劉穎 姜黎 王江維 沈政偉

·實(shí)驗(yàn)研究·

角膜交聯(lián)術(shù)對(duì)酶消化抑制作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

劉穎 姜黎 王江維 沈政偉

目的 通過觀察常規(guī)交聯(lián)術(shù)后兔眼角膜組織在酶溶液中的變化，評(píng)估交聯(lián)術(shù)對(duì)角膜耐酶性的影響。方法 實(shí)驗(yàn)研究。將27只日本大耳白兔隨機(jī)分成3組(胃蛋白酶組、胰蛋白酶組、膠原蛋白酶組)，每組9只，雙眼均去上皮，核黃素-右旋糖酐溶液滴眼3min/次，持續(xù)30min，滴10次。隨機(jī)取一眼為實(shí)驗(yàn)組，另一眼為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組兔眼用自研角膜交聯(lián)機(jī)照射30min，對(duì)照組不照射，照射過程中每3min雙眼都用右旋糖酐-核黃素溶液及眼表麻藥沖洗1次結(jié)膜表面，之后立即處死兔子取雙眼角膜，并置于配好的3種對(duì)應(yīng)酶溶液中，每組隨機(jī)選3只觀察并記錄每組角膜完全消化的時(shí)間及過程。剩下18只兔的眼角膜隨機(jī)分成3組，每組6只，分別在消化的第1、3、6天隨機(jī)取出兩只兔子剩余的角膜組織作光鏡觀察(HE染色)。結(jié)果 每組角膜組織的溶解時(shí)間實(shí)驗(yàn)組均長(zhǎng)于對(duì)照組，其中胰蛋白酶組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從角膜形態(tài)變化來看，實(shí)驗(yàn)組發(fā)生形變的過程均慢于對(duì)照組。從光鏡觀察(HE染色)的結(jié)果來看實(shí)驗(yàn)組角膜組織發(fā)生裂解的速度亦明顯慢于對(duì)照組。結(jié)論 角膜交聯(lián)術(shù)能使角膜結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定、牢固，從而增強(qiáng)其耐酶性。

角膜交聯(lián)術(shù)；酶；消化；抑制

[臨床眼科雜志，2017，25：165]

[J Clin Ophthalmol,2017,25:165]

紫外光核黃素角膜膠原交聯(lián)術(shù)(corneal collagen cross- linking, CXL)是近十余年來應(yīng)用于臨床的新型角膜成形技術(shù)。其運(yùn)用的是光氧化反應(yīng)原理：當(dāng)光敏劑核黃素(維生素B2)在角膜基質(zhì)層達(dá)到飽和狀態(tài)后,在370 nm波長(zhǎng)紫外光照射下，被激發(fā)到三線態(tài)，產(chǎn)生以單線態(tài)氧為主的活性氧自由基(reactive oxide species,ROS)，ROS處于不穩(wěn)定狀態(tài)，直到誘導(dǎo)角膜基質(zhì)膠原纖維間形成新的共價(jià)鍵后才轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定形式，從而使角膜生物力學(xué)增強(qiáng)，結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定、牢固。目前，CXL在臨床上主要應(yīng)用于圓錐角膜、術(shù)后角膜擴(kuò)張等疾病的治療，效果較好。

有研究顯示CXL在某些難治性角膜潰瘍的治療方面亦取得了可喜的成果[1-3]，但其作用機(jī)制尚未完全明確，原因之一可能是交聯(lián)后的角膜生物力學(xué)增強(qiáng)，角膜變厚、變硬，從而對(duì)酶解作用的抵抗能力增強(qiáng)。角膜中含有多種酶，當(dāng)潰瘍發(fā)生時(shí)，酶的種類及數(shù)量增多，從而促進(jìn)角膜溶解[4]。本實(shí)驗(yàn)將從胃蛋白酶、胰蛋白酶及膠原蛋白酶這3種酶對(duì)交聯(lián)后的兔眼角膜的消化情況來驗(yàn)證上述機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7周齡清潔級(jí)日本大耳白兔27只，排除眼部及全身疾病，雌雄不限，體重2 kg左右，購于武漢萬千佳興生物科技有限公司，合格證號(hào)：No.42010000000898。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循國(guó)家科委頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

二、實(shí)驗(yàn)試劑及配制

核黃素磷酸鈉注射液(益然，江西制藥有限責(zé)任公司)，右旋糖酐40葡萄糖注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶(MDL生物科技有限公司)，生理鹽水，PBS緩沖液，HCL(pH約為1.5)(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)。

