(duì)H2O2所致的肝細(xì)胞損傷有明顯的抗氧化作用,能夠提高HepG2細(xì)胞的SOD和GSH-Px的活性，降低MDA含量，表明白藜蘆醇對(duì)肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

［1］周玲芝.白藜蘆醇酒劑對(duì)老齡小鼠MDA、SOD和GSH-PX的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30（7）:45-46.

［2］卞夢(mèng)瑤,方勇,裴斐,等.生姜油樹脂對(duì)過氧化氫引起的RAW264. 7巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.食品科學(xué),2014,35（1）:244-249.

［3］周曉云,崔曉明,崔國金,等.白藜蘆醇對(duì)小鼠酒精性肝損傷的抑制作用［J］.河北聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào),2014,16（1）:3-5.

［4］王玉嬌.草蓯蓉多糖對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用［D］.延邊大學(xué),2014.

［5］黃娜娜.柑橘精油抗氧化特性及對(duì)皮膚細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究［D］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

［6］趙旭,劉壽榮,馮仙菊,等.從氧化應(yīng)激談白藜蘆醇對(duì)高尿酸介導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2016,34（5）:1193-1195.

［7］徐俊吉,呂士杰,魏景艷,等.含硒抗體模擬谷胱甘肽過氧化物酶的研究進(jìn)展［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2010,31（4）:220-223.

Oxidation damage protection research of resveratrol on HepG2 cells induced by H2O2*

GAO Yuan*,WANG Yue,ZHAO Ying-ying,WANG Xi,LI Fan,XIAN Yue-tong
（College of Pharmacy,Cell and Molecular Biology Research Institute,Harbin Commercial University,Harbin 150076，China）

In this paper,the oxidation damage protection of resveratrol on HepG2 cells induced by H2O2was studied.HepG2 cells oxidative stress damage model was built by 200μmol·L-1H2O2.Under different concentration of resveratrol（0,5,10,20 and 40μg·mL-1）,the cells of malondialdehyde（MDA）content,superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）activity were determined.The results demonstrated that the effect of resveratrol on HepG2 cells can reduce MDA content increased by H2O2induced damage,and increase the SOD and GSH-Px activities.It suggests that resveratrol has certain protective effects on liver cells oxidative damage induced by H2O2.

resveratrol；superoxide dismutase（SOD）；glutathione peroxidase（GSH-Px）；malondialdehyde（MDA）

TS262

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170616

2017-03-14

哈爾濱商業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃國家級(jí)項(xiàng)目（2016 10240004）資助

高原（1983-），女，講師，2012年畢業(yè)于東北林業(yè)大學(xué)植物學(xué)專業(yè)，博士，研究方向：抗氧化活性作用機(jī)制。