文景芝，揭?guī)r，田苗，陳宇飛，張斌，丁俊杰，顧鑫，武文旭，吳迪，趙鈺琦，高新穎

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江佳木斯154007）

黑龍江省東部大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)及其時空動態(tài)

文景芝1，揭?guī)r1，田苗1，陳宇飛1，張斌1，丁俊杰2，顧鑫2，武文旭1，吳迪1，趙鈺琦1，高新穎1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江佳木斯154007）

為明確大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)及其時空變化規(guī)律，連續(xù)3年對黑龍江省東部4個具有代表性地塊樺南縣土龍山鎮(zhèn)生產(chǎn)田Ht、樺南縣曙光一隊生產(chǎn)田Hs、黑龍江省農(nóng)科院佳木斯分院大豆品種試驗田Jn和農(nóng)墾科學(xué)院大豆品種試驗田Nk土樣，采用葉碟誘捕法分離其中的大豆疫霉，利用一套含單個不同抗病基因的大豆近等基因系，通過國際通用下胚軸傷口接種法鑒定大豆疫霉生理小種。結(jié)果表明，379株大豆疫霉分別屬于105種致病型，其中包括24個生理小種，1種IRT和80種新致病型，每種致病型優(yōu)勢度不明顯。24個生理小種中，0、10、14和40號小種為中國首次報道。供試大豆疫霉群體對單個Rps基因的致病頻率顯示，在黑龍江省東部種植含有Rps7基因的大豆品種風(fēng)險較高，而種植含有Rps1c、Rps1k和Rps3a基因的大豆品種較安全。隨著時間推移，黑龍江省東部大豆疫霉單個菌株聚合對更多Rps基因毒性，單個菌株毒性增強(qiáng)。大豆疫霉群體毒性結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且隨時間推移群體毒性也增強(qiáng)?？臻g上，生產(chǎn)田大豆疫霉群體較試驗田群體毒性結(jié)構(gòu)更復(fù)雜多樣。

大豆疫霉；生理小種；群體結(jié)構(gòu)；時空動態(tài)；黑龍江東部

由大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann）侵染引起的大豆疫霉根腐?。≒hytophthora root and stem rot）于1948年首次在美國印第安納州發(fā)現(xiàn)[1]，我國1989年在東北大豆產(chǎn)區(qū)分離到大豆疫霉[2]，該病目前已成為危害黑龍江省大豆生產(chǎn)主要病害之一[3]。大豆疫霉是典型土傳病原卵菌，卵孢子可在土壤中存活數(shù)年[4]，高溫高濕土壤環(huán)境可促使卵孢子萌發(fā)產(chǎn)生游動孢子囊，釋放游動孢子侵染大豆[5]。大豆疫霉在自然界僅侵染栽培大豆，其與寄主大豆間互作滿足基因?qū)驅(qū)W說[6]。迄今為止，已鑒定出至少26個抗大豆疫霉基因（Rps基因）[7]。利用一套含有單個不同抗病基因（Rps基因）的大豆近等基因系可有效鑒定大豆疫霉生理小種。國內(nèi)外已鑒定至少59個生理小種和眾多新致病型[8-10]。中國已鑒定出至少30個生理小種，包括1～9、11、13、15、17、21、23～26、29、33、34、38～39、42～45、48～49和54號小種[11-15]，除6和7號外的28個小種在黑龍江省均有報道，截止到2010年，1號小種一直為黑龍江省優(yōu)勢小種[16-19]。近年來黑龍江省大豆疫霉根腐病研究較多，但研究者采樣地點不同，數(shù)據(jù)零散，系統(tǒng)性不足。黑龍江省大豆疫霉根腐病主要發(fā)生在東部地區(qū)[20]，為揭示大豆疫霉毒性結(jié)構(gòu)年度變化規(guī)律，定點調(diào)查東部發(fā)病嚴(yán)重的兩塊大豆生產(chǎn)田和兩塊大豆品種試驗田，連續(xù)3年對土壤中大豆疫霉作誘捕分離和生理小種鑒定，分析大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)及時空間變化規(guī)律，為利用品種抗病基因控制黑龍江省大豆疫霉根腐病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