核黃素-右旋糖酐溶液，將核黃素磷酸鈉注射液與右旋糖酐40葡萄糖注射液按1:4的比例混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；胃蛋白酶溶液，取1 g胃蛋白酶溶于10 ml HCL溶液中，現(xiàn)配現(xiàn)用；胰蛋白酶溶液，取1g胰蛋白酶溶于10ml PBS緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用；膠原蛋白酶溶液：取1 g膠原蛋白酶溶于50 ml PBS緩沖液中，分成5等份，放入-40 ℃冷凍室內(nèi)儲(chǔ)存，用之前取出室溫融化。

三、實(shí)驗(yàn)儀器

自研角膜交聯(lián)機(jī)(華中科技大學(xué)光學(xué)與電子信息學(xué)院研制)[5](圖1),手術(shù)器械(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院眼科準(zhǔn)分子激光中心提供),Leica光學(xué)顯微鏡(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)。

圖1 自研角膜交聯(lián)機(jī)

四、方法

首先將27只日本大耳白兔按照酶的種類(胃蛋白酶、胰蛋白酶及膠原蛋白酶)隨機(jī)分成3組(每組9只)，用10%水合氯醛溶液進(jìn)行全身麻醉(2.5 ml/kg),待兔子麻醉后，去除雙眼角膜中央直徑為9 mm區(qū)域的上皮，將配好的右旋糖酐-核黃素溶液滴加到角膜表面，3 min/次，持續(xù)30 min，滴10次。隨機(jī)取一眼為實(shí)驗(yàn)組，再用角膜交聯(lián)機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)組眼睛照射30 min(波長(zhǎng)為370±5 nm，功率為3 mW/cm2)，照射時(shí)注意保持光源對(duì)準(zhǔn)角膜中央，兔眼與透鏡的距離在45 mm以內(nèi)。在照射過程中，每3 min雙眼都用右旋糖酐-核黃素溶液及眼表麻藥沖洗一次結(jié)膜表面。照射結(jié)束后，立即用空氣栓塞法將兔子處死取雙眼角膜(胰蛋白酶組隨機(jī)選3只兔的眼角膜放入沸水中加熱10 min，用于觀察角膜組織消化天數(shù))，泡入配好的酶溶液中，并置于酶的最適溫度，觀察。除胰蛋白酶組外，胃蛋白酶組及膠原蛋白酶組也隨機(jī)取3只兔的角膜不做處理，觀察其形態(tài)變化直到組織被完全消化，并記錄消化完成時(shí)間；每組剩余6只兔的角膜剩余組織在術(shù)后第1、3、6天各隨機(jī)選2只取出切片，再進(jìn)行光鏡(HE染色)觀察。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)每組中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組角膜消化時(shí)間進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兔眼角膜組織完全消化時(shí)間

3組兔眼角膜交聯(lián)術(shù)均順利完成。胃蛋白酶組：角膜消化時(shí)間實(shí)驗(yàn)組分別為66d、65d、59d，平均(63.33±2.19)d；對(duì)照組分別為61d、59d、52d，平均(57.33±2.73)d，實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.72,P=0.16)。胰蛋白酶組：角膜消化時(shí)間實(shí)驗(yàn)組分別為4d、4d、4d，平均4.00d；對(duì)照組分別為3d、3d、2d，平均為(2.67±0.33)d，實(shí)驗(yàn)組明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(t=4.00,P=0.02)。膠原蛋白酶組：角膜消化時(shí)間實(shí)驗(yàn)組分別為7d、3d、5d，平均(5±1.15)d；對(duì)照組分別為2d、2d、2d，平均2.00d，實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.73,P=0.16)(表1)。

圖9 光鏡下胰蛋白酶1d對(duì)照組(HE×200) 圖10 光鏡下胰蛋白酶3d實(shí)驗(yàn)組(HE×200) 圖11 光鏡下胰蛋白酶3d對(duì)照組(HE×200) 圖12 光鏡下胰蛋白酶6d實(shí)驗(yàn)組(HE×200) 圖13 光鏡下胰蛋白酶6d對(duì)照組(HE×200) 圖14 光鏡下膠原蛋白酶1d實(shí)驗(yàn)組(HE×200) 圖15 光鏡下膠原蛋白酶1d對(duì)照組(HE×200) 圖16 光鏡下膠原蛋白酶3d實(shí)驗(yàn)組(HE×200) 圖17 光鏡下膠原蛋白酶3d對(duì)照組(HE×200) 圖18 光鏡下膠原蛋白酶6d實(shí)驗(yàn)組(HE×200) 圖19 光鏡下膠原蛋白酶6d對(duì)照組(HE×200)

