李寶龍，單毓娟，劉旭，李松濱，劉永武，姜波

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150090)

萊菔硫烷對C57BL/6小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

李寶龍1，單毓娟2*，劉旭1，李松濱1，劉永武1，姜波1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150090)

目的：研究萊菔硫烷對酒精誘發(fā)的肝臟功能異常的保護作用。方法：雄性C57BL/6 小鼠按體質(zhì)量隨機分為5組(n=12)：陰性對照組、酒精模型組、SFN處理組(SFN的劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg),先給處理組動物經(jīng)口灌胃不同劑量的SFN共10 d(1次/d),在末次灌胃SFN后，立即給予酒精模型組和SFN處理組動物酒精(5 g/kg)，每12 h 1次，共3次,末次給予酒精4h后結(jié)束整個實驗,常規(guī)HE染色觀察肝臟病理變化,采用半自動生化分析儀檢測血清、肝勻漿中相關(guān)指標的表達水平。結(jié)果：病理學和血清學指標表明，成功建立了小鼠急性酒精性肝損傷模型,萊菔硫烷能明顯減輕酒精對肝臟的病理學損傷，高劑量萊菔硫烷保護組的作用明顯,萊菔硫烷能保護酒精對AST、ALT、ALP3種代謝酶功能的損傷,萊菔硫烷能提高肝勻漿抗氧化酶SOD和GSH-Px活性，降低脂質(zhì)過氧化物MDA的水平。結(jié)論: 萊菔硫烷能保護酒精對肝臟功能的損傷，其主要作用機制與SFN提高了酒精代謝的關(guān)鍵酶SOD和GSH-Px活性密切相關(guān)。

萊菔硫烷；肝損傷；酒精代謝；抗氧化

有研究顯示，全球人均年酒精的攝入量已達6.2 L[1]，過量攝入酒精將危及多種器官的正常功能，從而增加疾病風險。肝臟是人體重要的代謝、解毒器官，也是受酒精毒害的首要器官。在酒精性肝損傷的發(fā)病機制中，氧化性應激損傷起了關(guān)鍵的作用。萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)富含于十字花科蔬菜中，具有代謝解毒、抗氧化、組蛋白去乙?；然钚訹2-7]，是一種極具開發(fā)價值的Ⅱ相代謝酶誘導劑[8]。同時萊菔硫烷作為一種間接抗氧化劑，可通過激活抗氧化酶活性和升高抗氧化物的水平來發(fā)揮強大的抗氧化作用[9]。據(jù)此推測萊菔硫烷能通過抗氧化途徑來保護急性酒精攝入后對肝臟的損傷作用。為驗證上述假設(shè)，本研究擬通過預先給予萊菔硫烷以誘導體內(nèi)部的抗氧化能力，隨后急性投予酒精，探究萊菔硫烷的保護性作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

萊菔硫烷購自LKT laboratories公司(英國)。GSH-Px、SOD和MDA檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司(南京，中國)。Bradford 蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所(上海，中國)；AST、ALT和 ALP檢測試劑盒購自中生北控生物科技公司(北京，中國)。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)

SPF級雄性C57BL/6 小鼠(5周齡)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京)2012-0001，在屏障環(huán)境內(nèi)經(jīng)過5天的適應性喂養(yǎng)后進行正式分組及實驗。在實驗期間實驗動物自由飲水、攝食。SPF級60Co輻照滅菌小鼠維持飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。動物實驗室溫度22～24℃、相對濕度55%～60%、照明12 h/12 h晝夜交替進行。

1.3 實驗動物分組及處理

60只雄性C57BL/6 小鼠按體質(zhì)量隨機分為5組(n=12)，分別是陰性對照組、酒精模型組、SFN處理組(SFN的劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)。實驗開始時，給處理組動物經(jīng)口灌胃不同劑量的SFN，每天1次，灌胃10 d。急性酒精性肝損傷模型參照Carson 和 Pruett的方法構(gòu)建，動物在末次灌胃SFN后，立即給予酒精模型組和SFN處理組動物酒精(5 g/kg)，每12 h 1次，共給予3次，末次給予酒精4 h后，眼球取血制備血清，頸椎脫臼處死動物。陰性對照組給予等熱量的葡萄糖。

1.4 肝臟組織病理檢查

剪取肝臟右葉，以10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色，制片后光學顯微鏡下觀察肝組織基本病理變化。