取樣地點為黑龍江省東部嚴(yán)重發(fā)病的兩塊大豆生產(chǎn)田，分別位于樺南縣土龍山鎮(zhèn)（Ht，130.39N，46.26E）和樺南縣曙光一隊（Hs，130.32N，46.17E），兩塊大豆品種試驗田，分別位于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院（Jn，130.24N，46.47E）和黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院（Nk，130.25N，46.46E）。于2014～2016年7～8月在4個地塊固定區(qū)域（低洼處）隨機(jī)取大豆疫霉根腐病典型病株根圍土壤。取樣時拔掉病株，去除根部表土，取5～10 cm深處土壤。若病株少或無病株，則在健康大豆植株根圍取土樣。每個地塊至少隨機(jī)取樣10份，帶回實驗室陰干備用。

1.2 大豆疫霉分離及致病性鑒定

土壤中大豆疫霉分離參照王子迎等葉碟誘捕法[21]。取單孢菌株目標(biāo)菌絲顯微鏡下觀察，若菌絲無隔，直角分支，平均寬3.5 μm，產(chǎn)生球形菌絲膨大體（平均直徑23 μm）和同宗配合卵孢子（直徑30～35 μm），在水中產(chǎn)生無乳突、不脫落、倒梨形孢子囊（35～58 μm×34～45 μm），則初步認(rèn)定為大豆疫霉[22]。將目標(biāo)菌落轉(zhuǎn)移至CA培養(yǎng)基上純化4～6次。采用劉春來等大豆疫霉特異性引物5'-CTGGA TCATGAGCCCACT-3'/5'-TCTCCATCCACCGACTA CA-3'將獲得菌株作PCR檢測，產(chǎn)生288 bp條帶則認(rèn)定為大豆疫霉[23]。將單孢菌株回接感病大豆品種Sloan作致病性測定[24]，綜合發(fā)病癥狀及重分離培養(yǎng)物形態(tài)學(xué)特征，將確認(rèn)大豆疫霉菌株移至CA斜面15℃保存。

1.3 生理小種鑒定

大豆疫霉生理小種鑒定采用國際通用下胚軸傷口接種法[21]。鑒別寄主為8個含有單個不同抗病基因（Rps基因）的大豆近等基因系，分別為Harlon（Rps1a），Harosoy 13XX（Rps1b），Williams 79（Rps1c），PI103091（Rps1d），Williams 82（Rps1k），Chapman（Rps3a），Harosoy62XX（Rps6）和Harosoy（Rps7），以Sloan（rps）為感病對照[25]。參照朱振東等方法調(diào)查各菌株與8個鑒別寄主互作反應(yīng)結(jié)果，列出感病互作中Rps基因，即為該菌株致病型（pathotype）[26]，對照Grau（2004）生理小種鑒定表，確定對應(yīng)生理小種號[27]。試驗作3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用數(shù)據(jù)分析軟件population genetic analysis 1.3.2的Shannon's Information index選項計算多樣性指數(shù)。利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件UPGMA方法作聚類分析并建立聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑龍江省東部大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 大豆疫霉生理小種多樣性

2014～2016年從黑龍江省東部4個代表性地塊土壤樣品中共分離379株大豆疫霉。8個單基因鑒別寄主接種鑒定結(jié)果顯示，379個菌株分別屬于105種致病型，每種致病型分離頻率為0.3%～4.0%，優(yōu)勢度不明顯。根據(jù)Grau等生理小種鑒定表[27]，29.6%菌株為24個已知生理小種，其中0、10、14和40號小種為中國首次報道。69.9%菌株為80種新致病型，每種新致病型分離頻率為0.3%～4.0%，優(yōu)勢度不明顯。其中致病型1k，7和1a，3a分離頻率位居一二，分別為4.0%和3.7%。0.5%菌株為中間反應(yīng)型（Intermediate reaction type，IRT）（見表1）。

表1 2014～2016年從379個菌株中鑒定出生理小種、IRT和新致病型及其分離頻率Table 1Races,IRT and new pathotypes of Phytophthora sojae identified from 379 isolates from 2014 to 2016

2.1.2 大豆疫霉對8個Rps基因致病頻率

379個菌株對8個Rps基因致病頻率為24%～56%（見表2）。＜30%菌株對Rps1c（29%）、Rps1k（24%）和Rps3a（28%）有毒性，＞50%菌株對Rps7（56%）有毒性，對其余4個Rps基因致病頻率為30%～40%?？梢姡蠷ps1c、Rps1k和Rps3a基因大豆品種比較安全，而含有Rps7基因大豆品種感染風(fēng)險較高。

