蔣 玲，趙亞婧，李水秀，宋延君，郭 慧，朱坤舉，張 宏

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白念珠菌CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激的影響

蔣 玲，趙亞婧，李水秀，宋延君，郭 慧，朱坤舉，張 宏

目的 探索白念珠菌CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激的影響。方法 以白念珠菌CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株及其親本株為研究對(duì)象，測(cè)定過氧化氫(H2O2)對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。以H2O2建立氧化應(yīng)激模型，比較各菌株細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，ΔΨm)、氧化應(yīng)激相關(guān)基因(CAP1和GRP2)和ROS清除相關(guān)基因(SOD2和SOD5)轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果 各菌株均在5 mmol/L H2O2作用時(shí)出現(xiàn)100%生長(zhǎng)抑制；H2O2能升高細(xì)胞內(nèi)ROS和降低ΔΨm(P<0.05)，其中高表達(dá)株中兩者的變化幅度較親本株低(P<0.05)；同時(shí)高表達(dá)株中CAP1和GRP2基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)上調(diào)以及SOD2和SOD5基因的下調(diào)也較親本株少(P<0.05)。結(jié)論CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)能夠降低白念珠菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)其對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)性。

白念珠菌;CDR1/CDR2基因;MDR1基因; 高表達(dá); 氧化應(yīng)激

近年來白念珠菌病的發(fā)病率不斷上升，雖然有多種抗真菌藥物應(yīng)用于臨床，但耐藥現(xiàn)象愈來愈多，耐藥程度也越來越高[1]。白念珠菌耐藥性的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)最主要的機(jī)制是ATP結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)盒多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)子的編碼基因CDR1和CDR2的過度表達(dá)，易化載體超家族基因MDR1的過度表達(dá)[2]。此外有研究表明白念珠菌的耐藥產(chǎn)生于對(duì)抗真菌藥物的高適應(yīng)性，同時(shí)也是白念珠菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)的一種體現(xiàn)[3]。某些抗真菌藥物，如唑類藥物，已被證實(shí)可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)而殺傷真菌，其耐藥性的產(chǎn)生也有可能是白念珠菌對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的適應(yīng)，不同耐藥程度的菌株對(duì)氧化應(yīng)激可能作出不同的反應(yīng)[4-5]。因此，本文選取同一親本來源的親本株和CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株，在過氧化氫(H2O2)模擬的氧化應(yīng)激環(huán)境下，測(cè)定這兩組菌株抵抗H2O2氧化刺激的差異，氧化損傷的主要指標(biāo)，以及氧化應(yīng)激相關(guān)基因和活性氧(ROS)清除相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況，探討CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)對(duì)白念珠菌氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 受試菌株(見表1)為來自于艾滋病合并口咽念珠菌病患者的白念珠菌(瑞士洛桑大學(xué)微生物研究所Sanglard教授惠贈(zèng))。質(zhì)控菌株為美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) 推薦的克柔念珠菌 ATCC6258和近平滑念珠菌 ATCC22019。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基、主要儀器 H2O2(北京普博欣生物科技有限公司，純度30%), 四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國(guó)Sigma公司)，2′, 7′-二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA，美國(guó)sigma公司)，PBS緩沖液(北京普博欣生物科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO, 美國(guó)Sigma公司)，真菌細(xì)胞線粒體膜電位熒光測(cè)定試劑盒(上海杰美基因(GenMed)醫(yī)藥科技有限公司)，真菌RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.Fungal RNA Kit)(美國(guó)Omega公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TakaRa公司)。YEPD 液體培養(yǎng)基(含1% 酵母抽提粉，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，美國(guó)BD公司)，YEPD 固體培養(yǎng)基(含1% 酵母抽提粉，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，2% 瓊脂，美國(guó)BD公司)，RPMI-1640液體培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司, pH 7.0)。酶標(biāo)儀(680型，美國(guó)BIORAD 公司)，Gallios 流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)，TECAN 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(奧地利 Tecan 公司)，Mini-sub CELL GT電泳儀(美國(guó) BIORAD 公司)，凝膠成像系儀(美國(guó) BIORAD 公司)，Q-PCR 儀(美國(guó) BIORAD 公司)。

表1 受試菌株
Tab.1 Strains used in this study

菌株Strain親本株P(guān)arentstrain過度表達(dá)基因OverexpressiongenesFLC的MIC(μg/mL)MICofFLC(μg/mL)參考文獻(xiàn)ReferenceDSY2940.256DSY296DSY294CDR1andCDR2646DSY2900.57DSY292DSY290MDR11287

