燕平梅,張小冰,柴 政,喬宏萍,趙文婧,王丹丹,王 琪

(1.太原師范學(xué)院生物系,山西太原 030012;2.山西大學(xué)生物學(xué)院,山西太原 030031)

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基于DGGE方法分析低氯化鈉濃度對(duì)發(fā)酵白菜原核微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

燕平梅1,張小冰1,柴 政1,喬宏萍1,趙文婧1,王丹丹1,王 琪2

(1.太原師范學(xué)院生物系,山西太原 030012;2.山西大學(xué)生物學(xué)院,山西太原 030031)

為了探究氯化鈉濃度對(duì)發(fā)酵白菜體系中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。以4%、6%和8%氯化鈉濃度發(fā)酵白菜,通過DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)方法及Quantity One軟件分析原核微生物群落結(jié)構(gòu);通過回收DGGE電泳中熒光強(qiáng)度強(qiáng)、不同時(shí)間差異的電泳帶,經(jīng)克隆后測(cè)定堿基序列、與GenBank 庫序列對(duì)比鑒定。結(jié)果表明6%氯化鈉濃度發(fā)酵白菜微生物多樣性指數(shù)H(Shannon)、豐富度指數(shù)R(Species Richness)在發(fā)酵全過程中低于4%、8%組,均勻度指數(shù)E(Species Evenness)較4%、8%組的穩(wěn)定。說明氯化鈉濃度6%的發(fā)酵泡菜在整個(gè)發(fā)酵期微生物群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定且微生物種類小于氯化鈉濃度4%、8%組。從DGGE電泳帶熒光強(qiáng)度和存在的時(shí)間可知:在氯化鈉濃度6%的發(fā)酵白菜體系中，Leuconostoccitreum(檸檬明串珠菌)、Unculturedbacterium(非培養(yǎng)細(xì)菌)、Leuconostocmesenteroides(腸系膜明串珠菌)是白菜發(fā)酵中期、后期的優(yōu)勢(shì)微生物,Leuconostoccitreum(檸檬明串珠菌)、Leuconostocmesenteroides(腸系膜明串珠菌)是乳酸菌。氯化鈉濃度4%和8%發(fā)酵白菜中乳酸菌未成為優(yōu)勢(shì)微生物。說明氯化鈉濃度6%較4%和8%發(fā)酵白菜原核微生物群落的變化接近于自然發(fā)酵蔬菜微生物變化規(guī)律,研究結(jié)果表明6%氯化鈉濃度有利于白菜的發(fā)酵。

發(fā)酵,白菜,DGGE,原核微生物群落

蔬菜發(fā)酵體系是獨(dú)特的微生物生態(tài)環(huán)境。其中的微生物與發(fā)酵蔬菜制品的品質(zhì)和風(fēng)味有直接的關(guān)系[1-3],對(duì)蔬菜發(fā)酵中微生物的多樣性及其所扮演角色進(jìn)行調(diào)查研究可為改進(jìn)傳統(tǒng)蔬菜發(fā)酵工藝、探究發(fā)酵蔬菜風(fēng)味形成機(jī)理等方面提供參考數(shù)據(jù)。純培養(yǎng)方法是研究蔬菜發(fā)酵體系微生物多樣性傳統(tǒng)的經(jīng)典技術(shù)。但該方法需要人工配制培養(yǎng)基及設(shè)定環(huán)境條件,會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響[4-5],可能在蔬菜發(fā)酵體系中占主要地位或含量很高的菌群在培養(yǎng)基中無法培養(yǎng)或生長(zhǎng)很差[6]。而用培養(yǎng)分離法從發(fā)酵蔬菜中分離出的優(yōu)勢(shì)的菌種經(jīng)研究后卻發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌僅僅是由于培養(yǎng)基上能大量被培養(yǎng)出來,從而被高估了它們的實(shí)際含量和作用[5]。此外,有研究表明在自然環(huán)境中有約90%～99%的菌種用傳統(tǒng)方法是無法培養(yǎng)出來[7]。因此,純培養(yǎng)技術(shù)有一定的局限性。