表2 379株大豆疫霉對單個Rps基因及Rps基因組合致病頻率Table 2Virulence frequencies of 379 Phytophthora sojae isolates to single Rps gene and Rps genes combination

2.1.3 大豆疫霉群體致病力

大豆疫霉群體可擊毀0～8個Rps基因（見表2），擊毀0～4個Rps基因菌株數(shù)占87.0%，而擊毀5～8個Rps基因菌株數(shù)占13.0%。可見大豆疫霉群體毒力偏弱。

2.2 黑龍江省東部大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)時間動態(tài)

2.2.1 生理小種年度間差異

不同年份鑒定出的生理小種種類和數(shù)量差異較大。值得注意的是僅1號小種連續(xù)3年持續(xù)穩(wěn)定分離到，出現(xiàn)頻率依次為3.2%、2.1%和5.6%，有遞增趨勢。1號小種僅對Rps7基因有毒性，除此之外其他小種也對Rps7基因有毒性（見表1），因此在黑龍江省東部Rps7基因無應(yīng)用價值；3、5和13號小種同時出現(xiàn)在2014和2015年，29號小種同時出現(xiàn)在2014和2016年，這4個小種2014～2015年重疊率75%，2014和2016年重疊率25%，說明2014與2015年小種重疊較多，而與2016年重疊較少，2016年小種發(fā)生較大變異；其余19個小種僅出現(xiàn)在一年，2014年分離5個小種，2015年分離4個小種，2016年分離10個小種，2016年新小種顯著增多，說明生理小種隨時間推移發(fā)生顯著變異。從各年度生理小種多樣性指數(shù)看，2014～2016年多樣性指數(shù)依次為0.4499、0.4551和0.5191，多樣性指數(shù)越大，毒性變異度越大。可見隨時間推移，生理小種越來越復(fù)雜多樣。

2.2.2 毒性結(jié)構(gòu)年度間演變

分析24個小種致病型，0號小種對8個Rps基因均無毒，1號小種僅對Rps7有毒性，其他22個小種除對Rps7有毒外，還對其他1～7個Rps基因有毒性?？梢娖渌?2個小種是在1號小種基礎(chǔ)上聚合對更多Rps基因毒性演變而來。

3年分離鑒定小種不同，分析發(fā)現(xiàn)，2015年新增4個小種，其中1個小種由2014年小種聚合或失去對某些Rps基因毒性演變而來，如2015年11號小種（1b，6，7）既可由2014年13號小種（6，7）聚合對Rps1b毒性，也可由23號小種（1a，1b，6，7）失去對Rps1a毒性演變而來。其他3個小種均由2014年小種聚合對某些Rps基因毒性演變而來，如2015年8號小種（1a，1d，6，7）由2014年13號小種（6，7）聚合對Rps1a，1d毒性演變而來等。

2016年12個小種僅1號小種與2014和2015年相同，29號與2014年相同，其他10個小種僅0號小種（Avr）由2015年1號小種（7）失去對Rps7的毒性演變而來；5個小種由2014或2015年小種聚合或失去對某些Rps基因毒性演變而來；其余4個小種均由2014和2015年小種聚合對某些Rps基因毒性演變而來，如2016年38號小種（1a，1b，1c，1d，1k，3a，6，7）由2015年45號小種（1a，1b，1c，1k，6，7）聚合對Rps1d，3a毒性演變而來等（見表1）。隨時間推移，大豆疫霉單個菌株聚合對更多Rps基因毒性，單個菌株毒性增強(qiáng)。

2.2.3 群體致病力時間動態(tài)

2016年大豆疫霉可擊毀0～8個Rps基因，較2015和2014年增多，表明隨時間推移，大豆疫霉群體致病力增強(qiáng)，出現(xiàn)1個可擊毀全部8個Rps基因菌株。2016年可擊毀1～4個Rps基因的菌株數(shù)占81%，較2015和2014年分別降低3.2%和11.4%；2016年可擊毀5～8個Rps基因的菌株數(shù)占17.4%，較2015和2014年分別提高1.6%和9.8%（見表3）。進(jìn)一步說明隨時間推移大豆疫霉群體致病力增強(qiáng)。

表3 2014～2016年大豆疫霉對Rps基因組合的致病頻率Table 3Virulence frequencies of Phytophthora sojae isolates to Rps genes combination from 2014 to 2016

2.3 黑龍江省東部大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)空間動態(tài)