表1 各組角膜完全消化的時(shí)間(d)

二、兔眼角膜消化過程形態(tài)變化

角膜放入胃蛋白酶溶液后，在最初的十幾天里逐漸皺縮、變薄，20d左右時(shí)出現(xiàn)裂孔，繼而破裂成絲狀最后消失，實(shí)驗(yàn)組變化均明顯慢于對(duì)照組。胰蛋白酶組的角膜經(jīng)沸水浴后明顯腫脹，在溶液中1d即可轉(zhuǎn)變?yōu)樗槟睿?d左右消失，實(shí)驗(yàn)組的變化稍慢于對(duì)照組。膠原酶組實(shí)驗(yàn)組變化稍慢，在最初幾天還能觀察到完整角膜組織，而對(duì)照組角膜組織在酶溶液中很快裂解，然后消失。

三、兔眼角膜的光鏡(HE染色)結(jié)果

胃蛋白酶組：消化1d后取出的角膜組織示，實(shí)驗(yàn)組角膜膠原纖維較腫脹，排列較稀疏，中外1/3層膠原染色顏色明顯深于內(nèi)層，細(xì)胞稍腫脹，胞核清晰可見；對(duì)照組角膜膠原纖維排列疏松，間距明顯增寬，染色較均勻，細(xì)胞腫脹，未見明顯細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組膠原纖維間距明顯要小，排列也更為致密(圖2,3)。第3天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組角膜膠原纖維腫脹較嚴(yán)重，細(xì)胞核形態(tài)變大，密度降低；對(duì)照組角膜膠原纖維明顯腫脹，間距消失。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組纖維排列更為致密(圖4,5)。消化6d后組織染色示，與前兩次比較，兩組膠原纖維排列更為稀疏，膠原顏色均明顯變淺，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組深(圖6,7)。

胰蛋白酶組：消化1d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組組織著色較深，纖維間隙增寬，均可見胞質(zhì)變性，胞核腫脹及空泡變性，對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組變化更明顯，實(shí)驗(yàn)組炎細(xì)胞侵潤(rùn)更甚(圖8,9)。隨著觀察時(shí)間變化，組織著色逐漸變淺，膠原纖維間距逐漸增寬，胞核逐漸減少，且對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組變化更為明顯(圖10～13)。

膠原蛋白酶組：消化1d后取出的角膜組織示，實(shí)驗(yàn)組膠原纖維間距明顯增大，胞核清晰可見；對(duì)照組膠原纖維間距增大，但小于實(shí)驗(yàn)組，腫脹較實(shí)驗(yàn)組更重，胞核可見(圖14,15)。消化3d后的角膜組織示，膠原纖維間距較之前明顯增大，細(xì)胞核減少，密度降低，實(shí)驗(yàn)組纖維組織較對(duì)照組排列更整齊、致密(圖16,17)。第6天組織示，兩組染色均變淺，膠原排列稀疏(圖18,19)。

討 論

據(jù)WHO數(shù)據(jù)，角膜病已成為全球第四大致盲疾病，約占5.1%，并且其中有一部分人是可以通過角膜移植手術(shù)重獲光明的。就目前我國(guó)眼庫(eyebank)現(xiàn)狀來看，角膜移植術(shù)情況不容樂觀，因此找到能夠阻止角膜病的進(jìn)展甚至替代角膜移植術(shù)的手段就顯得尤為重要。

