張 博，葉 陽，劉學(xué)偉，張雨薇，黃樹明*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

電針改善去勢(shì)雌性大鼠記憶障礙的機(jī)制研究

張 博1，葉 陽1，劉學(xué)偉2，張雨薇3，黃樹明1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的 觀察電針對(duì)去勢(shì)雌性大鼠記憶、腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及其受體酪氨酸激酶受體B（TrkB）表達(dá)的影響。方法 將SD大鼠36只隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和電針組，每組12只。假手術(shù)組大鼠僅切開皮膚，其余各組大鼠給予卵巢摘除，15 d后，電針組給予電針刺激，隔日1次，持續(xù)45 d。Morris水迷宮測(cè)試各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化法檢測(cè)各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF和TrkB蛋白的表達(dá)。結(jié)果 水迷宮結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.01）。 與模型組比較，電針組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.01）。免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。與模型組相比，電針組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。但各組TrkB表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論 電針改善去勢(shì)雌性大鼠記憶障礙的機(jī)制可能與增加海馬CA1區(qū)BDNF的表達(dá)有關(guān)。

電針；去勢(shì)大鼠；記憶障礙；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

雌激素對(duì)年老女性的認(rèn)知功能具有良好的保護(hù)作用[1]，絕經(jīng)后女性隨著雌激素水平的改變可能出現(xiàn)輕度認(rèn)知障礙[2]。研究顯示針刺可改善低水平雌激素動(dòng)物模型的記憶能力[3]，而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是維持記憶的重要神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過與其受體酪氨酸激酶受體 B（tropomyosin receptor kinase B，TrkB）結(jié)合而影響下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。為探討針刺改善卵巢摘除動(dòng)物記憶障礙的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過Morris水迷宮測(cè)試去勢(shì)雌性大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，采用免疫組化方法檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及其受體TrkB的表達(dá)情況，以期為明確針刺改善低雌激素水平動(dòng)物記憶障礙的機(jī)制和后續(xù)的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組 3月齡SD大鼠，體質(zhì)量190～220 g，36只，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) （許可證號(hào)：SCXK（黑）2008-004）。 隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組、模型組和電針組，每組12只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照科技部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理指南》執(zhí)行，且經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.1 試劑 BDNF 一抗 （博士德，BA0565-1），TrkB一抗 （博士德，BA0623），SABC免疫組化試劑盒（博士德，SA1022）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Morris水迷宮 （安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；KD-TS3D1型生物組織自動(dòng)脫水機(jī) （浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；TB-718型生物組織自動(dòng)包埋機(jī)，R138型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，TK-212型自動(dòng)恒溫漂片儀，TK-213型自動(dòng)恒溫烘片儀 （湖北泰維醫(yī)療科技有限公司）；ECLIPSE 50i顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 給予各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.4 mL/100 g），模型組和電針組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，對(duì)照組僅切開皮膚，術(shù)后予以青霉素8萬U肌注3 d。

1.2.2 取穴及治療 電針組卵巢切除15 d后進(jìn)行電針治療，選取“百會(huì)”、“腎俞”、“后三里”穴[4]。 “百會(huì)”在頂骨正中；“腎俞”在第2腰椎下兩旁；“后三里”在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處。在不麻醉狀態(tài)下，用半寸針灸針刺入穴位，將腎俞和對(duì)側(cè)后三里穴連接電針儀，百會(huì)和濕紗布上的電極（浸生理鹽水的）接正負(fù)極。兩側(cè)穴位交替進(jìn)行電針刺激，百會(huì)穴每次都給予刺激，采用疏密波，強(qiáng)度為4～5 mA，以引起大鼠后肢輕顫為宜，在上午9～10點(diǎn)進(jìn)行電針刺激，每次30 min，隔日1次，持續(xù)治療45 d。

1.2.3 行為學(xué)測(cè)試 采用Morris水迷宮測(cè)試進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。于造模前、治療后分別進(jìn)行測(cè)試。平臺(tái)位于水面下1.5 cm，水溫控制在（24±2） ℃。 造模前對(duì)全部大鼠進(jìn)行篩選，將基礎(chǔ)智力和體力不合格者予以剔除。

（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：水池等分為4個(gè)象限，將平臺(tái)放在第一象限中間，在每個(gè)象限固定一點(diǎn)面向水池池壁將大鼠放入水中，試驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天上午每個(gè)象限各測(cè)試1次，每次測(cè)試90 s。若大鼠在90 s之內(nèi)尚未找到平臺(tái)，則將大鼠引導(dǎo)至平臺(tái)上并使它在平臺(tái)上停留5 s，若大鼠在90 s之內(nèi)找到平臺(tái)，也讓其在平臺(tái)上停留5 s，方結(jié)束一次訓(xùn)練，如此訓(xùn)練5 d。第5天訓(xùn)練時(shí)大鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間記為逃避潛伏期。