2.3.1 生產(chǎn)田和試驗田生理小種差異

不同田塊大豆疫霉生理小種種類和數(shù)量不同。6個小種同時存在生產(chǎn)田和試驗田中，分別是1、2、5、13、24和39號。10個小種單獨(dú)存在于生產(chǎn)田，8個小種單獨(dú)存在于試驗田（見表4），可見生產(chǎn)田和試驗田小種數(shù)量差異不大，但毒性結(jié)構(gòu)差異較大，相異性為75%。生產(chǎn)田和試驗田菌株在毒性結(jié)構(gòu)上有較大程度重疊。將生產(chǎn)田和試驗田菌株毒性作聚類分析，當(dāng)遺傳距離為0.61時，分為4個聚類組，其中兩大組同時包含生產(chǎn)田和試驗田菌株，兩個地塊菌株毒性存在重疊，另外兩組分別僅包含生產(chǎn)田1個菌株（見圖1），說明生產(chǎn)田菌株毒性結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。

表4 生產(chǎn)田和試驗田鑒定的生理小種及其分離頻率Table 4The races and virulence frequencies of Phytophthora sojae isolates in different fields

圖1 生產(chǎn)田與試驗田菌株毒性聚類分析Fig.1Dendrogram of the relation among Phytophthora sojae isolates in production field and experimental field based on virulence

生產(chǎn)田3年累計有54個菌株鑒定出16個小種，多樣性指數(shù)為0.5176，試驗田有58個菌株鑒定出14個小種，多樣性指數(shù)為0.4583。因此生產(chǎn)田大豆疫霉群體毒性結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。

2.3.2 生產(chǎn)田和試驗田群體致病力差異

生產(chǎn)田群體分別可擊毀0～7個Rps基因，而試驗田群體可擊毀1～8個Rps基因。生產(chǎn)田可擊毀0～4個Rps基因的菌株數(shù)占86.9%，試驗田為87.3%；生產(chǎn)田可擊毀5～8個Rps基因的菌株數(shù)占13.1%，試驗田為12.7%（見表5）?？梢娚a(chǎn)田和試驗田大豆疫霉群體致病力基本相當(dāng)。

表5 生產(chǎn)田和試驗田大豆疫霉群體對Rps基因組合致病頻率Table 5Virulence frequencies of Phytophthora sojae population from different fields to Rps gene combinations

3 討論

大豆疫霉為典型土傳病原菌[28]。一株大豆可同時感染多個不同致病型菌株，但土壤中存在對當(dāng)年所種植大豆品種無毒的菌株，因此病株分離大豆疫霉僅代表土壤中大豆疫霉群體一部分。本試驗利用不含任何抗病基因大豆品種葉片誘捕土壤中大豆疫霉，分析土壤中大豆疫霉群體毒性結(jié)構(gòu)及其隨時空變化規(guī)律，全面反映土壤中大豆疫霉情況。

大豆疫霉常與土壤中多種鐮孢菌（Fusarium spp.）和腐霉菌（Pythium spp.）復(fù)合侵染大豆引起根腐病[29]。大豆疫霉在培養(yǎng)基上生長緩慢，易被其他快速生長病原菌或腐生菌覆蓋，分離純化并獲得單孢株（尤其從土壤中）難度較大。本試驗改良土壤分離大豆疫霉方法，在土樣處理時加入與選擇性培養(yǎng)基相同藥劑，提高分離效率。

關(guān)于大豆疫霉優(yōu)勢生理小種，各國差異較大，如美國優(yōu)勢小種為1、10、15和24號[30]，加拿大為25號[31]，澳大利亞和阿根廷均為1號[18]，我國優(yōu)勢小種早期認(rèn)定為1號[16-19]，3號在黑龍江省出現(xiàn)頻率也較高[25]，但田苗近期發(fā)現(xiàn)黑龍江大豆疫霉群體具有綜合毒力，小種優(yōu)勢度并不明顯[25]。本研究從379個菌株中鑒定出24個生理小種，其中0、10、14和40號小種為中國首次報道。1號小種在本研究中分離頻率僅為3.6%，位居第二，原因可能是1號小種毒性結(jié)構(gòu)簡單，僅對Rps7有毒，而其他小種均在1號小種基礎(chǔ)上，聚合對更多Rps基因毒性后演變而來。由此說明隨時間推移，黑龍江省東部大豆疫霉毒性結(jié)構(gòu)日漸復(fù)雜，單個菌株即可擊毀更多Rps基因，群體毒性不斷增強(qiáng)，此結(jié)論與田苗一致。

