馬小明+攔生發(fā)+張瑋+李慧+魏學(xué)濤

摘 要 采集三種校園植物凋落葉并制備浸提液，按比例配成混合液，處理土壤，然后通過平板涂布法在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)、篩選并統(tǒng)計(jì)自生固氮菌菌落數(shù)，從而反映不同植物凋落葉浸提液及不同組合浸提液對(duì)自生固氮菌生長的影響。得出不同葉片浸提液組合后促進(jìn)固氮菌生長的效果好于單一葉片浸提液的作用，且種類越多促進(jìn)作用越明顯。鑒于此，建議學(xué)校在綠化建設(shè)不影響美觀情況，選擇多種植物混合搭配種植。

關(guān)鍵詞 植物凋落葉 浸提液 自身固氮菌 校園綠化

中圖分類號(hào) Q-33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

1 實(shí)驗(yàn)背景

“綠化”是近些年新校園建設(shè)中很重要的一個(gè)項(xiàng)目。筆者所任教的學(xué)校在新校區(qū)的建設(shè)中為了秉承校園文化精神，提升校園文化品位，打造甘肅最美校園，建設(shè)了多個(gè)花壇。但花壇中種植的植物品種單一，主要以紫葉小檗和小葉女貞為主，穿插月季，但長勢不佳。新校區(qū)土質(zhì)不肥，若過一兩年葉落歸根，土質(zhì)得到改善可以，到時(shí)植物長勢會(huì)更好。因?yàn)槿~片中的有機(jī)質(zhì)經(jīng)微生物分解為無機(jī)物，根系可以吸收再利用，同時(shí)也滋養(yǎng)了微生物群的發(fā)展壯大，使土壤更加肥沃。鑒于此，結(jié)合生物選修教材中“驗(yàn)證細(xì)菌分布的廣泛性”“學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)基本技術(shù)”“某種微生物數(shù)量的測定”以及“微生物在其他方面的應(yīng)用”，展開植物葉片浸出液對(duì)土壤微生物影響的研究。但土壤中微生物種類繁多、數(shù)量龐大，分離鑒定工作難以完成，所以只研究自身固氮菌。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

初步研究小葉女貞、紫葉小檗、月季三種凋落葉浸提液對(duì)自生固氮菌生長的影響；

初步學(xué)會(huì)微生物培養(yǎng)、分離、鑒定技術(shù)；

通過開展此實(shí)驗(yàn)，使所學(xué)的書本知識(shí)在生物科技活動(dòng)中得以應(yīng)用；

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論，對(duì)校園綠化建設(shè)提供可行性建議。

3 實(shí)驗(yàn)原理

不同植物的凋落葉所含成分有所不同，對(duì)微生物生長的影響可能不同。自身固氮菌可以從空氣中吸收氮?dú)?，并將其轉(zhuǎn)化為氨加以利用。固氮原理為：N2+8H++16Mg-ATP+16H2O+8e-→2NH3+H2+16Mg-ADP+16Pi。該反應(yīng)在固氮酶參與下完成。所以，利用植物自身固氮菌可以固氮的特性，采用無氮源的人工合成培養(yǎng)基（阿須貝培養(yǎng)基）培養(yǎng)和篩選出自生固氮菌，測定菌落數(shù)目變化，分析不同植物凋落葉浸提液對(duì)自生固氮菌生長、繁殖的影響。

4 實(shí)驗(yàn)材料及用具

材料：三種植物凋落葉（小葉女貞、紫葉小檗、月季）、校園花壇內(nèi)土壤。

器具：無菌室及超凈工作臺(tái)（臨夏州農(nóng)科院蠶豆中心提供）、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫箱、酒精燈、燒杯、三腳架、石棉網(wǎng)、量筒、天平、電子天平、鐵架臺(tái)、玻璃棒、漏斗、放大鏡、培養(yǎng)皿、試管、吸管、錐形瓶、涂布棒、土壤篩、烘干箱等。

耗材：標(biāo)簽紙、紗布、牛皮紙、記號(hào)筆、棉花、報(bào)紙等。

固氮菌分離培養(yǎng)基（阿須貝培養(yǎng)基）配方：葡萄糖10 g；NaCl 0.2 g；KH2PO4 0.2 g；CaSO4·2H2O 0.1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCO3 5 g；瓊脂 20g；水1 000 mL；pH7.0。

