張英華，劉艷樂，劉天舒，朱敏

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱150030）

RP-HPLC測定乳清蛋白糖基化產(chǎn)物中的氨基葡萄糖

張英華，劉艷樂，劉天舒，朱敏

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱150030）

利用酸水解釋放出的糖基化產(chǎn)物中氨基葡萄糖，采用Elite C18色譜柱分離，以68%的0.025 mol·L-1pH 3.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和32%甲醇作為流動相等度洗脫，流速為1 mL·min-1，進樣體積10 μL，柱溫35℃。定量分析結(jié)果表明，氨基葡萄糖0.1～100 μg·mL-1與氨基葡萄糖峰面積線性關系良好（R2=0.9998）；以0.3、0.5、1.0 mg 3個添加水平作回收試驗，氨基葡萄糖平均回收率為88.05%～110.79%，相對標準偏差為2.45%～5.92%；氨基葡萄糖檢出限為0.02 μg·mL-1。糖基化乳清蛋白中氨基葡萄糖含量為2.03 mg·g-1。RP-HPLC測定法用于乳清蛋白-氨基葡萄糖糖基化產(chǎn)物制備條件優(yōu)化，方法簡單、重復性好、靈敏度高，可用于蛋白質(zhì)-氨基葡萄糖糖基化產(chǎn)物中氨基葡萄糖含量分析測定。

反相高效液相色譜；乳清蛋白；氨基葡萄糖

Key words:reversed-phase high-performance liquid chromatography(RP-HPLC);whey protein; glucosamine

乳清蛋白是牛乳中含量較高的主要成份之一[1]，在pH等電點處除去沉淀酪蛋白后的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為乳清蛋白。其含量約占乳蛋白質(zhì)18%～20%，營養(yǎng)價值高、易消化。氨基葡萄糖是葡萄糖一個羥基被氨基取代后化合物，來源廣泛，由于其分子質(zhì)量較小，在糖存在蛋白溶液反應體系中更易擴散，是蛋白質(zhì)糖基化重要前體。將乳清濃縮蛋白與羧甲基纖維素混合物60℃下反應5 d，可顯著提高結(jié)合物乳化穩(wěn)定性[2]。Jiang等將氨基葡萄糖與豌豆蛋白美拉德反應作交聯(lián)，結(jié)果顯示，氨基葡萄糖導入可提高豌豆蛋白體外消化性[3]。Jiang等將氨基葡萄糖分別導入大豆蛋白和酪蛋白結(jié)果表明，糖基化交聯(lián)蛋白質(zhì)溶解性和乳化性均提高，其中流變性質(zhì)增大顯著[4-5]。糖基化對乳清蛋白抗原性作用中美拉德反應糖基化產(chǎn)物可降低β-乳球蛋白和α-乳白蛋白致敏性[6]?？梢?，蛋白質(zhì)-多糖美拉德反應產(chǎn)物可保留蛋白質(zhì)表面活性，具備多糖親水性能，其乳化活性和熱穩(wěn)定性良好，蛋白質(zhì)致敏性低。由于糖基賦予糖基化蛋白重要功能，將乳清蛋白與氨基葡萄糖通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶糖基化，乳清蛋白糖基化產(chǎn)物可改變?nèi)榍宓鞍坠δ苄再|(zhì)。但糖基化蛋白中氨基葡萄糖釋放和定量檢測是關鍵問題。