近年來,利用分子生物學(xué)的非培養(yǎng)方法認(rèn)識(shí)食品發(fā)酵體系中微生物的多樣性、微生物群落的研究顯著增加,如發(fā)酵玉米團(tuán)[8]、麥芽威士忌[9]、意大利香腸[10-11]、韓國泡菜[12]。梁新樂等[13]研究表明基于分子生物學(xué)的方法PCR-DGGE是研究發(fā)酵食品微生物組成的可行方法。李正國等[14]通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)結(jié)合DGGE檢測(cè)了榨菜腌制過程中的細(xì)菌群落。付琳琳[15]采用PCR-DGGE方法研究泡菜中乳酸菌的群落結(jié)構(gòu)。泡菜發(fā)酵過程中除了乳酸菌外,還存在大量的細(xì)菌,影響著泡菜的品質(zhì)。據(jù)報(bào)道在發(fā)酵蔬菜體系中高濃度食鹽(10%～16%)有利于酵母菌生長(zhǎng),而低濃度食鹽(5%～8%)則有利于乳酸菌生長(zhǎng)[16-18]。本研究通過PCR-DGGE方法研究泡菜中細(xì)菌微生物的群落結(jié)構(gòu),為闡明泡菜的發(fā)酵機(jī)理提供研究方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白菜 來源于北京圓明園西路2號(hào)超市發(fā)超市,于2012年3月購買；DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;X-gal、氨芐(Amp) 北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR引物 上海生工生物工程公司合成。

瓊脂糖凝膠電泳儀、PCR儀、變性梯度凝膠電泳儀、NanoDrop2000DNA濃度儀、凝膠成像系統(tǒng) 均購自Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 泡菜的制備和取樣 發(fā)酵泡菜:發(fā)酵容器用干凈的250 mL的三角瓶,瓶蓋用紗布包裹的棉塞制成,將三角瓶和棉塞一起在濕熱滅菌鍋于121 ℃保溫20 min,冷卻后加入用無菌水洗干凈的白菜和含不同濃度(4%、6%、8%)氯化鈉煮沸后冷卻的鹽水(菜∶鹽水為1∶2 m/v),塞上棉塞(以上操作在無菌的超凈臺(tái)上進(jìn)行),放入干燥器中用真空泵抽氣,在20 ℃恒溫箱中厭氧發(fā)酵。取樣:分別于發(fā)酵第1、3、5、7、9、11、13、15、17 d從干燥器取兩瓶發(fā)酵白菜,在無菌的超凈臺(tái)用無菌的移液器取5 mL發(fā)酵白菜鹵水,然后塞好棉塞,放入干燥器中用真空泵抽氣,放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)酵。

泡菜鹵pH測(cè)定用數(shù)字pH計(jì),pH計(jì)的校準(zhǔn)用廠商供給的pH為4.0和7.0的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液。

1.2.2 泡菜體系中所含微生物總DNA的提取 試劑盒(DNA提取試劑盒)給定步驟提取DNA。將不同取樣時(shí)間的泡菜鹵水作為基質(zhì)提取發(fā)酵白菜鹵中的DNA。DNA樣品濃度利用Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.2.3 16S rDNA V3片段的PCR擴(kuò)增 原核微生物的16S rDNA序列V3片段的通用引物為引物,即選用341f-GCCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG GGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG)和534r(ATTACCGCGGCTGCTGG)[14]引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)體系:PCR Master Mix 12.5μL,每種引物1 μL(10 pmol·μL-1),1.5 μL的發(fā)酵白菜總DNA,加ddH2O至終體積25 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性 5 min,94 ℃ 30 s,48.8 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,72 ℃ 8 min,35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5 μL,以1.2%瓊脂糖濃度的凝膠電泳檢測(cè),Bio-Rad 公司凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE) DGGE凝膠系統(tǒng)是由變性膠和上層膠組成的[19],具體配方見表1。