黑龍江省東部大豆疫霉群體可擊毀0～8個Rps基因，擊毀0～4個Rps基因菌株數(shù)占87.0%，而擊毀5～8個Rps基因菌株數(shù)占13.0%，可見黑龍江省東部大豆疫霉群體毒力偏弱。黑龍江省東部大豆疫霉群體對8個Rps基因致病頻率范圍從2014年20%～53%到2015年19%～65%再到2016年27%～52%，2016年致病頻率范圍變窄，即曾經(jīng)有效Rps基因逐漸失去抗病優(yōu)勢而風(fēng)險性較高的Rps基因風(fēng)險性略有降低。對4個Rps基因致病頻率提高2%～28%，對3個Rps基因致病頻率降低1%～5%，對1個Rps基因致病頻率保持不變，說明黑龍江省東部大豆疫霉對單個Rps基因毒力微弱增強(qiáng)。2014年可在黑龍江應(yīng)用的Rps基因（Rps1b、Rps1k）逐漸失去抗病優(yōu)勢，而2014年風(fēng)險性較高的Rps7基因在2016年依舊較高。2016年同時出現(xiàn)全毒和全無毒小種，預(yù)示黑龍江省東部可能存在某些中強(qiáng)毒性菌株且可同時克服多個Rps基因，而應(yīng)用單一Rps基因或?qū)隉o效，一旦中強(qiáng)毒性菌株成為大豆疫霉根腐病菌優(yōu)勢群體，將對黑龍江省大豆生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[32]。因此在黑龍江東部大豆生產(chǎn)中，應(yīng)利用風(fēng)險性較低Rps基因培育抗病品種。從大豆育種長期角度考慮，利用新發(fā)掘和風(fēng)險性較低Rps基因培育含有2個或2個以上抗病基因品種。在合理利用抗病基因同時，重視耐病品種選育，降低對大豆疫霉的選擇壓力，延長抗病基因使用壽命。

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Spatial-temporal dynamics of Phytophthora sojaeon population struc-ture in the east of Heilongjiang Province

/WEN Jingzhi1,JIE Yan1,TIAN Miao1,CHEN Yufei1,ZHANG Bin1,DING Junjie2,GU Xin2,WU Wenxu1,WU Di1,ZHAO Yuqi1,GAO Xinying1(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy ofAgricultural Sciences,Jiamusi Heilongjiang 154007,China)

In order to clarify the spatial-temporal dynamics of population structure ofPhytophthora sojaein Heilongjiang Province,the soil samples of four typical fields,including the production fields of Ht and Hs and the experimental fields of Jn and Nk,were isolated forPhytophthora sojaeby using a modified leaf disc baiting method.The pathotypes of theP.sojaeisolates were determined by using the universal hypocotyl inoculation method on a set of soybean near-isogenic line which had eight different Rpsalleles.The investigation showed that 379 isolates belonged to 105 pathotypes which included 24 races,1 IRT and 80 new pathotypes.The dominance of each pathotype was not obvious.Race 0,10, 14 and 40 were the first report in China.The virulence frequencies of the testedP.sojaepopulation to each singleRspgene showed that soybean cultivars containingRps7 gene would have a higher risk and these containingRps1c,Rps1k,andRps3a genes were more secure than the other fiveRpsgenesin the east of Heilongjiang.P.sojaein the east of Heilongjiang tended to integrate more virulence toRps genes within individual isolate with time,which resulted in appearance of more virulent isolates.The virulence composition ofP.sojaepopulation in the east of Heilongjiang became more complicated and more virulent with time.Compared with the experimental fields,the virulence structure ofP.sojae population from production fields was more complex.

Phytophthora sojae;race;population structure;spatial-temporal dynamics;the east of Heilongjiang

S435.651

A

1005-9369（2017）05-0001-08

時間2017-5-23 12:23:36[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170523.1223.002.html

文景芝,揭?guī)r,田苗,等.黑龍江省東部大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)及其時空動態(tài)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,48(5):1-8.

Wen Jingzhi,Jie Yan,Tian Miao,et al.Spatial-temporal dynamics ofPhytophthora sojaeon population structure in the east of Heilongjiang Province[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(5):1-8.(in Chinese with English abstract)

2017-03-30

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303018）；國家自然科學(xué)基金（31370449,31670444）

文景芝（1964-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為大豆疫霉。E-mail:jzhwen2000@163.com