注：MIC：最低抑菌濃度

Note: MIC, minimum inhibitory concentration

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 從4 ℃保存的YEPD固體培養(yǎng)基上挑取白念珠菌單克隆于YEPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，活化16 h后用于實(shí)驗(yàn)。1.2.2 試劑配置 H2O2用無菌蒸餾水配置成5 mol/L 的儲(chǔ)備液； DCFH-DA用DSMO溶解，配置成2 mg/mL的儲(chǔ)備液。兩種試劑儲(chǔ)備液分別過濾分裝后, -20 ℃保存?zhèn)溆谩TT用PBS緩沖液配制成5 mg/mL的儲(chǔ)備液, 4 ℃避光保存。

1.2.3 H2O2對(duì)白念珠菌生長(zhǎng)抑制的測(cè)定 先用RPMI-1640液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度為2倍工作濃度(1～5)×103CFU/mL，將H2O2藥物儲(chǔ)備液稀釋至2倍工作濃度(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 mmol/L)，取其100 μL依次加入96孔板的第2 ～ 11列，第1列為生長(zhǎng)對(duì)照, 不加藥液, 而以100 μL RPMI-1640液體培養(yǎng)基代替；第12列為空白對(duì)照, 加入200 μL RPMI-1640液體培養(yǎng)基；除第12列外，其余各孔再分別加入100 μL菌懸液。30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，然后加5 mg/mL的MTT作用3～4 h,將各孔上清吸出100 μL，再加DMSO培養(yǎng)20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570值, 結(jié)果表示為，與生長(zhǎng)對(duì)照孔比較，生長(zhǎng)活性100%完全抑制，培養(yǎng)基清亮?xí)r，所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度即為H2O2對(duì)白念珠菌生長(zhǎng)抑制所需最低濃度。

1.2.4 DCFH-DA 染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 白念珠菌培養(yǎng)同上，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.5×106CFU/mL，加入5 mmol/L H2O2作用，30 ℃培養(yǎng)6 h。藥物處理后，將細(xì)胞用PBS洗滌3次，并重懸至1×107CFU/mL，加入DCFH-DA 使其終濃度為20 μg/mL，30 ℃孵育20 min。將染色好細(xì)胞用PBS洗滌3次后，用Gallios流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度, 該值即代表ROS水平，激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。

1.2.5 線粒體膜電位(ΔΨm)檢測(cè) 將活化好的白念珠菌菌懸液調(diào)整濃度為2.5×106CFU/mL，用5 mmol/L H2O2處理6 h。藥物處理后，應(yīng)用GENMED真菌細(xì)胞線粒體膜電位熒光測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，調(diào)節(jié)菌濃度為1×107CFU/mL，GENMED清理液洗滌3次后，加入500 μL GENMED染色工作液(JC-1染色劑：10 μg/mL)，30 ℃避光培養(yǎng)20 min，將細(xì)胞用GENMED清理液洗滌2次，取200 μL轉(zhuǎn)移至黑色96孔板。應(yīng)用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光雙重測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，獲得紅色熒光單位(散發(fā)波長(zhǎng)590 nm)和綠色熒光單位(散發(fā)波長(zhǎng)530 nm)。ΔΨm由紅色與綠色熒光的比值來確定。

1.2.6 RNA的提取和cDNA合成 活化后白念珠菌調(diào)節(jié)濃度為2.5×106CFU/mL，5 mmol/L H2O2作用6 h。藥物處理后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.5×107CFU/mL，取1 mL，按照真菌RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser說明書先去除基因組DNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA產(chǎn)物放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 引物合成和qRT-PCR 引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。18sRNA、CAP1、GRP2、SOD2和SOD5的引物序列根據(jù)參考文獻(xiàn)合成[8-9]，見表2。qRT-PCR采用SYBR○RPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃ 變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。55 ～ 95 ℃每 1 s 讀取一次熔解曲線。以18sRNA作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果應(yīng)用Light Cycler system software version 3.5(Roche Diagnostics) 軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。以不加藥組各個(gè)基因的表達(dá)量作為對(duì)照，計(jì)算基因H2O2處理后各個(gè)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量，各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量用倍數(shù)變化來表示(2-(ΔΔCt)法)。

表2 基因CAP1、GRP2、SOD2和SOD5所需引物序列
Tab. 2 Primer lists ofCAP1,GRP2,SOD2 andSOD5

PrimerSequence(5'-3')18S-FTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGG18S-RTCGATAGTCCCTCTAAGAAGTGCAP1-FACCGTGAAGGTAAAGAACGCAP1-RGCTACCACCAGTATATTTAGCCGRP2-FTTCGTTTCTGGTGCTTCTGRP2-RTTTGTGGTCCATGAGTTTSOD2-FAACTTGGCTCCTGTCTCSOD2-RTATCACCATTGGCTTTGSOD5-FACATTGGCGGTTTATCSOD5-RATTACCTTGAGGAGCA