表1 變性梯度凝膠的配方Table 1 Denatured gradient gel formula

DGGE電泳結(jié)果在Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照、分析。并將特征條帶切割回收,溶解后進(jìn)行16S rDNA V3片段的二次PCR及產(chǎn)物回收,經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物與pGM-T Vector進(jìn)行連接,在超凈臺(tái)內(nèi)將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。陽性克隆的菌落在華大基因公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。

1.2.5 DGGE圖譜分析方法 DGGE指紋圖譜分析借助于Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶判讀,并用Quantity One software進(jìn)行分析。

1.2.5.1 DGGE條帶多樣性分析 用Quantity One軟件進(jìn)行DGGE條帶分析,每個(gè)條帶的位置和相對(duì)光密度值被該軟件自動(dòng)分析確定。為了最大程度的降低DGGE過程中不同樣品間DNA上樣濃度的差異,每個(gè)條帶的光密度峰值除以該條帶所在泳道所有條帶光密度峰值的平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。每條泳道內(nèi)的條帶數(shù)量用以評(píng)價(jià)物種豐富度(Species Richness),并通過條帶相對(duì)密度值計(jì)算物種均勻度(Species Evenness)及物種多樣性(Shannon)[20]。

多樣性指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(E)及豐富度指數(shù)(R)的計(jì)算公式:

H=-∑(ni/N)Ln(ni/N)

式(1)

E=H/LnS

式(2)

R=S-1/LnN

式(3)

式中,ni為單一條帶的峰面積,N為某一泳道所有峰面積,S為某一泳道的總條帶數(shù)。

1.2.5.2 相似性聚類分析 使用Quantity One軟件的UWPGA(Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages)方法對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行相似性聚類分析。

1.2.5.3 系統(tǒng)發(fā)育分析方法 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去載體,得到目的片段序列提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì),獲得與目的片段相似度高的序列,通過MEGA4.0利用Neighbor-Joining法建立16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹,對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.6 發(fā)酵白菜中乳酸菌的分離與計(jì)數(shù) 用平板菌落計(jì)數(shù)方法,將樣品液稀釋到106,涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,將涂布樣品的 MRS固體培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)2 d 后計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜發(fā)酵過程中pH隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律

用三種質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈉濃度發(fā)酵白菜過程中pH變化(圖1),在前 7 d 發(fā)酵液的pH不斷下降,第9 d后變化緩慢,氯化鈉濃度4%發(fā)酵液的pH于9～13 d緩慢上升、15 d下降、17 d上升;氯化鈉濃度6%發(fā)酵液的pH于9～17 d保持在3.8左右,氯化鈉濃度為6%的pH在第5 d后出現(xiàn)比較明顯的下降。氯化鈉濃度8%發(fā)酵液的pH在9～13 d保持在4.5～4.7,15 d上升。氯化鈉濃度4%發(fā)酵液的pH 15 d之前高于8%發(fā)酵液的pH。

圖1 發(fā)酵過程中pH的變化Fig.1 Variation of pH value in fermented cabbages

2.2 16S rDNA V3片段的PCR擴(kuò)增

以發(fā)酵白菜體系中提取的DNA為模板,經(jīng)過PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果如圖2所示,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在240 bp左右,條帶清晰,且無雜帶,可以用來進(jìn)行后續(xù)的DGGE分析。經(jīng)Nanodrop儀器測(cè)得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA含量,確定DGGE電泳實(shí)驗(yàn)的上樣量。

圖2 16S rDNA V3片段擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 16S rDNA V3 sequence agarose gel electrophoresis amplificating as fermented vegetables total DNA template under 4% salt concentration注:M為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物,CK是陰性對(duì)照,泳道1～8分別代表取樣時(shí)間1、3、5、7、9、11、13、15、17 d。