正常人眼角膜的細(xì)胞外基質(zhì)大部分為膠原纖維，當(dāng)角膜發(fā)生炎癥時(shí)，不僅微生物，宿主中的各種細(xì)胞也能合成和分泌多種酶類，從而對(duì)組織產(chǎn)生破壞，其中已經(jīng)明確的有膠原酶及多種蛋白酶[6]。有研究表明，上皮能調(diào)節(jié)角膜細(xì)胞分泌膠原酶，并將角膜或多形核細(xì)胞釋放的潛酶激活，同時(shí)受傷的上皮還能釋放促炎性反應(yīng)因子，使多形核細(xì)胞的數(shù)量變多，從而導(dǎo)致了角膜基質(zhì)潰瘍的產(chǎn)生[7]。胰蛋白酶能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分解，并且專一地從蛋白質(zhì)上除去帶正電荷的氨基酸，從而使組織細(xì)胞排列松散[8]，現(xiàn)已成為體外消化、培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的重要試劑之一。因此本實(shí)驗(yàn)選擇胃蛋白酶、胰蛋白酶及膠原酶來消化角膜組織。通過兔眼角膜組織被完全消化的時(shí)間可以看出經(jīng)過交聯(lián)后的兔眼角膜的消化時(shí)間均長(zhǎng)于未交聯(lián)角膜，且胰蛋白酶組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另兩組可能是由于樣本數(shù)量過少，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量再展開進(jìn)一步試驗(yàn)。Spoerl等[9]使用豬眼角膜分別在上述三種酶作用下，結(jié)果交聯(lián)角膜在第13、14、5天時(shí)被溶解，未交聯(lián)角膜分別在第6、6、2天時(shí)溶解，交聯(lián)角膜溶解時(shí)間均長(zhǎng)于對(duì)照組，這與本研究結(jié)果一致。從肉眼觀察的角膜形態(tài)變化來看，對(duì)照組發(fā)生皺縮、變薄、裂孔甚至破碎的速度均較實(shí)驗(yàn)組更慢。

光鏡結(jié)果則更為形象、明確，隨著角膜組織在酶溶液中逐漸被消化，纖維間距逐漸增寬，膠原染色逐漸變淺。各組角膜組織在不同的時(shí)間點(diǎn)均可觀察到實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組組織排列更為致密，著色也更深，說明實(shí)驗(yàn)組的消化速度較對(duì)照組要更慢。胃蛋白酶組在消化1天后取出的角膜組織染色示，中外1/3層顏色明顯深于內(nèi)層，與之前研究的交聯(lián)角膜的基質(zhì)層300μm處有明顯分界限的結(jié)果一致[10]。這都說明交聯(lián)術(shù)能增強(qiáng)角膜組織的生物力學(xué)特性，使其結(jié)構(gòu)更加牢固穩(wěn)定，從而提高了角膜抵抗酶消化作用的能力。

目前，國(guó)內(nèi)外很多研究都證實(shí)交聯(lián)術(shù)可增強(qiáng)角膜的機(jī)械強(qiáng)度[11]，但抗酶解力的相關(guān)研究并不多，其具體作用機(jī)制更有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了角膜交聯(lián)術(shù)對(duì)抗酶解作用的效果，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量及檢測(cè)方法進(jìn)行更為豐富系統(tǒng)的研究，以期能有更多的收獲，從而更加了解角膜交聯(lián)術(shù)，未來能更好的為角膜病患提供幫助。

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(收稿：2016-08-22)

Rabbit corneal tissue resistant to in vitro enzymatic digestion after corneal collagen cross-linking

LiuYing,JiangLi,WangJiangwei,ShenZhengwei.

DepartmentofOphthalmology,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryRegion,Wuhan,Hubei430070,China

Objective To assess the effects of corneal cross-linking in rabbit cornea on its resistance to in vitro enzymatic digestion. Methods Twenty-seven Japanese white rabbits were randomly divided into three groups to be treated with different enzymes (pepsin, trypsin, collagenase). Each group had nine rabbits. Rabbit corneal epithelium was scraped. Riboflavin-dextran solution was topically administrated every three minutes for half an hour1(i.e, 10 times in total). Then one eye (randomly selected for each animal) was exposed to UV-LED irradiator for 30 minutes. Both eyes were rinsed by dextran-riboflavin and ocular surface anesthetic every 3 minutes during irradiation. Corneas were immediately taken after the rabbits were sacrificed and placed in different enzyme solutions. Time and process until the corneas had been completely digested were recorded. Another 18 Japanese white rabbits served as control. Corneal tissues were put into enzyme solutions without pre-treatment with UV-LED irradiation. Results It took more time to completely digest the cornea tissue from experimental animals, especially by Trypsin (P<0.05).Cornealdeformationoccurssignificantlyslower.Lightmicroscopyhistologyshowedthatthecleavagerateofexperimentalcornealtissuewassignificantlyslower. Conclusions Corneal cross-linking makes cornea’s structure more stable and firmer, thereby enhancing its resistance to enzymatic digestion.

Corneal collagen cross-linking; Enzyme; Digestion; Resistance

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.02.021

武漢市科技攻關(guān)計(jì)劃(No.201161038346)

430070 武漢，廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院眼科

沈政偉(Email:sheneye@qq.com)