2 結(jié) 果

2.1 H2O2對(duì)白念珠菌生長(zhǎng)抑制的影響 結(jié)果顯示H2O2對(duì)這2組白念珠菌生長(zhǎng)活性完全抑制對(duì)應(yīng)的最低濃度值均為5 mmol/L，沒有顯示出CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)對(duì)菌株抵抗H2O2所模擬的氧化應(yīng)激的能力差異。

2.2 ROS生成的差異 如圖1所示，不加藥物作用下，親本株與CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株的ROS無明顯差異(P>0.05)；而在H2O2作用后，各菌株細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；且與對(duì)應(yīng)親本株相比，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株中ROS生成較少(P<0.05)，分別只有親本株的0.34倍和0.49倍。

2.3 ΔΨm降低的差異 如圖2所示，不加藥物作用下，親本株與CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株的ΔΨm無明顯差異(P>0.05)，在H2O2作用下，白念珠菌的ΔΨm比空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；且CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株中ΔΨm比親本株高 (P<0.05)，表明其ΔΨm下降程度較親本株少。

2.4 氧化應(yīng)激相關(guān)基因和ROS清除相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異 如圖3所示，H2O2作用下，氧化應(yīng)激相關(guān)基因CAP1和GRP2轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量在各菌株中均有上調(diào)(P<0.05)，其中，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株的上調(diào)較親本株少(P<0.05)，表明其氧化應(yīng)激反應(yīng)低于親本株； ROS清除相關(guān)基因SOD2和SOD5轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量在各菌株中均有下調(diào)(P<0.05)，其中，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株的下調(diào)較親本株少(P<0.05)，表明其細(xì)胞內(nèi)ROS清除作用高于親本株。

數(shù)據(jù)以3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的形式表示 * P<0.05The data display the ±s from three independent experiments * P<0.05圖1 流式細(xì)胞術(shù)DCFH-DA染色檢測(cè)H2O2對(duì)親本株、CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株ROS的影響Fig.1 Effect of H2O2 on ROS of parent strains and CDR1/CDR2 or MDR1 genes overexpressed strains were assessed by flow cytometry using DCFH-DA

數(shù)據(jù)以3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的形式表示 *P<0.05The data display the ±s from three independent experiments * P<0.05圖2 JC-1染色檢測(cè)H2O2對(duì)親本株、CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)株膜電位的影響Fig.2 Effect of H2O2 on ΔΨm of parent strains and CDR1/CDR2 or MDR1 genes overexpressed strains were assessed by JC-1 staining

數(shù)據(jù)以3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的形式表示The data display the ±s from three independent experiments圖3 qRT-PCR 測(cè)定不加藥或5 mmol/L H2O2處理后白念珠菌基因CAP1(A)、GRP2(B)、SOD2(C)和SOD5(D) 的表達(dá)水平Fig.3 qRT-PCR analysis of the expression levels of CAP1(A), GRP2(B), SOD2(C) and SOD5(D) in C. albicans which treated or untreated with 5 mmol/L H2O2

3 討 論

白念珠菌的耐藥性是目前臨床上系統(tǒng)性白念珠菌感染治療失敗的主要原因之一。當(dāng)機(jī)體感染白念珠菌時(shí)，細(xì)胞免疫占主導(dǎo)地位[10]，主要是通過吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)而殺傷白念珠菌，而白念珠菌對(duì)氧化損傷的耐受可以導(dǎo)致免疫逃逸，進(jìn)一步促進(jìn)感染的形成[11]，其臨床治療也會(huì)越困難。因此，本文旨在探討不同耐藥程度的白念珠菌在耐受氧化應(yīng)激能力上存在的差異，從而為抗真菌治療提供一個(gè)新的途徑。