2.3 發(fā)酵白菜中乳酸菌數(shù)量的變化情況

三種質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈉濃度發(fā)酵白菜乳酸菌數(shù)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況見圖3,不同氯化鈉濃度發(fā)酵白菜乳酸菌的數(shù)量變化趨勢(shì)基本相同,前11 d乳酸菌數(shù)呈上升趨勢(shì),11 d以后乳酸菌數(shù)顯示下降狀態(tài)。氯化鈉濃度8%的發(fā)酵白菜乳酸菌的數(shù)量最少;4%的乳酸菌的數(shù)量最多。

圖3 三種濃度食鹽下發(fā)酵白菜乳酸菌數(shù)量的變化Fig.3 Change in the number of lactic acid bacteria fermented cabbages

2.4 發(fā)酵白菜體系原核微生物16S rDNA V3片段的DGGE圖譜分析

圖4 發(fā)酵白菜微生物16S rDNA V3片段的DGGE圖譜。Fig.4 DGGE of fermented vegetables 16S rDNA V3 gene注:A、B、C分別為4%、6%、8%氯化鈉濃度發(fā)酵的白菜。1～9泳道依次代表取樣時(shí)間:1、3、5、7、9、11、13、15、17 d。

2.4.1 回收DGGE電泳帶的分析鑒定 氯化鈉濃度4%的發(fā)酵泡菜樣品DGGE電泳圖譜如圖4A所示,發(fā)酵不同時(shí)間樣品的電泳帶數(shù)量和遷移率均不同。每個(gè)發(fā)酵時(shí)間電泳帶數(shù)量較多。為了研究發(fā)酵白菜體系中優(yōu)勢(shì)的微生物種類,實(shí)驗(yàn)中回收熒光強(qiáng)度強(qiáng)、不同時(shí)間差異的電泳帶,通過基因擴(kuò)增反應(yīng)后測(cè)定堿基序列、與GenBank 庫序列對(duì)比鑒定。鑒定結(jié)果見表2,電泳帶A、B、D、E、F、G、H分別與Unculturedbacterium(非培養(yǎng)細(xì)菌)、Pseudomonassp.(假單胞菌屬)、Pantoeadispersa(泛菌)、Serratiasp.(沙雷氏菌屬)、Serratiasp.(沙雷氏菌屬)、Staphylococcussciuri(松鼠葡萄球菌)、Rahnellasp(拉恩氏菌屬)的相似度為95%、99%、95%、99%、99%、97%、96%,說明與之對(duì)應(yīng)的菌是同一種屬。而C條帶與Staphylococcussciuri(松鼠葡萄球菌)相似度87%,說明不是同一種屬?；蛐蛄屑皡⒈刃蛄袠?gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹得出(圖5a所示):最大的類群為γ變形桿菌綱微生物Gamma proteobacteria,包括Rahnellasp.(H)、Pantoeadispersa(D)和Serratiasp.(E)、Pseudomonassp.(B)、Serratiasp.(F);放線菌目Actinomycetales為另一類群,包括Staphylococcussciuri(C)和Staphylococcussciuri(G)。

表2 發(fā)酵泡菜原核微生物的DGGE圖譜條帶測(cè)序結(jié)果Table 2 DGGE band sequencing results of fermented vegetables bacterial community

其中Rahnellasp.(H)存在發(fā)酵前期(5 d);Pantoeadispersa(D)、Serratiasp.(E)和Staphylococcussciuri(G)存在發(fā)酵后期;Unculturedbacterium(A),Pseudomonassp.(B)、Staphylococcussciuri(C)、Serratiasp.(F)貫穿發(fā)酵整個(gè)過程。

