劉敏，潘紅梅，吳志霜，王松梅，馮月梅，殷建忠，吳少雄

（昆明醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品科學系，昆明650500）

副干酪乳桿菌水牛奶酸奶品質(zhì)及其通便功能的評價

劉敏，潘紅梅，吳志霜，王松梅，馮月梅，殷建忠，吳少雄

（昆明醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品科學系，昆明650500）

研究了含副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S的水牛奶酸奶品質(zhì)及其潤腸通便作用。實驗對副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵的水牛奶酸奶在1、7、14、21 d的發(fā)酵過程中的活菌數(shù)、pH值、酸度、黏度、持水力、感官指標等分別進行測定，將其與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵的水牛奶酸奶進行對比分析，探究了LYO 50 DCU-S是否可作為附屬發(fā)酵劑應(yīng)用到水牛奶酸奶生產(chǎn)中。將昆明種雄性小鼠分為空白組、模型組、對照組和3個副干酪乳桿菌給藥組。使用復(fù)方地芬諾酯建立小鼠便秘模型，副干酪乳桿菌水牛奶酸奶給藥7 d后，便秘小鼠首次排便時間縮短;連續(xù)15 d灌胃副干酪乳桿菌水牛奶酸奶后,便秘小鼠墨汁推進率顯著增加。結(jié)果表明，將副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S作為附屬菌應(yīng)用到水牛奶酸奶生產(chǎn)中具有可行性,副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S可顯著改善水牛奶酸奶的潤腸通便功能。

副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S；發(fā)酵劑；通便

0 引言

水牛奶是制作奶制品的良好來源，在水牛奶的產(chǎn)品加工中，以酸奶的加工最具價值。副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei,LP）是益生菌中干酪乳桿菌(Lac?tobacillus casei)的一個亞種，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等生理功能[1-3]。它在腸道中通過代謝產(chǎn)生的乳酸，能有效抑制有害細菌的生長和繁殖，維持腸道的生態(tài)平衡和正常機能[4]；并能增加腸道的蠕動，具有潤腸通便的作用[5]。由于其對宿主顯著的益生功效，成為人們研究、開發(fā)和生產(chǎn)的焦點[6]。我國對副干酪乳桿菌水牛奶酸奶的開發(fā)研究尚未見報導(dǎo)。本研究利用副干酪乳桿菌與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵制備成水牛奶酸奶，通過建立便秘小鼠模型評價其潤腸通便功能，為益生菌酸奶通便作用的研究評價提供參考依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料

菌株與牛乳：副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)和保加利亞乳桿菌(L.Bulgari?cus)，水牛奶。

實驗動物：昆明種雄性小鼠60只，7周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級。

培養(yǎng)基：MC（Modified Chalmers）培養(yǎng)基，MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基，MRS（Man Rogosa Sharpe）甘露醇瓊脂培養(yǎng)基。

復(fù)方地芬諾酯片，活性碳粉，阿拉伯樹膠粉。

1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌器，臺式冷凍高速離心機，EL20數(shù)顯pH計，NDJ-1旋轉(zhuǎn)粘度計，隔水式培養(yǎng)箱，電子天平。

1.3 方法

1.3.1 水牛奶酸奶的制備

發(fā)酵劑制備：稱取LYO 50 DCU-S，YO-MIX凍干發(fā)酵劑各1 g，分別投放于99 mL的滅菌脫脂乳中，搖勻，制成菌含量為1%的接種菌液[7]。

水牛奶全脂乳預(yù)熱至60～75℃，40 MPa下均質(zhì)，95℃殺菌5 min，冷卻至42℃，接入發(fā)酵劑，分裝壓膜，于42℃下發(fā)酵至pH值達到4.5時停止發(fā)酵，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中冷藏[8]。各發(fā)酵劑添加量的百分比以水牛奶全脂乳為基礎(chǔ)計量，發(fā)酵劑接種情況如表1所示。

表1 發(fā)酵劑接種情況

1.3.2 水牛奶酸奶的微生物、理化及感官指標

分別在水牛奶酸奶樣品冷藏期的第1，7，14，21 d取樣，進行微生物和理化指標的測定；感官指標在水牛奶酸奶樣品冷藏1 d后進行評定。

（1）微生物指標。采用涂布平板計數(shù)法測定微生物指標[9]，此處的微生物指標測定主要測定酸奶中的乳酸菌活菌數(shù)。取25 g(mL)酸奶樣品，加入225 mL無菌生理鹽水，10倍系列稀釋，選擇2～3個適宜稀釋度，各以0.1 mL加入到MRS、MC、MRS甘露醇平板進行涂布。MRS平板厭氧培養(yǎng)總?cè)樗峋琈RS甘露醇平板和MC平板分別需氧培養(yǎng)副干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌，培養(yǎng)溫度36±1℃，培養(yǎng)時間48 h±2 h后，分別記各菌株的活菌數(shù)。乳酸菌總數(shù)減去嗜熱鏈球菌與副干酪乳桿菌計數(shù)之和，即為保加利亞乳桿菌計數(shù)。