本研究選定白念珠菌藥物外排泵基因CDR1/CDR2和MDR1高表達(dá)且對(duì)唑類藥物耐藥的菌株和對(duì)應(yīng)的親本株為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)所有菌株對(duì)H2O2的耐受性無差異。這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)使用的菌濃度和培養(yǎng)基都較少，H2O2為很強(qiáng)的殺菌劑，在這樣的情況下它能夠在極低的濃度下殺死白念珠菌。同時(shí)在5 mmol/L H2O2模擬的氧化應(yīng)激環(huán)境下，我們發(fā)現(xiàn)CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)能夠減少ROS的生成。某些抗真菌藥物可以通過使真菌處于大量ROS的內(nèi)外環(huán)境而殺傷真菌[4-5]。而真菌過度表達(dá)藥物外排基因，增加藥物外排的過程也就是消除氧化源的過程,是對(duì)抗真菌藥物引起的氧化刺激最有效的手段。因此,藥物外排泵基因CDR1/CDR2和MDR1高表達(dá)能夠減少氧化刺激下白念珠菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平。其次，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)能夠減少白念珠菌ΔΨm的下降。正常白念珠菌細(xì)胞中存在著完備的氧化和抗氧化系統(tǒng)，處于氧化還原平衡狀態(tài)。當(dāng)輻射、細(xì)胞毒性藥物等破壞了氧化還原的平衡態(tài)時(shí)，ROS的生成超過了抗氧化防御的能力，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生輕度的氧化應(yīng)激時(shí)，在藥物作用下細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出一定的耐藥性。但大量的則會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)烈的氧化損傷反應(yīng)，如線粒體功能障礙，從而降低了ΔΨm[12]。所以，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)在減少細(xì)胞內(nèi)ROS生成后，同時(shí)也能減少ΔΨm的下降。

有文獻(xiàn)報(bào)道，CAP1基因既與白念珠菌的耐藥性相關(guān)，又與氧化應(yīng)激相關(guān)[13-14]，GRP2基因編碼丙酮醛還原酶，能單獨(dú)或通過CAP1基因引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD2和SOD2基因編碼超氧化物歧化酶，清除細(xì)胞內(nèi)ROS，是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的第一道防線[15]。CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)通過減少CAP1和GRP2基因表達(dá)的上調(diào)，降低了白念珠菌引起氧化應(yīng)激的能力；同時(shí)，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)通過減少SOD2和SOD5基因表達(dá)的下調(diào)，增加了菌株細(xì)胞內(nèi)ROS的清除，減少了其積聚，從而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。qRT-PCR的結(jié)果與細(xì)胞內(nèi)ROS和ΔΨm測(cè)定結(jié)果是一致的。

由此可知，CDR1/CDR2和MDR1基因高表達(dá)能夠降低白念珠菌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加其對(duì)氧化應(yīng)激環(huán)境的適應(yīng)性。白念珠菌的耐藥也是對(duì)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的適應(yīng)，尋找新的抗氧化應(yīng)激作用的藥物與當(dāng)前耐藥的抗真菌藥物聯(lián)合使用，有可能為解決白念珠菌的耐藥問題提供新思路。

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Effect ofCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpression on oxidative stress inCandidaalbicans

JIANG Ling, ZHAO Ya-jing, LI Shui-xiu, SONG Yan-jun, GUO Hui, ZHU Kun-ju, ZHANG Hong

(TheFirstAffiliatedHospital/InstituteofMycology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

To investigate the effect ofCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpression on oxidative stress inCandidaalbicans, we evaluated the effect of H2O2on cell viability inC.albicansoverexpressing genesCDR1 /CDR2 orMDR1 and their parent strains. After establishing an oxidative stress model with H2O2, we detected reactive oxygen species (ROS)，mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and the expression of oxidative stress response-related genes (CAP1 andGRP2) and ROS clearance related-genes (SOD2 andSOD5). The results showed thatC.albicansgrowth were inhibited by 100% after the treatment of 5 mmol/L H2O2. H2O2caused more ROS accumulation and ΔΨm reduction in parent strains than inCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpressed strains (P<0.05). Compared to parent strains, the up-regulated expression ofCAP1 andGRP2 were relatively less inCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpressed strains, moreover, the down-regulated expression ofSOD2 andSOD5 were also relatively less inCDR1/CDR2 orMDR1 genes overexpressed strains (P<0.05). In conclusion, the overexpression ofCDR1/CDR2 andMDR1 genes could reduce the oxidative stress response and enhance the adaptability ofC.albicansto oxidative stress.

Candidaalbicans;CDR1/CDR2 gene;MDR1 gene; overexpression; oxidative stress

s: Zhang Hong, Email: tzhangh@jnu.edu.cn;Zhu Kun-ju, Email: zhukunju1111@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.003

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81171542/81471995)

張 宏，Email：tzhangh@jnu.edu.cn； 朱坤舉，Email: zhukunju1111@163.com

暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院/暨南大學(xué)真菌病研究所，廣州 510632

R378

A

1002-2694(2017)06-0486-05

2016-11-10 編輯：張智芳

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81171542 / 81471995)