（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：第5天訓(xùn)練結(jié)束后，將平臺(tái)移走，2 h后將每組大鼠從固定象限（第二象限）的一點(diǎn)放入水中，記錄每只大鼠在90 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.2.4 免疫組化檢測(cè) 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，將大鼠麻醉后進(jìn)行灌流固定，取腦，浸于4%多聚甲醛中固定24 h后，將固定后的腦矢狀切開后，經(jīng)組織自動(dòng)脫水機(jī)按梯度脫水透明，石蠟包埋成蠟塊，切片4 μm厚，免疫組化SABC法進(jìn)行檢測(cè)。脫蠟、水化；3%H2O2室溫封閉15 min；熱修復(fù)20 min；5%BSA室溫封閉20 min，甩去多余液體，不洗。滴加適當(dāng)稀釋的兔抗 BDNF，TrkB抗原的抗體 （1∶100），37℃孵育90 min；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min；滴加試劑SABC，37℃孵育20 min；以上各步驟間，PBS洗 3次，各 5 min；DAB顯色（鏡下掌握顯色程度），反應(yīng)充分即用PBS終止反應(yīng)；自來水沖洗；脫水、透明、封片、鏡檢。陰性對(duì)照用PBS替代一抗孵育。

將各組切片進(jìn)行拍攝（×200倍），將棕黃色顆粒作為陽性參考，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行累積光密度（IOD）和陽性細(xì)胞面積（Area）分析，根據(jù)公式：平均光密度=IOD/Area計(jì)算BDNF和TrkB的平均光密度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 17.0軟件分析，計(jì)量資料以“±s”表示。多組樣本均數(shù)間差異性檢驗(yàn)用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)去勢(shì)雌性大鼠記憶功能的影響

水迷宮測(cè)試過程中，各組大鼠均有死亡，最后假手術(shù)組、模型組和電針組大鼠分別剩余10只、9只、9只。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.01），表明卵巢摘除導(dǎo)致了大鼠的記憶功能障礙。與模型組比較，電針組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.01），表明電針增強(qiáng)了卵巢摘除大鼠的記憶能力，提示電針可逆轉(zhuǎn)卵巢摘除誘發(fā)的大鼠記憶功能減退，見表1。

表1電針對(duì)去勢(shì)雌性大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 （±s）

表1電針對(duì)去勢(shì)雌性大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組電針組n 10 9 9逃避潛伏期（s）20.52±5.45 30.04±14.05*17.38±7.73＃穿越平臺(tái)次數(shù)（次）4.20±1.03 2.00±0.87**4.11±1.76＃＃

2.2 電針對(duì)去勢(shì)雌性大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及TrkB表達(dá)的影響

BDNF的陽性表達(dá)主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，見圖1。篩選未脫片染色清晰的切片進(jìn)行拍攝和數(shù)據(jù)分析，每組各8張。免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。 與模型組相比，電針組大鼠海馬 CA1 區(qū)BDNF 表達(dá)明顯增加（P＜0.01），提示電針改善了卵巢摘除誘發(fā)的大鼠海馬CA1區(qū)BDNF表達(dá)減少，見表2。

TrkB的陽性表達(dá)主要在細(xì)胞膜，見圖2。與BDNF的表達(dá)改變有所不同，研究結(jié)果顯示，各組大鼠海馬CA1區(qū)TrkB的表達(dá)無明顯改變，模型組與假手術(shù)組比較以及電針組與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

表2電針對(duì)去勢(shì)雌性大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及TrkB表達(dá)的影響 （±s，n=8）

表2電針對(duì)去勢(shì)雌性大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及TrkB表達(dá)的影響 （±s，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組電針組BDNF 0.21±0.02 0.16±0.01**0.24±0.02＃＃TrkB 0.11±0.01 0.12±0.02 0.12±0.02

圖1光鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF表達(dá)（紅色箭頭所示為BDNF陽性表達(dá)，免疫組化×200）

圖2光鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)TrkB表達(dá)（紅色箭頭所示為TrkB陽性表達(dá)，免疫組化×200）

3 討論

近來有報(bào)道指出，去勢(shì)雌性大鼠記憶能力減退[3]，這與本實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)測(cè)試結(jié)果一致，證明卵巢摘除損害了雌性大鼠的記憶功能，可見雌激素具有腦保護(hù)作用[5]。實(shí)驗(yàn)中所采用的卵巢切除方法復(fù)制了絕經(jīng)期女性雌激素的低水平狀態(tài)，這與中醫(yī)學(xué)認(rèn)為的年老者腎虛髓空，腦失濡養(yǎng)相似，結(jié)合中醫(yī)理論“腎通于腦”且“靈機(jī)記性不在心在腦”，在治療上，本實(shí)驗(yàn)選用了以益腎健腦為主的治療原則。腎俞是腎之背俞穴，為補(bǔ)腎要穴，腎為先天之本，所藏腎精的充盛需要后天之精的補(bǔ)充，脾胃為后天之本，氣血化生之源，故取后三里穴以補(bǔ)脾胃，益氣血，達(dá)到補(bǔ)腎的目的。督脈絡(luò)腎，百會(huì)穴位于頭頂正中，屬督脈，其深部即為腦之所在，故取百會(huì)穴以開竅醒神，充盛腎氣。三穴同用共奏補(bǔ)腎健腦之效。