5 實(shí)驗(yàn)步驟

5.1 校園小葉女貞、紫葉小檗、月季等植物落葉浸提液制備

（1） 分別收集三種植物落葉，風(fēng)干，用蒸餾水沖洗去除葉片表面塵土污漬，用酒精進(jìn)行葉片表面消毒；

（2） 按照表1將不同葉片放入潔凈錐形瓶，用蒸餾水浸泡72 h，得到3種凋落葉浸提液原液。

（3） 用細(xì)菌過濾器過濾浸提液原液，既不破壞生長因子、又防止雜菌污染。

（4） 將3種浸提液按表2中比例制備系列浸提液樣液。

以上（1）～（4）步驟均在無菌室中完成。

5.2 土壤獲取及處理

（1） 取土壤，除去表層落葉及其他雜物，采集5～10 cm深處的土樣，裝入塑料袋中，并標(biāo)注采集的地點(diǎn)、時(shí)間等。為了防止土壤中微生物數(shù)量和種類發(fā)生變化，把土樣暫放在冰箱中保存。

（2） 過1 mm土壤篩，稱取30 g土壤，用烘干法計(jì)算土壤濕度。土壤濕度（重量%）=（原土重-烘干土重）/烘干土重×100%=（30.00 g-23.78 g）/23.78 g×100%=26.16%。

（3） 稱取土壤8份，每份20 g，分別置于培養(yǎng)皿（標(biāo)號(hào)依次為A～H）中，分別用A～H浸出液樣液噴灑處理（5 mL/10 g）。在相同條件下，培養(yǎng)已處理土壤2 d。

（4） 分別取已處理的3 g土壤，置于錐形瓶，加蒸餾水200 mL，充分?jǐn)嚢?，得菌懸?份（標(biāo)號(hào)依次為A～H）。將每份菌懸液均依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，備用（注意做好標(biāo)記）。

5.3 倒平板

（1） 按照培養(yǎng)基配方配置培養(yǎng)基，用高壓蒸汽滅菌鍋在120℃條件下滅菌20 min。

（2） 倒平板。每個(gè)培養(yǎng)皿倒培養(yǎng)基15 mL左右，室溫放置至其凝固。

5.4 平板涂布并培養(yǎng)

（1） 選取細(xì)菌懸液10-4、10-5、10-6倍的稀釋液。

（2） 用注射器吸取稀釋液0.2 mL，注入平板上，涂布棒快速涂布均勻。培養(yǎng)皿倒置（注意做好標(biāo)記）；每種稀釋液做3個(gè)重復(fù)。

（3） 留下3個(gè)培養(yǎng)皿做空白對(duì)照（以反映培養(yǎng)基是否被污染）。

（4） 所有培養(yǎng)皿置于35℃恒溫箱保溫培養(yǎng)，48 h后觀察計(jì)數(shù)。

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察各稀釋度下培養(yǎng)皿中菌落生長狀況，發(fā)現(xiàn)在10-5、10-6稀釋度時(shí)，培養(yǎng)皿中菌落數(shù)太少，甚至沒有菌落形成，故選擇10-4稀釋度下的培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)樣本，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表3。

利用表3中平均值計(jì)算每毫升菌懸液原液中自身固氮菌數(shù)量，并繪制成柱狀圖，結(jié)果如圖1所示。

計(jì)算公式為：每毫升菌懸液原液中細(xì)菌數(shù)量=平均值×104×5。

7 實(shí)驗(yàn)結(jié)論及建議

由以上結(jié)果可以得出：（1） 不同凋落葉浸出液對(duì)自身固氮菌生長都具有促進(jìn)作用，但促進(jìn)作用不同，C組促進(jìn)作用最大，B組最小。（2） 不同凋落葉浸出液組合后促進(jìn)作用較單一落葉浸出液促進(jìn)作用明顯，且葉片種類越多促進(jìn)作用越明顯，G組的促進(jìn)作用>E組/F組/D組。

鑒于以上結(jié)論，建議選擇校園綠化植物時(shí)，種類不能太單一，在保證美觀基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能選用多種植物合理混搭種植。這樣有利于一些土壤微生物的生長，而土壤微生物的生長又可改善土質(zhì)，反過來為植物的生長提供更好的環(huán)境，使其進(jìn)入良性循環(huán)。

參考文獻(xiàn)：

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