還原糖常規(guī)方法無法精確定量糖基化產(chǎn)物中氨基葡萄糖含量。氨基糖分析方法有滴定分析法、比色法、HPLC法等，但滴定分析法適用常量組分分析測定且系統(tǒng)誤差較大；國內(nèi)較多利用比色法，即氨基葡萄糖伯氨基乙?；笤倥c顯色劑反應[7]，但操作繁瑣。高效液相色譜衍生化法采用反相柱氨基柱示差檢測器檢測或柱前衍生化后利用紫外或熒光檢測器測定含量[8-9]，用于樣品常量、微量和痕量組分測定。其中衍生化步驟尤為重要，測定氨基糖衍生試劑很多[10-11]。Yan等定量測定殼聚糖含量時衍生試劑為琥珀酰亞胺[12]；Stepan等選用鄰氨基苯甲酸和吡唑啉酮[13]，但樣品前處理過程繁瑣。Guan等采用衍生試劑鄰苯二甲醛和巰基丙酸建立可靈敏、高效檢測人尿中氨基葡萄糖液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法[14]；Eikenes等利用鄰苯二甲醛作衍生試劑，經(jīng)色譜分離和熒光檢測器測定殼聚糖含量[15]。但都存在糖基化產(chǎn)物葡萄糖釋放不充分、鄰氨基苯甲酸和吡唑啉酮等衍生試劑有易致毒性、檢測操作繁瑣、分析方法不精確等不足。本研究采用鹽酸水解充分釋放糖基化乳清蛋白中氨基葡萄糖，鄰苯二甲醛作柱前衍生，通過反相高效液相色譜法（RP-HPLC）精確測定蛋白水解物中氨基葡萄糖含量，為糖基化蛋白中氨基糖檢測提供新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀（Waters 2695），包括熒光檢測器、Empower數(shù)據(jù)處理軟件（購自美國Waters公司）；Milli-QR Gradient超純水凈化器（購自美國MILLIPORE公司）；HH-S水浴恒溫振蕩器（購自鞏義市予華儀器有限公司）。

色譜柱（購自大連依利特有限公司），GL-21M高速冷凍離心機（購自上海市離心機械研究所），DELTA 320型pH計（購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

乳清濃縮蛋白（WPC，購自北京泛亞乳品公司）：蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)79.86%；氨基葡萄糖（阿拉?。悍肿淤|(zhì)量215.63 ku；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase）：酶活力110 U·g-1；濃鹽酸、鄰苯二甲醛（OPA）、三巰基丙酸，硼砂，冰乙酸、三水乙酸鈉，氫氧化鈉（均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，購自天津市科密歐試劑有限公司）；試驗用水均為超純水。

線性對照品溶液：精密稱取氨基葡萄糖鹽酸鹽25 mg，置于25 mL燒杯中，加水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中搖勻定容至刻度，作為對照品溶液儲備液。精密量取對照品溶液儲備液，用水分別稀釋成濃度為1、5、10、20和40 μg·mL-1線性對照品，溶液于4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

衍生試劑：50 mg OPA、1 mL甲醇和0.1 mL 3-巰基丙酸溶于10 mL pH 9.3硼砂-氫氧化鈉緩沖液（0.05 mol·L-1硼酸根）中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 RP-HPLC條件確定

色譜柱：Elite C18（Hypersil ODS 25 um 4.6 mm×250 mm）。

1.2.1 流動相pH確定

流動相A：甲醇；流動相B：0.025 mol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖液；pH 3.6、3.8、4.0、4.2、4.6、5.0，使用前超濾、超聲處理A∶B為32∶68，流速1 mL·min-1，檢測時間20 min，柱溫35℃，進樣量10 μL。

檢測器：熒光檢測器激發(fā)波長337 nm，發(fā)射波長454 nm。

1.2.2 流動相體積比確定

流動相A：甲醇；流動相B：0.025 mol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖液；pH 3.6；A∶B分別取體積比為68∶32、50∶50、32∶68，流速1 mL·min-1，35℃柱溫，檢測時間設定為20 min，進樣量為10 μL。在熒光檢測器相應激發(fā)波長和發(fā)射波長下檢測。

1.3 樣品制備與前處理

1.3.1 樣品制備

4%（w/v）乳清蛋白溶液中添加氨基葡萄糖至3 mmol氨基葡萄糖/克乳清蛋白（每克乳清蛋白約含1 mmol酰胺基團），保證反應中蛋白質(zhì)酰基供體與?；荏w氨基葡萄糖物質(zhì)量比例為1∶3，用2 mol·L-1NaOH調(diào)pH至7.5。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加量為10 kU·kg-1乳清蛋白，反應體系充分混勻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)水平搖床振蕩，反應時間為4 h。反應結(jié)束后，取出樣品，于80℃水浴鍋中滅酶10 min，冷卻。pH調(diào)至5.0，加入等體積乙醇離心10min，回收沉淀，并用無水乙醇洗滌2次，除去未結(jié)合氨基葡萄糖，pH調(diào)回7.0后凍干樣品。