（2）理化指標

①pH值與滴定酸度測定。采用GB5413.34—2010的方法測定滴定酸度。數(shù)顯pH計直接測定水牛奶酸奶樣品的pH值。

②持水力。菌株持水力采用KEOGH[10]等研究方法。取水牛奶酸奶樣品15 mL，離心（3 000 r/min，4℃，20 min）。收集上清液稱重。按下列公式計算：

持水能力=（上清液質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100%。

③自發(fā)乳清析出情況。水牛奶酸奶自4℃冰箱取出后，稱酸奶質(zhì)量（W1），而后將酸奶杯傾斜45°（10 s）內(nèi)吸出表面的乳清，再稱取酸奶的質(zhì)量（W2）。酸奶杯與膜質(zhì)量記為W0。自發(fā)乳清析出=（W1-W2）/（W1-W0）。

④黏度。將水牛奶酸奶樣品于室溫(25℃)下回復(fù)一段時間，用玻璃棒順時針、逆時針各攪拌20下，使酸奶樣品均勻，選用4號轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速100 r/min，測試時間20-30 s，待指針趨于穩(wěn)定可進行讀數(shù)，讀數(shù)乘上系數(shù)表上的特定系數(shù)即為酸奶黏度。

（3）感官指標評定。由本實驗室成員15人組成感官評定小組，并對評定小組成員進行感官分析方法的培訓(xùn)。評分標準采用百分制[11]。對酸奶樣品的氣味、口感、表觀、以及粘稠度進行打分。評定標準參照表2所示。

表2 酸奶感官評定標準

1.3.3 動物實驗

1.3.3.1 樣品及溶液的制備

發(fā)酵乳凍干粉的制備：采用1.3.1的方法制備發(fā)酵乳。用凍干機將其水分抽干，制成發(fā)酵乳凍干粉。

墨汁的制備：準確稱取阿拉伯樹膠100 g，加水800 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性炭(粉狀)50 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后加水至1 000 mL，于4℃冰箱中保存，用前搖勻。

復(fù)方地芬諾酯混懸液（0.05 g/100 mL及0.025 g/ 100 mL）的配制：復(fù)方地芬諾酯片，每片含復(fù)方地芬諾酯2.5 mg，分別取20片（0.05 g/100 mL）、10片（0.025 g/100 mL）用研缽研碎呈粉末后加水至50 mL，臨用前配制。

1.3.3.2 實驗動物分組及處理

所有小鼠按體重進行隨機分組。LYO 50 DCU-S發(fā)酵乳的給予劑量設(shè)定為3個組，每人（按60 kg體質(zhì)量計）每日200 mL，相當于3.3 mL/（dkg），分別按人體推薦攝入量的5倍、10倍、30倍設(shè)計低、中、高三個劑量組，每天一次經(jīng)口灌胃小鼠。另設(shè)空白對照組、模型對照組和普通發(fā)酵乳對照組。

實驗前所有組別小鼠自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按以下方式喂養(yǎng)：①空白對照組和模型對照組，均經(jīng)口灌胃生理鹽水；②普通發(fā)酵乳對照組，經(jīng)口灌胃普通發(fā)酵乳；③低劑量組，經(jīng)口灌胃低劑量含LYO 50 DCU-S發(fā)酵乳；④中劑量組，經(jīng)口灌胃中劑量含LYO 50 DCU-S發(fā)酵乳；⑤高劑量組，經(jīng)口灌胃高劑量含LYO 50 DCU-S發(fā)酵乳。小鼠每天上午喂食，動物體重每周記錄一次。

1.3.3.3 小鼠排便實驗[12]

給受試樣品7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組、普通發(fā)酵乳對照組和3個劑量組小鼠灌胃給予復(fù)方地芬諾酯（10 mg/kg），空白組給予生理鹽水。低、中、高劑量組及普通發(fā)酵乳對照組與墨汁等體積混合，給予復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，空白組和模型對照組小鼠灌胃墨汁2 mL/kg,低、中、高劑量組及普通發(fā)酵乳對照組分別給予含受試樣品的墨汁2 mL/kg，動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進食。從灌胃墨汁開始，記錄每只動物首次排黑便時間。

1.3.3.4 小腸推進實驗[12]