氯化鈉濃度為6%的樣品電泳圖譜如圖4B所示,電泳帶A、B、C、D、E、F、G、I鑒定結(jié)果分別與Leuconostoccitreum(檸檬明串珠菌)、Unculturedbacterium(非培養(yǎng)細(xì)菌)、Leuconostocmesenteroides(腸系膜明串珠菌)、Unculturedgammaproteobacterium(非培養(yǎng)的菌)、Unculturedbacterium(非培養(yǎng)細(xì)菌)、UnculturedEnterobactersp.(非培養(yǎng)腸桿菌)、Enterobacteriaceaebacterium(腸桿菌科細(xì)菌)、Pantoeasp.(I)相似度為100%、100%、98%、99%、85%、100%、100%、98%(如表2所示)?；蛐蛄屑皡⒈刃蛄袠?gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹得出(如圖5b所示):最大的類群為γ變形桿菌綱微生物Gammaproteobacteria,包括電泳帶A、D、F、G、H;第二大類群為unknown cluster包括電泳帶E、B。第一類群為L(zhǎng)actobacillables,其中包括條帶A和條帶C,其中Enterobacteriaceaebacterium(G)在發(fā)酵前期起作用。Leuconostocmesenteroides(C)、Unculturedgammaproteobacterium(D)、Unculturedbacterium(E)發(fā)酵的3 d后檢測(cè)到。Leuconostoccitreum(A)、Leuconostocmesenteroides(C)、Unculturedbacterium(B)存在發(fā)酵后期。UnculturedEnterobactersp.(F)、Pantoeasp.(I)存在于發(fā)酵的全過程。A、B、C的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于D、E、F、G、I,說明Leuconostoccitreum(A)、Unculturedbacterium(B)、Leuconostocmesenteroides(C)是泡菜發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)微生物。

圖5 氯化鈉濃度4%(a)、6%(b)、8%(c)的發(fā)酵白菜細(xì)菌16S rDNA V3片段基因序列及參比序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育Fig. 5 Phylogenetic trees constructed 16S rDNA V3 gene sequence and the reference sequence of fermented cabbages under 4%,6%,8% salt concentration

氯化鈉濃度為8%的樣品電泳圖譜如圖4C所示,電泳帶A、B、C、D、E鑒定結(jié)果分別與Staphylococcussciurisp.(松鼠葡萄球菌屬)、Serratiasp.(沙雷氏菌屬)、Staphylococcussciuri(松鼠葡萄球菌)、Rahnellasp.(拉恩氏菌屬)、Serratiasp.(沙雷氏菌屬)相似度為90%、99%、97%、96%、84%(如表2所示)?；蛐蛄屑皡⒈刃蛄袠?gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹得出(如圖5c所示):γ變形桿菌綱微生物Gamma proteobacteria為一大類群微生物,包括Serratiasp.(B)、Rahnellasp.(D)和Serratiasp.(E),芽孢桿菌綱Bacili為另一類群,包括Staphylococcussciuri(C)和Staphylococcussciuri(A)。其中Serratiasp.(E)存在發(fā)酵前期。Serratiasp.(B)、Rahnellasp.(D)存在發(fā)酵后期。Staphylococcussciurisp.(A)、Staphylococcussciuri(C)存在于發(fā)酵的全過程。

表3 發(fā)酵蔬菜微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征Table 3 Bacterial community structure characteristic of fermented cabbages microorganism

2.4.2 發(fā)酵白菜原核微生物群落結(jié)構(gòu)特征 物種多樣性指數(shù)(H)、豐富度指數(shù)(R)和均勻度(E)是應(yīng)用數(shù)學(xué)的方法來度量組成群落的種類數(shù)、個(gè)體總數(shù)以及各種群均勻程度的數(shù)量指標(biāo),從不同角度反映群落結(jié)構(gòu)特征的量度值,表明群落的組織結(jié)構(gòu)及其生態(tài)學(xué)特征,反映群落類型的不同,群落結(jié)構(gòu)的差異,群落演替的動(dòng)態(tài)變化[20]。使用Quantity One軟件進(jìn)行DGGE條帶分析,每條泳道內(nèi)的條帶數(shù)量用以評(píng)價(jià)物種豐富度(Species Richness),并通過條帶相對(duì)密度值計(jì)算物種均勻度(Species Evenness)及物種多樣性(Shannon)。