1.3.2 樣品前處理時間確定

精密稱取乳清蛋白-氨基葡萄糖糖基化修飾產(chǎn)物60 mg，置于水解瓶中，加入6 mol·L-1鹽酸5 mL并密封，100℃下水解4、5、6、7和8 h，水解結(jié)束后取水解液1 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，用超純水定容至25 mL。

1.3.3 空白溶液前處理

取原料乳清蛋白60 mg，置于水解瓶中，加入6 mol·L-1鹽酸5 mL并密封，100℃下與樣品水解相同時間，水解結(jié)束后取水解液1 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，用超純水定容至25 mL。

1.3.4 樣品和空白溶液衍生

準確移取0.3 mL樣品（空白溶液）于棕色瓶中并加入0.7 mL pH 9.3硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液（0.05 mol·L-1硼酸根）和0.3 mL衍生試劑混勻，置于25℃暗處衍生15 min，0.45 μm微孔濾膜過濾后上樣。

1.4 方法學驗證

通過添加回收率試驗作方法學驗證，驗證線性范圍、回收率、精密度和檢出限等效能指標。

1.5 HPLC在乳清蛋白-氨基葡萄糖糖基化產(chǎn)物制備條件優(yōu)化中應用

采用優(yōu)化條件作樣品鹽酸水解、柱前衍生和HPLC，定量分析乳清蛋白糖基化修飾產(chǎn)物中導入氨基葡萄糖含量，以氨基葡萄糖導入量指標，優(yōu)化乳清蛋白濃度、酶添加量等修飾產(chǎn)物制備條件。

乳清蛋白濃度選擇：反應體系中不同乳清蛋白濃度（30、40和50 g·L-1）與氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液混合，保證乳清蛋白?；w與?；荏w物質(zhì)的量比為1∶3（每克乳清蛋白能夠提供約1 mmol酰胺基團，每克氨基葡萄糖能夠提供4.64 mmol伯胺基團），TGase添加量為10 U·g-1乳清蛋白，pH為7.5，37℃恒溫水浴震蕩反應4 h。反應結(jié)束后，取出樣品，置于85℃水浴鍋中滅酶5min，冷卻。調(diào)節(jié)溶液pH至5.0，加入等體積無水乙醇離心10 min，收集沉淀，乙醇洗2次，在6 mol·L-1鹽酸加入后100℃下水解4h，鄰苯二甲醛衍生試劑衍生，優(yōu)化HPLC分析修飾產(chǎn)品中氨基葡萄糖導入量。

TGase添加量選擇：50 g·L-1乳清蛋白與氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液混合，使?；w與受體比例為1∶3，TGase添加量分別為5、10和20 U·g-1乳清蛋白，37℃恒溫水浴震蕩反應4 h，反應結(jié)束后，取出樣品，85℃水浴滅酶5 min，冷卻。其余反應條件同上并用HPLC分析修飾產(chǎn)品中氨基葡萄糖導入量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件優(yōu)化

2.1.1 流動相pH確定

氨基葡萄糖與蛋白質(zhì)水解后氨基酸結(jié)構(gòu)相似，通過合適色譜分析條件將氨基葡萄糖與蛋白質(zhì)水解后生成氨基酸分離。分別研究不同pH 0.025 mol·L-1乙酸乙酸鈉緩沖溶液（pH 3.6、3.8、4.0、4.2、4.6和5.0）和甲醇溶液（體積比為68∶32）為流動相對樣品溶液作色譜分離。結(jié)果表明，以0.025 mol·L-1pH 3.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和甲醇溶液體積比為68∶32作流動相時，氨基葡萄糖和氨基酸分離效果和峰形較好，保留時間理想。樣品分析色譜圖見圖1。以其他pH條件作流動相時，氨基葡萄糖和氨基酸分離效果較差，分離度小，保留時間較長，峰形不理想并出現(xiàn)拖尾。