給受試樣品15 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組、普通發(fā)酵乳對照組和3個劑量組小鼠給予復(fù)方地芬諾酯（5 mg/kg），空白組給予生理鹽水。給復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，低、中、高劑量組及普通發(fā)酵乳對照組分別給予含受試樣品的墨汁2 mL/kg（樣品劑量同1.3.3.3節(jié)小鼠排便實驗），其他對照組灌胃2 mL/kg。25 min后用頸椎脫臼法處死小鼠。打開腹腔分離腸系膜，剪去上端自幽門，下端至回盲腸部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”。按下式計算墨汁推進率：

墨汁推進率=墨汁推進長度(cm)/小腸總長度(cm)×100%。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，墨汁推進率需進行數(shù)據(jù)變換[6]。x=sin-1x式中：x為墨汁推進率，結(jié)果用百分數(shù)表示。在進行方差分析時，需先進行方差齊性檢驗，方差齊后，計算F值，F(xiàn)值＜F0.05，則各實驗組均數(shù)間不存在顯著差異；若F值≥F0.05，P≤0.05，表明各組均數(shù)之間存在顯著性差異；組間差異比較采用t檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物指標

兩種酸奶樣品在1，7，14，21 d活菌數(shù)檢測，結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，經(jīng)4℃冷藏21 d后，樣品1中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)與樣品2相比差異不顯著(P＞0.05)，表明在酸奶中添加副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S對商業(yè)發(fā)酵劑中的菌株生長無影響。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S的活菌數(shù)隨冷藏時間的延長而逐漸增加，在14 d時達到最大值7.65 mL-1（對數(shù)值），隨后出現(xiàn)降低，在21 d時為7.54。表明此菌株在酸乳冷藏期間存活能力較強。

表3 水牛奶酸奶在冷藏期間的活菌數(shù)(x±s,n=3)

2.2 理化指標

2.2.1 pH值和酸度

由圖1和圖2可以看出，4℃冷藏21 d期間，兩種水牛奶酸奶樣品的pH值隨儲存時間的延長而逐漸降低，而滴定酸度逐漸增高。添加了L.paracasei LYO 50 DCU-S的酸奶樣品中，其pH值和滴定酸度與商業(yè)發(fā)酵菌株酸乳相比在冷藏期間的差異不顯著(P＞0.05)，可能是由于酸奶樣品發(fā)酵時間較短(5 h)，L.paracasei LYO 50 DCU-S在乳中產(chǎn)酸能力較弱的原因，進而表明L.paracasei LYO 50 DCU-S對酸奶冷藏期間的pH值與滴定酸度沒有顯著影響。

圖1 水牛奶酸奶在冷藏期間pH值變化情況

圖2 水牛奶酸奶在冷藏期間酸度變化情況

2.2.2 持水力的變化

持水力是酸奶的重要理化指標之一，它的大小直接影響著酸奶的組織狀態(tài)。酸奶持水性越好，在不破乳的情況下更能保持產(chǎn)品的風味和氣味，使產(chǎn)品口感更佳。由圖3可以看出，兩組酸奶樣品都表現(xiàn)出了較好的持水力，含有LYO 50 DCU-S的酸奶樣品2和樣品1差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 黏度和自發(fā)乳清析出率

由圖4和圖5可以看出，兩組樣品的黏度和自發(fā)乳清析出在1～14 d冷藏期間逐漸增加，14 d后趨于穩(wěn)定。PATRICIA[13]等研究表明，一些產(chǎn)胞外多糖（EPS）的益生菌能提高酸奶的質(zhì)地、增加黏度與凝膠強度、減少乳清析出；在本研究中，添加了LYO 50 DCU-S的酸奶樣品的黏度在冷藏期一直都高于商業(yè)發(fā)酵菌株樣品，可能是由于本研究所選用的LYO 50 DCU-S菌株在乳中產(chǎn)生了胞外多糖，進而提高了酸奶的黏度、減少乳清析出。

圖3 水牛奶酸奶在冷藏期間持水力變化情況

圖4 水牛奶酸奶在冷藏期間黏度變化

圖5 水牛奶酸奶在冷藏期間自發(fā)乳清析出率的變化

2.3 感官評定

由表4可以看出，樣品2感官綜合評分高于樣品1。添加了L.paracasei LYO 50 DCU-S酸奶樣品較商業(yè)發(fā)酵菌株酸乳樣品，其口感更加細膩、絲滑、黏稠、均勻，由于菌株的互相協(xié)同作用，添加了L.paracasei LYO 50 DCU-S酸奶樣品的香氣更加濃郁。

2.4 小鼠體體質(zhì)量的變化

由表5可以看出，小鼠體重在實驗期間的變化，實驗在小鼠生理常態(tài)下進行，各劑量組與各對照組之間比較，不存在顯著性差異（P＞0.05）,表明副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S和商業(yè)發(fā)酵菌株酸乳在實驗過程中對雄性小鼠體質(zhì)量沒有影響。

2.5 小鼠排便和小腸推進實驗結(jié)果

表4 兩組酸奶樣品感官評定綜合得分(x±s,n=15)