1.5 肝勻漿制備及氧化還原指標的測定

取0.5 g肝左葉在預冷的生理鹽水(NS)中漂洗數(shù)次，濾紙吸干后加入4.5 mL預冷NS勻漿。用眼科剪盡快剪碎組織塊，并于玻璃器皿中制成10%肝組織混懸液，然后在4℃條件下以10 000 r/min離心20 min，取上清(即為肝勻漿)分裝于EP管中，置于冰箱(-80℃)中冷凍保存。按照試劑盒說明，用酶標儀測定超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.6 血清肝功能生化指標測定

血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)的活性采用中生北控生物科技公司的試劑盒，用半自動生化分析儀進行測定。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 實驗結(jié)果

2.1 SFN對酒精引起的肝臟病理學異常的保護作用

光鏡下觀察，陰性對照組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀整齊排列，肝小葉輪廓清晰，肝細胞呈多邊形，細胞分界清，核圓而清晰，位于細胞中央，細胞質(zhì)豐富，無脂肪變性和炎癥反應，見圖1A。模型組小鼠肝小葉界限不清，肝細胞漿出現(xiàn)不同程度的空泡變性，以肝包膜下的肝細胞為明顯，輕者肝細胞漿松化呈網(wǎng)狀，重者胞體腫大或呈球形，胞漿透明，肝竇受壓、紊亂。小葉各帶可見散在的點、灶狀壞死，主要見于中央靜脈周圍區(qū)，壞死灶及肝竇內(nèi)可見較多量嗜中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞浸潤，見圖1B。高劑量SFN預保護組細胞索排列較整齊，肝細胞呈現(xiàn)多邊形，細胞分界清，核圓而清晰，位于細胞中央，細胞質(zhì)未見脂肪滴，見圖1C。低、中劑量的SFN組肝細胞中濁腫明顯減輕，有散在炎細胞浸潤，肝細胞內(nèi)偶有小脂滴，見圖1E和1D。

2.2 萊菔硫烷對小鼠血清中ALT、AST、ALP水平的影響

由表1可知，與陰性對照組相比，酒精模型組小鼠血清中ALT水平明顯升高(P<0.01)，為模型組ALT水平的3.9倍，AST、ALP水平也有升高(P<0.05)，分別為模型組的1.27倍、1.51倍，提示酒精引起了肝臟的損傷。給予萊菔硫烷后，與酒精模型組相比，低劑量組ALT、AST、ALP水平未出現(xiàn)差異性變化，中劑量組ALT、AST、ALP水平明顯降低(P<0.01或P<0.05)，高劑量組ALT、ALP水平也明顯降低(P<0.01)，并具有劑量-效應關(guān)系；而AST水平僅在中劑量SFN預保護組有顯著性差異。

圖1 酒精對肝臟攝入的影響及SFN的保護作用(×400)注：A.陰性對照組；B.酒精模型組；C.SFN(40 mg/kg)；D.SFN(20 mg/kg)；E.SFN(10 mg/kg)

表1 萊菔硫烷對小鼠血清中相關(guān)代謝酶活性的影響

注：與陰性對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與酒精模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 SFN對酒精引起的肝臟氧化性損傷的保護作用

由表2可知，急性酒精刺激后，酒精模型組肝組織中的抗氧化酶SOD、GSH-Px活性分別降低27%和34%，而MDA含量升高較為明顯，達86%(P<0.01)。中、高劑量SFN 能夠明顯的保護酒精對GSH-Px活力的抑制作用，與模型組(274.92±79.76)相比，約升高30%～32%；SFN對SOD活性的保護作用呈劑量-效應關(guān)系，與模型組比較，約升高17%～46%，以中高劑量SFN的保護作用更加強烈。SFN能明顯降低MDA產(chǎn)生，降低幅度在39%～43%(P<0.05)，且呈劑量-效應關(guān)系。

表2 SFN對小鼠肝組織抗氧化酶和MDA的影響

注：與陰性對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與酒精模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本研究結(jié)果表明，SFN能增強抗氧化酶的活性、抑制脂質(zhì)過氧化物的生成，從而保護酒精對肝臟功能的損傷作用。急性酒精刺激后，肝組織中表現(xiàn)出的空泡變性、肝細胞漿疏松化甚至腫大；肝小葉散在的點、灶狀壞死及肝竇內(nèi)炎性細胞的浸潤，均說明了肝臟受損。高劑量(40 mg/kg)SFN能夠明顯保護肝臟組織，其組織學表現(xiàn)已經(jīng)接近了陰性對照組，說明SFN能夠保護急性酒精性肝損傷。