如表3所示,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),三種氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物指數(shù)呈不規(guī)則變化。11 d 4%的H低于6%,其他時(shí)間氯化鈉濃度6%的發(fā)酵泡菜H顯著低于4%和8%的。說明6%氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物多樣性低于4%和8%的。三種氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物均勻度指數(shù)(E)隨著發(fā)酵時(shí)間呈不規(guī)則的變化,4%氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物均勻度(E)呈上升趨勢(shì)。6%氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物均勻度(E)在發(fā)酵全過程中有較小幅度的上升趨勢(shì)。8%氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物均勻度(E)于發(fā)酵1 d較高，之后的3～15 d相近。說明6%氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物均勻度指數(shù)(E)較4%和8%的穩(wěn)定。8%氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物均勻度指數(shù)(E)較4%的穩(wěn)定。三種氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物豐富度指數(shù)(R)隨著發(fā)酵時(shí)間呈不規(guī)則變化,發(fā)酵全過程氯化鈉濃度6%的發(fā)酵泡菜R顯著低于4%和8%的。發(fā)酵初期4%發(fā)酵泡菜R高于8%的。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,6%氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物多樣性指數(shù)(H)、豐富度(R)指數(shù)在發(fā)酵全過程中低于4%和8%,均勻度(E)指數(shù)較4%和8%的穩(wěn)定。說明氯化鈉濃度6%的發(fā)酵泡菜在整個(gè)發(fā)酵期微生物群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定且微生物種類遠(yuǎn)不及氯化鈉濃度4%和8%。

2.4.3 白菜發(fā)酵不同時(shí)間原核微生物類型的聚類分析 運(yùn)用Quantity One軟件的“phylogenetic analysis”方式分析DGGE圖譜中電泳帶,根據(jù)UWPGA算法對(duì)三種氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜的不同時(shí)間的原核微生物類群進(jìn)行相似性聚類分析。圖6a表示氯化鈉濃度為4%的發(fā)酵泡菜不同時(shí)間樣品的DGGE電泳圖譜DNA條帶的聚類分析結(jié)果,發(fā)酵全過程聚為兩大類:發(fā)酵第1、3、5、7、9 d的發(fā)酵泡菜DNA條帶聚為一類,發(fā)酵第11、13、15、17 d的發(fā)酵泡菜DNA條帶聚為一類,說明原核微生物群落大致歸屬于兩大類群。白菜發(fā)酵根據(jù)微生物類群可分為兩個(gè)發(fā)酵階段,即發(fā)酵前期(1～9 d)和發(fā)酵后期(11～17 d)。

如圖6b所示,氯化鈉濃度為6%的發(fā)酵泡菜不同時(shí)間樣品的DGGE電泳圖譜DNA條帶的聚類分析結(jié)果,發(fā)酵全過程聚為兩大類:發(fā)酵第1、3、5、7、9、11 d的發(fā)酵泡菜DNA條帶聚為一類,發(fā)酵第13、15、17 d的發(fā)酵泡菜DNA條帶聚為一類,說明原核微生物大致歸屬于兩大類群。泡菜發(fā)酵根據(jù)微生物類群可分為兩個(gè)發(fā)酵階段。即發(fā)酵前期(1～11 d)和發(fā)酵后期(13～17 d)。

圖6c表示氯化鈉濃度為8%的發(fā)酵泡菜不同時(shí)間樣品的DGGE電泳圖譜DNA條帶的聚類分析結(jié)果,發(fā)酵全過程聚為兩大類:發(fā)酵第1、3、5、7、9 d的發(fā)酵泡菜DNA條帶聚為一類,發(fā)酵第11、13、15 d的發(fā)酵泡菜DNA條帶聚為一類,說明原核微生物群落大致歸屬于兩大類群。泡菜發(fā)酵根據(jù)微生物類群可分為兩個(gè)發(fā)酵階段。即發(fā)酵前期(1～9 d)和發(fā)酵后期(11～17 d)。