2.1.2 流動相體積比確定

分別研究流動相A（甲醇）與流動相B（0.025 mol·L-1）、pH 3.6醋酸-醋酸鈉緩沖液以不同體積比A∶B（68∶32、50∶50、32∶68）為流動相對樣品溶液作色譜分離。結(jié)果表明，以0.025 mol·L-1pH 3.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和甲醇溶液體積比為68∶32作流動相時，氨基葡萄糖和氨基酸分離效果和峰形較好，保留時間理想。以其他體積比條件作流動相時，氨基葡萄糖與氨基酸分離效果較差。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 水解時間優(yōu)化

水解過程需使氨基葡萄糖得到最大程度釋放，本試驗分別研究水解時間為4、5、6、7和8 h樣品溶液，經(jīng)高效液相色譜分析結(jié)果表明，水解4 h后，氨基葡萄糖含量基本不變，說明4 h時乳清蛋白-氨基葡萄糖糖基化產(chǎn)物中氨基葡萄糖已完全水解釋放，100℃下水解時間選擇4 h。

圖1 氨基葡萄糖標準溶液、乳清蛋白糖基化產(chǎn)物HPLC分析Fig.1HPLC profiles of from a standard solution(A)and glycosylated whey protein concentrate(B)

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系

取1.1配制濃度為1、5、10、20和40 μg·mL-1線性對照品溶液，同樣經(jīng)衍生處理后作色譜分析，氨基葡萄糖標準曲線見圖2。以氨基葡萄糖峰面積（Y）與氨基葡萄糖質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）作線性回歸，經(jīng)Empower數(shù)據(jù)處理軟件分析處理，0.02～1.00 mg·mL-1線性關系良好。線性回歸方程為Y= 9.3038X+1.2668，R2=0.9998。

2.3.2 回收率、精密度和檢出限

分別稱取60 mg原料乳清蛋白，分別添加標準氨基葡萄糖0.3、0.5和1.0 mg，加入鹽酸水解4 h，以不添加氨基葡萄糖原料乳清蛋白測定值為背景值，檢測后扣除背景值，計算方法回收率。結(jié)果見表1，平均添加回收率為88.05%～110.79%，RSD為2.45%～5.92%。

取濃度為1、10和20 μg·mL-1標準氨基葡萄糖溶液衍生處理，每種濃度重復進樣6次，計算方法精密度。結(jié)果見表2，保留時間RSD為0.49%～1.00%、峰面積RSD為2.66%～3.73%。說明該方法精密度良好。本方法線性范圍下限0.1 μg·mL-1時S/ N＞10，確定定量限為0.1 μg·mL-1；以S/N=3計算方法檢出限，得到氨基葡萄糖檢出限為0.02 μg· mL-1，表明此方法具有較高靈敏度。

圖2 氨基葡萄糖標準曲線Fig.2Standard line of glucosamine

表1 乳清蛋白-氨基葡萄糖糖基化產(chǎn)物中氨基葡萄糖添加回收率（n=3）Table 1Recovery of glucosamine spiked in glycosylated whey protein(n=3)

表2 氨基葡萄糖精密度（n=6）Table 2Precision of glucosamine(n=6)

表3 糖基化乳清蛋白中氨基葡萄糖含量測定Table 3Determination of glucosamine in glycosylated whey protein

2.3.3 樣品分析

取3個批次1.3.1制備乳清蛋白糖基化產(chǎn)物，按照試驗方法處理后每個樣品平行測定3次，3個批次樣品中氨基葡萄糖含量見表3。

2.3.4 HPLC在乳清蛋白-氨基葡萄糖糖基化產(chǎn)物制備條件優(yōu)化中應用

運用HPLC方法定量分析糖基化修飾產(chǎn)品氨基葡萄糖導入含量，以氨基葡萄糖導入量為指標，采用單因素試驗方法研究反應體系乳清蛋白濃度、酶添加量對乳清蛋白糖基化修飾反應影響。