于模型組（P＜0.01）。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S酸乳各劑量組顯著高于商業(yè)發(fā)酵菌株酸乳組（P＜0.05）。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵的水牛奶酸奶可以顯著改善便秘小鼠的排便能力，能對抗復(fù)方地芬諾酯引起的腸抑制作用，恢復(fù)小鼠的腸推進能力，縮短小鼠首次排便時間，具有潤腸通便作用。同時不同劑量組間還表現(xiàn)出了劑量效應(yīng)，即隨著灌胃劑量的增加，酸乳對便秘小鼠的通便作用也隨之顯著。

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表5 實驗小鼠體質(zhì)量變化(x±s,n=10)g

實驗小鼠連續(xù)灌胃副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S和商業(yè)發(fā)酵菌株酸乳7 d后測定對便秘模型小鼠首次排黑便時間的影響，結(jié)果如表6所示。

表6 實驗菌株酸乳對便秘模型小鼠排便指標的影響（x±s,n=10）

由表6可以看出，與空白組相比，模型組小鼠首次排黑便時間與其存在極顯著差異（P＜0.01），表明便秘小鼠模型成立。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S和商業(yè)發(fā)酵菌株酸乳灌胃7 d后，各劑量組首次排黑便時間與模型組存在顯著性差異（P＜0.05），且各劑量組間存在極顯著差異（P＜0.01）。模型組墨汁推進率極顯著低于空白組（P＜0.01），表明墨汁推進實驗小鼠便秘模型成立。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S酸乳各劑量組和商業(yè)發(fā)酵菌株酸乳灌胃15 d后，其各自小鼠小腸墨汁推進率均極顯著高于模型組（P＜0.01）。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S酸乳各劑量組顯著高于商業(yè)發(fā)酵菌株酸乳組（P＜0.05）。

3 結(jié)論

(1)副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S與商業(yè)酸奶發(fā)酵劑YO-MIX混合發(fā)酵制備水牛奶酸奶，在4℃冷藏21 d，LYO 50 DCU-S對酸奶樣品的商業(yè)菌種活菌數(shù)、pH值、滴定酸度、持水力等均無不良影響（P＞0.05），且在酸乳中存活力較強；可提高酸奶樣品的黏度，但差異不顯著（P＞0.05）；同時添加LYO 50 DCU-S作為發(fā)酵劑可以提高水牛奶酸奶的感官品質(zhì)。所以LYO 50 DCU-S可作為一種較好附屬菌應(yīng)用到酸奶生產(chǎn)中。

(2)副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S酸乳各劑量組和商業(yè)發(fā)酵菌株酸乳灌胃15 d后，其各自小鼠小腸墨汁推進率均極顯著高

Assessment of the quality and laxative effect ofLactobacillus Paracaseiin buffalo milk yogurt

LIU Min,PAN Hongmei,WU Zhishuang,WANG Songmei,FENG Yuemei, YIN Jianzhong,WU Shaoxiong
(Department of Nutrition and Food Science,School of Public Health,Kunming Medical University,Kunming 650500, China)

This study was conducted to evaluate the Laxative effect of lactobacillus paracasei in buffalo milk yogurt and its quality.Lactobacil?lus paracasei,lactobacillus bulgaricus and thermophilic Streptococcus thermophilus were used to ferment buffalo milk.Viable bacteria counts, pH values,acidities,viscosities,sensory indices were tested and recorded in 1 d,7 d,14 d,21 d.In order to explore the improvement of the LYO 50 DCU-S used as a subsidiary starter in the production of milk yogurt,the lactobacillus paracasei,lactobacillus bulgaricus,thermophil?ic Streptococcus thermophiles fermented buffalo milk yogurt was compared with that by YO-MIX(lactobacillus bulgaricus and thermophilic Streptococcus thermophilus).Male Kunming mice were randomly divided into blank group,model control group,control group and three does groups.Constipation model was induced by means of compound diphenoxylate.After 7 days of administration of lactobacillus paracasei in buffalo milk yogurt,the averaged first defecation time of mice was shortened.After another 7 days,the ink propelling rate was significantly increased.The results indicate that the application of Lactobacillus paracasei LYO 50 DCU-S as a subsidiary bacteria in the production of buffalo milk yogurt is feasible,and strain LYO 50 DCU-S can notably improve the laxative effect in constipated mice.

Lactobacillus paracaseiLYO 50 DCU-S;fermentation agent;defecation

TS252.54

A

1001-2230（2017）05-0019-04

2016-09-06

云南省科技計劃項目(2007C0047R)；云南公共衛(wèi)生與疾病防控協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(2016YNPHXT07)。

劉敏（1989-），男，碩士，研究方向為食品營養(yǎng)與健康。

吳少雄