酒精攝入后造成肝損害，其明顯特征是細胞酶外漏至血漿[10]。本研究發(fā)現(xiàn)急性酒精攝入后， AST、ALT、ALP等水平的增高，提示肝功能受損，該結(jié)果與前人結(jié)果一致[10]；同時ALT的變化比AST敏感，有可能是由于二者亞細胞定位不同所致，ALT位于細胞質(zhì)，而AST位于線粒體中，只有損傷比較嚴重時AST釋放量才增加。Seung HK等[11]人研究發(fā)現(xiàn)，SFN可改善CCl4所致肝組織中MDA生成。脂質(zhì)過氧化反應是導致酒精性肝損傷的重要原因。自由基的生成以及脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生在酒精產(chǎn)生肝內(nèi)外毒性的機制上扮演了重要角色[12]。酒精通過細胞色素P450 2E1(CYP2E1)和乙醇脫氫酶(ADH)介導生成很多自由基，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，導致肝細胞損傷[13]。MDA是細胞脂質(zhì)過氧化反應中具有代表性的產(chǎn)物，其含量的多少預示脂質(zhì)過氧化的強度。因此測定組織中MDA的含量常可反映脂質(zhì)過氧化反應的強弱，間接反映細胞損傷程度[14]。SOD清除過多的超氧化陰離子，并將其轉(zhuǎn)化成H2O2，再由GSH-Px和CAT進一步氧化成O2和H2O，減少自由基的產(chǎn)生，降低脂質(zhì)過氧化的生成并加速其清除，從而減輕肝細胞損傷[15-16]。SFN正式通過抑制上述一系列的級聯(lián)式反應中的關(guān)鍵酶如SOD和GSH-Px，加強了機體清除MDA的能力，最終保護了肝臟功能。

綜上，本研究結(jié)果表明SFN預保護后，再給予小鼠急性酒精刺激，能明顯保護小鼠急性酒精性肝損傷；其初步作用機制與SFN提高了酒精代謝的關(guān)鍵酶SOD和GSH-Px活性有關(guān)。

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Preventive Effects of Sulforaphane on Acute Alcoholic Hepatic Injury Model of C57BL/6 Mice

LI Bao-long1, SHAN Yu-juan2, LIU Xu1, LI Song-bin1, LIU Yong-wu1, JIANG Bo1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China)

Objective：To investigate the effects of sulforaphane (SFN) on abnormal function of liver induced by alcohol. Methods：Male C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups (n=12), which were the negative control group, alcohol model group, and SFN pretreatment group (10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg). Mice were daily gavaged SFN with different dose for ten days. At the end of last intake of SFN, mice in groups of the alcohol model and SFN pretreatment were gavaged alcohol(5 g/kg) every 12 hours for 3 times. The whole experiment was ended after 4 hours of last alcohol intake. HE staining was performed to check the pathological changes of liver. Blood and liver homogenates were collected to measure the expression levels of the relevant indicators by semi-automatic biochemistry analyzer. Results: The acute hepatic injury model was successfully established in C57BL/6 mice, as shown by indicators of pathology and serum. SFN, in high dose especially could lessen the pathological damage induced by alcohol. Also SFN significantly inversed the activities of AST, ALT and ALP induced by alcohol. SFN obviously activated the anti-oxidant enzymes including SOD and GSH-Px. Additionally, SFN pretreatment could inhibit the alcohol-induced MDA level, products of lipid peroxidation in dose-dependent way. Conclusion: SFN can protect the functions of liver damaged by alcohol. The main mechanisms may be associated with enhancing the antioxidant-enzymes, which are in charge of the metabolisms of alcohol.

Sulforaphane; Hepatic Injury/Liver damage; Alcohol metabolism; Antioxidant

2016-05-03

2016-12-30

黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目(12541763)；國家自然科學基金面上項目(81573135)

李寶龍(1973-)， 男，博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事中藥及植物提取物抗衰老研究。

*通訊作者：單毓娟(1972-)，女，博士，教授，博士研究生導師，主要從事植物化學物的生物活性及分子機制研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0013-03