2.3.4.1 乳清蛋白濃度確定

乳清蛋白糖基化反應體系中，乳清蛋白提供谷氨酰胺與氨基葡萄糖物質(zhì)的量比為1∶3、pH 7.5、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加量10 U·g-1蛋白質(zhì)，乳清蛋白濃度對糖基化交聯(lián)乳清蛋白中氨基葡萄糖導入量影響如圖3。

圖3 乳清蛋白濃度對氨基葡萄糖導入量影響Fig.3Impacts of whey protein concentration on glucosamine conjugated into the modified whey protein

由圖3可知，乳清蛋白濃度對氨基葡萄糖導入量影響較大，氨基葡萄糖導入量隨著乳清蛋白濃度增加而增加。由于蛋白濃度增加到一定程度時，體系自身黏度和交聯(lián)度均增加，影響反應正常進行，因此乳清蛋白最大濃度選定為50 g·L-1。當乳清蛋白濃度為50 g·L-1時，氨基葡萄糖導入量最大，為5.7 g·kg-1乳清蛋白。

2.3.4.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加量確定

反應體系中乳清蛋白濃度為50 g·L-1，谷氨酰胺與氨基葡萄糖物質(zhì)的量比為1∶3、pH 7.5、反應4 h，TGase添加量對糖基化交聯(lián)乳清蛋白中氨基葡萄糖含量影響如圖4。

由圖4可知，通過HPLC測定TGase添加量對乳清蛋白修飾產(chǎn)物中氨基葡萄糖導入量影響。氨基葡萄糖導入量隨著轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加量增加呈先增后減趨勢。當體系中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加量為10 U·g-1乳清蛋白時，體系中氨基葡萄糖導入量最大，達到5.7 g·kg-1蛋白質(zhì)。但當轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加量繼續(xù)增加時，氨基葡萄糖導入量反而下降。這可能是由于在利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化乳清蛋白糖基化交聯(lián)反應中，乳清蛋白自身交聯(lián)與糖基導入產(chǎn)生競爭反應。當TGase添加量較少時，不利于酶促反應，糖基導入量較少。增加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加量，蛋白質(zhì)自身交聯(lián)程度與糖基導入均增加；酶添加量過高乳清蛋白分子迅速發(fā)生自身交聯(lián)反應，占據(jù)大量氨基葡萄糖糖基導入交聯(lián)位點，形成較大空間位阻，降低氨基葡萄糖與乳清蛋白底物結(jié)合位點接觸機率，表現(xiàn)為當TGase添加量較高時，氨基葡萄糖導入量減少。所以最佳轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加量為10 U·g-1乳清蛋白。

圖4 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加量對氨基葡萄糖導入量影響Fig.4Impacts of MTG addition on glucosamine conjugated into the modified whey protein

用HPLC結(jié)合鹽酸水解、柱前衍生分析測得氨基葡萄糖糖基化交聯(lián)修飾乳清蛋白修飾產(chǎn)物中氨基葡萄糖導入量。綜合考慮酶添加量和反應時間等對糖基化交聯(lián)乳清蛋白中氨基葡萄糖導入量影響，確定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化乳清蛋白糖基化交聯(lián)反應最佳條件為：乳清蛋白濃度為50 g·L-1，乳清蛋白與氨基葡萄糖提供?；w和酰基受體物質(zhì)的量比1∶3，酶添加量10 U·g-1乳清蛋白、pH 7.5、反應時間4 h、反應溫度為37℃。此條件下，通過HPLC定量分析，乳清蛋白糖基化修飾產(chǎn)物中氨基葡萄糖導入量為5.7 g·kg-1乳清蛋白。