臨床研究證實(shí)電針可改善癡呆患者的認(rèn)知功能[6]，且實(shí)驗(yàn)研究亦顯示，電針減輕了APP/PS1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的認(rèn)知損害[7]，此外，針刺治療的不良反應(yīng)少，可見針刺療法改善記憶的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，針刺腎俞、百會(huì)、后三里穴可改善模型動(dòng)物因卵巢摘除誘發(fā)的記憶障礙。

BDNF是具有維持神經(jīng)元功能，突觸可塑性和神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性的重要內(nèi)源性蛋白[8]，本研究結(jié)果顯示，卵巢摘除導(dǎo)致了大鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)減少，這是因?yàn)槁殉舱档土梭w內(nèi)雌激素水平，而雌激素可以促進(jìn)BDNF的表達(dá)[9]。有報(bào)道指出BDNF通過調(diào)節(jié)突觸可塑性的長時(shí)程增強(qiáng)和膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)而影響學(xué)習(xí)記憶功能，因此提示本實(shí)驗(yàn)中卵巢摘除大鼠記憶功能減退與BDNF表達(dá)降低有關(guān)。近來國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)電針百會(huì)穴可增加腦內(nèi)BDNF的表達(dá)[10]，且磷酸化的TrkB蛋白表達(dá)亦增多[11]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電針增加了去勢(shì)雌性大鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了由卵巢摘除引發(fā)的BDNF表達(dá)減少，說明電針腎俞、百會(huì)和后三里穴通過增加大鼠海馬CA1區(qū)BDNF的表達(dá)而改善了卵巢摘除誘發(fā)的記憶損害。

然而值得一提的是，本實(shí)驗(yàn)未見TrkB受體數(shù)量明顯增多，這可能與實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)蛋白為總的TrkB，而經(jīng)磷酸化的蛋白才具有活性有關(guān)，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，課題組需要通過蛋白免疫印跡雜交法進(jìn)一步明確磷酸化TrkB蛋白的表達(dá)情況。BDNF與特異性受體TrkB結(jié)合后，使TrkB發(fā)生磷酸化，激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）以及有絲分裂原激活蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 （mitogen-activated proteinkinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）等信號(hào)通路，進(jìn)一步發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[12]。因此電針此三組穴位是否是通過激活某一信號(hào)通路達(dá)到改善卵巢摘除誘發(fā)的記憶障礙的目的，還有待實(shí)驗(yàn)的深入研究。

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（本文編輯 匡靜之）

Electroacupuncture Improves Memory Dysfunction in Ovariectomized Rats

ZHANG Bo1,YE Yang1,LIU Xuewei2,ZHANG Yuwei3,HUANG Shuming1*
(1.Institute of Traditional Chinese Medicine,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China;2.Qiqihar Medical University,Qiqihar,Heilongjiang 161006;3.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China)

Objective To observe the effects of electroacupuncture on memory and the expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF)and its receptor tropomyosin receptor kinase B (TrkB)in ovariectomized rats hippocampus.Methods The 36 SD rats were randomly divided into sham-operation group,model group and EA group,12 rats in each group.Rats in sham-operation group were incised skin,while other two groups rats were ovariectomized.15 days after ovariectomy,EA group were treated with electroacupuncture every other day for 45 days.Then memory function was evaluated by Morris water maze test and expression of BDNF and TrkB in hippocampal CA1 area were determined by immunohistochemical staining.Results The results showed that the escape latency prolonged significantly in model group (P＜0.05)and times of passing through the platform decreased significantly (P＜0.01),compared with that of sham group.And both of escape latency and times of passing through the platform were reversed in EA group,compared with that of model group.The immunohistochemical staining showed that expression of BDNF in hippocampal CA1 declined significantly in model group (P＜0.01),compared with that of sham group,while this expression in EA group was increased significantly versus model group (P＜0.01).However,expression of TrkB in each group didn't show any significance (P＞0.05).Conclusion Electroacupuncture could improve memory dysfunction induced by ovariectomy partly due to the increase of expression of BDNF in hippocampal CA1.

electroacupuncture;ovariectomized rats;memory dysfunction;brain-derived neurotrophic factor

R245.9+7

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2017.06.025

本文引用：張 博，葉 陽，劉學(xué)偉，張雨薇，黃樹明，張 博，葉 陽，劉學(xué)偉，張雨薇，黃樹明.電針改善去勢(shì)雌性大鼠記憶障礙的機(jī)制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,37（6）：670-673.

2017-01-22

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81603321）；黑龍江省博士后資助項(xiàng)目（LBH-Z13200）；黑龍江省自然科學(xué)基金（H2016072）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項(xiàng)目（2015bs04）。

張 博，女，中醫(yī)學(xué)博士后，助理研究員，研究方向：中醫(yī)藥防治老年性癡呆。

* 黃樹明，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：hljzyyzb@sina.cn。