圖6 氯化鈉濃度4%、6%、8%的發(fā)酵泡菜16S rDNA V3片段的DGGE條帶相似性聚類圖Fig.6 DGGE stripe similarity clustering figure of fermented cabbages 16S rDNA V3 gene under 4%,6%,8% salt concentration

3 討論

蔬菜發(fā)酵初期首先是附著在原料表面的雜菌不斷生長(zhǎng)繁殖,主要有腸道菌屬、酵母菌屬等,同時(shí)乳酸菌也隨之增殖[1]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,雜菌的種類和數(shù)量減少,乳酸菌數(shù)量迅速增加,占細(xì)菌總數(shù)的比例不斷增加。發(fā)酵后期,泡菜中的微生物主要是乳酸菌[21-22]。邱致廣等[23]指出,發(fā)酵泡菜酸味與風(fēng)味物質(zhì)的形成主要取決于乳酸菌。乳酸菌對(duì)于發(fā)酵泡菜的發(fā)酵成熟起著至關(guān)重要的作用[24- 25],乳酸菌代謝作用對(duì)泡菜發(fā)酵有積極的作用[26]。如果泡菜發(fā)酵后期乳酸菌不是優(yōu)勢(shì)微生物,將引起發(fā)酵泡菜腐敗,導(dǎo)致泡菜發(fā)酵失敗[24]。本實(shí)驗(yàn)在氯化鈉濃度6%的發(fā)酵泡菜體系中Leuconostoccitreum、Unculturedbacterium、Leuconostocmesenteroides是泡菜發(fā)酵中期、后期的優(yōu)勢(shì)微生物。乳酸菌不僅有利于泡菜的正常發(fā)酵,而且導(dǎo)致發(fā)酵體系pH下降,從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了氯化鈉濃度6%的發(fā)酵泡菜體系中pH下降。在pH較低條件下,可能抑制一些不耐酸微生物類群的生長(zhǎng)繁殖,導(dǎo)致發(fā)酵泡菜微生態(tài)體系中微生物物種的豐富度、多樣性下降,此結(jié)果從DGGE圖譜分析計(jì)算的6%氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物多樣性指數(shù)(H)、豐富度(R)指數(shù)低于4%和8%得到證實(shí)。因?yàn)?%氯化鈉濃度發(fā)酵白菜中后期主要是乳酸菌類群,所以均勻度(E)指數(shù)較4%和8%的穩(wěn)定。氯化鈉濃度為6%樣品的PCR-DGGE電泳帶鑒定結(jié)果可知Enterobacteriaceaebacterium在發(fā)酵前期起作用,Leuconostoccitreum、Leuconostocmesenteroides存在發(fā)酵中、后期,Unculturedbacterium存在發(fā)酵后期,UnculturedEnterobactersp.、Pantoeasp. 存在發(fā)酵的全過程。Leuconostoccitreum、Unculturedbacterium、Leuconostocmesenteroides是泡菜發(fā)酵中期、后期的優(yōu)勢(shì)微生物。電泳帶基因鑒定的微生物隨著發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律與蔬菜發(fā)酵微生物變化的一般規(guī)律相符。運(yùn)用培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法統(tǒng)計(jì)不同氯化鈉濃度乳酸菌菌落數(shù)量結(jié)果可知,氯化鈉濃度為6%的白菜發(fā)酵體系中乳酸菌菌落數(shù)量高于4%和8%,說明氯化鈉濃度6%適合于白菜的發(fā)酵。