3 討論

測定氨基葡萄糖制品一般采用C8柱，另外氨基葡萄糖不含發(fā)色團，僅200 nm處有末端吸收，但吸光度較弱，故采用紫外檢測器會造成干擾。曾茂法等在氨基葡萄糖硫酸鹽含量測定研究中使用C8柱色譜柱，紫外檢測器195nm檢測，未發(fā)現(xiàn)氨基葡萄糖吸收峰，SO42-可干擾樣品測定[16]。本文采用常用C18柱，衍生后作熒光檢測器檢測，效果較好，有較高準確度和精密度。通常使用普通液相色譜分析方法結(jié)合紫外檢測器直接測定氨基葡萄糖含量，但由于氨基葡萄糖基質(zhì)在測定波長處干擾色譜峰，普通液相色譜分析方法中氨基葡萄糖在反相柱保留時間較短，不易與其他雜質(zhì)峰分離[17]。衍生方法應用可有效解決該問題。本文采用鄰苯二甲醛衍生后利用高效液相色譜法測定含量，結(jié)合熒光檢測器測定，譜圖分離度較好，保留時間長。鄭家概等采用相應衍生試劑檢測氨基葡萄糖鹽酸鹽含量，發(fā)現(xiàn)OPA衍生適用于氨基葡萄糖及其他氨基葡萄糖鹽，方法可靠[18]。本文結(jié)果表明HPLC衍生化法測定氨基葡萄糖精密度、回收率較高，具有準確、簡便、專屬性強特點，更適用于制劑含量測定，與王英瑛等結(jié)果一致[19]。HPLC方法可準確測定糖基化產(chǎn)物中葡萄糖導入量，應用于糖基化反應研究。楊嵐等用RP-HPLC測定鹽酸氨基葡萄糖片含量[20]，楊華良等采用HPLC測定鹽酸氨基葡萄糖顆粒含量[21]，而陳金東等以滴定分析法和分光光度法定量測定氨基葡萄糖含量[22]，測試效果良好。劉玥等DNS法測定氨基葡萄糖精密度良好，RSD為0.08%，回收率為98.86%[23]。HPLC方法與其他方法精密度、回收率是否存在差別尚待研究。

4 結(jié)論

反相高效液相色譜測定乳清蛋白-氨基葡萄糖糖基化產(chǎn)物中氨基葡萄糖含量方法，前處理條件為6 mol·L-1鹽酸，100℃下水解4 h，流動相條件為0.025 mol·L-1、pH 3.6乙酸-乙酸鈉緩沖液與甲醇體積比（68∶32）時，氨基葡萄糖釋放完全、分離效果良好，樣品中氨基葡萄糖含量2.03±0.055 mg·g-1。該方法操作方便，靈敏度高、重現(xiàn)性好、確證能力強，可用于各種蛋白質(zhì)-氨基葡萄糖糖基化產(chǎn)物中氨基葡萄糖含量測定。

[1]王玉堂,劉寧.乳蛋白影響試驗動物體脂肪酸分布及攝食相關激素研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2013,44(5):5-10.

[2]Kika K,Korlos F,Kiosseoglou V.Improvement,by dry-heating,ofthe emulsion-stabilizing properties of a whey protein concentrate obtained through carboxymethylcellulose complexation[J].Food Chemistry,2007,104(3):1153-1159.

[3]Jiang S J,Zhao X H.Transglutaminase-induced cross-linking and glucosamine conjugation in soybean protein isolates and its impacts on some functional properties of the products[J].European Food Research and Technology,2010,231(5):679-689.

[4]Jiang S J,Zhao X H.Transglutaminase-induced cross-linking and glucosamine conjugation of casein and some functional properties of the modified product[J].International Dairy Journal, 2011,21(4):198-205.

[5]Jiang S J,Zhao X H.Cross-linking and glucosamine conjugation of casein by transglutaminase and the emulsifying property and digestibility in vitro of the modified product[J].International Journal of Food Properties,2011,15(6):1286-1299.

[6]李錚,馮力更,鄭喆,等.糖基化反應條件對乳清蛋白——麥芽糖復合物抗原性的影響[J].中國乳品工業(yè),2011,39(1):8-11.

[7]王維,尤瑜敏,周培根.D-氨基葡萄糖測定方法的比較[J].食品研究與開發(fā),2003,24(2):84-87.

[8]Shao Y,Alluri R,Mummert M,et al.A stability-indicating HPLC method for the determination of glucosamine in pharmaceutical formulations[J].Journal of Pharmaceutical&Biomedical Analysis, 2004,35(3):625-631.