燕平梅[27]以不同時(shí)間的發(fā)酵甘藍(lán)液為材料,采用細(xì)菌和乳酸菌培養(yǎng)基平板分離細(xì)菌,從中挑取共50株形態(tài)不同的菌株進(jìn)行屬水平的鑒定,結(jié)果得出發(fā)酵甘藍(lán)液中有假單孢菌Pseudmonas、腸桿菌Escherichiacol、微球菌屬M(fèi)icrococcus、葡萄球菌屬Staphylococcus、明串珠菌屬Leuconostoc及乳桿菌屬Lactobacillus。說明DGGE電泳中回收電泳帶的分析鑒定與傳統(tǒng)的微生物分離鑒定結(jié)果一致。韓國的Lee[15]用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合變性梯度凝膠電泳的方法鑒定了韓國發(fā)酵白菜中主要的微生物為Weissellaconfusa、Leuconostoccitreum、Lactobacillussakei和Lactobacilluscurvatus。本實(shí)驗(yàn)在氯化鈉濃度6%的發(fā)酵泡菜體系中也發(fā)現(xiàn)了腸膜明串珠菌(lencuconostocmesenteroides),但未發(fā)現(xiàn)其他的乳酸菌,可能是由于韓國泡菜與我國泡菜的加工方法不同。

4 結(jié)論

6%氯化鈉濃度發(fā)酵泡菜微生物多樣性指數(shù)(H)、豐富度(R)指數(shù)在發(fā)酵全過程中低于4%和8%,均勻度(E)指數(shù)較4%和8%的穩(wěn)定。說明氯化鈉濃度6%的發(fā)酵泡菜在整個(gè)發(fā)酵期微生物群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定且微生物種類少于氯化鈉濃度4%和8%。

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Effect of concentration of sodium chloride in Chinese paocai on prokaryotic microbial community based on DGGE

YAN Ping-mei1,ZHANG Xiao-bing1,CHAI Zheng1,QIAO Hong-ping1, ZHAO Wen-jing1,WANG Dan-dan1,WANG Qi2

(1.Department of Biology,Taiyuan Normal University,Taiyuan 030012,China; 2.College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030031,China)

In order to explore the impacts of microbial communities in fermented pickle system,the experiment was conducted by taking 4%,6% and 8% as sodium chloride concentration to ferment pickle. Using DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)method and software of Quantity One to analyse Prokaryotic microbial community structure. And recycling the electrophoretic bands with strong fluorescence intensity and different time difference in DGGE which is measured to base sequence after cloning to be compared and identified with GeneBank sequence.The results showed that microbial diversity index(H),richness index(R)of sauerkraut fermented by 6% sodium chloride concentration in the fermentation process was lower than 4%’s and 8%’s,the index of evenness(E)was more stable than 4%’s and 8%’s. It showed the microbial community structure of sauerkraut fermented by 6% sodium chloride concentration in the fermentation period of microbial community structure was relatively stable and its microbial species is far less than 4% and 8% ‘s. From the DGGE electrophoretic band fluorescence intensity and the time of existence,it was found thatLeuconostoccitreum,Unculturedbacterium,Leuconostocmesenteroidesare dominant bacteria in the fermented cabbage system with 6% sodium chloride concentration.LeuconostoccitreumandLeuconostocmesenteroidesbelong to lactic acid. The lactic acid bacteria with 4% and 8% sodium chloride concentration in fermented cabbage did not become a dominant microorganism. It shows that the changes of prokaryotic microbial community in fermented cabbage with 6% concentration sodium chloride are closer to natural fermented vegetables’ microbial variation comparing with 4% and 8% concentration sodium chloride,so the research indicated that 6% sodium chloride concentration is more beneficial to the fermentation of cabbage.

fermentation;cabbage;DGGE;prokaryotic microbial communities

2016-10-19

燕平梅(1968-), 女，博士, 教授, 主要從事微生物生態(tài)學(xué)方面的研究，E-mail:yanpingmei1968@163.com。

國家自然基金項(xiàng)目(31171743);山西省基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目(2014091003-0107)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)11-0144-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.019