[9]黃婷,李銅鈴,孫健,等.2-羥丙基-β-環(huán)糊精對尼扎替丁的包合作用[J].華西藥學雜志,2005,20(6):523-524.

[10]Harazono A,Kobayashi T,Kawasaki N,et al.A comparative study of monosaccharide composition analysis as a carbohydrate test for biopharmaceuticals[J].Biologicals,2011,39(3):171-180.

[11]Harvey D J.Harvey,Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography,electrophoresis and mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B,2011,879(17-18):1196-1225.

[12]Yan X,Evenocheck H M.Chitosan analysis using acid hydrolysis and HPLC/UV[J].Carbohydrate Polymers,2012,87(2):1774-1778.

[13]Stepan H,Staudacher E.Optimization of monosaccharide determination using anthranilic acid and 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone for gastropod analysis[J].Analytical Biochemistry, 2011,418(1):24-29.

[14]Guan Y,Tian Y,Li Y,et al.Application of a liquid chromatographic/tandem mass spectrometric method to a kinetic study of derivative glucosamine in healthy human urine[J].Journal of Pharmaceutical&Biomedical Analysis,2011,55(1):181-186.

[15]Eikenes M,Fongen M,Roed L,et al.Determination of chitosan in wood and water samples by acidic hydrolysis and liquid chromatography with online fluorescence derivatization[J].Carbohydrate Polymers,2005,61(1):29-38.

[16]曾茂法,李俊,王英瑛,等.D-氨基葡萄糖硫酸鉀鹽含量測定方法探討[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2008,25(3):251-254.

[17]姜紅,但曉夢,胡遠華,等.HPLC-RID法測定氨基葡萄糖的含量[J].中國藥品標準,2013,14(4):259-263.

[18]鄭家概,王飛,農(nóng)云軍,等.氨基葡萄糖鹽酸鹽含量的HPLC柱前衍生法測定[J].分析測試學報,2009,28(9):1081-1083.

[19]王英瑛,李俊,曹蘇.氨基葡萄糖3種含量測定方法的比較[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2009,26(4):307-309.

[20]楊嵐,李銅鈴,黃婷,等.RP-HPLC測定鹽酸氨基葡萄糖片的含量[J].華西藥學雜志,2005,20(3):259-260.

[21]楊華良,雷勇勝.HPLC法測定鹽酸氨基葡萄糖顆粒中鹽酸氨基葡萄糖的含量[J].天津藥學,2011,23(6):17-19.

[22]陳金東,李蔚.滴定分析法和分光光度法測定保健食品中D-氨基葡萄糖鹽酸鹽含量的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2002, 12(2):143-144.

[23]劉玥,劉曉蘭,周利敏,等.DNS法測定D-氨基葡萄糖含量方法的研究[J].中國調(diào)味品,2014(10):89-93.

Analysis of glucosamine in glycosylated whey protein-glucosamine using reversed-phase high-performance liquid chromatography

ZHANG Yinghua,LIU Yanle,LIU Tianshu,ZHU Min(School of Food Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Glucosamine in glycosylated whey protein was released hydrochloric acid hydrolysis. The RP-HPLC separation was performed on anEliteC18（Hypersil ODS25 μm 4.6 mm×250 mm）utilizing an isocratic elution of acetic acid sodium acetate buffer solution(containing 68%0.025 mol·L-1pH 3.6)and methyl alcohol(containing 32%)as the mobile phase at a flow rated of 1 mL·min-1.Injiction volume and column temperature were set at 10 μL and 35℃.The results indicate that the linear ranage was from 0.1 to 100 μg·mL-1for glucosamine and correlation coefficient(R2was greater than 0.99).The average recoveries spiked at the three concentration levels of 0.30,0.50,1.00 mg ranaged between 88.05%and 110.79%with the relative standard deviations from 1.22%to 5.92%.The limit of detection was 0.02 μg·mL-1.Content of glucosamine in glycosylated whey protein was 2.03 mg·g-1.Therefore, this method had the characteristics of simple operation,high reproducibility and sensitivity,It could be widely applied to determine glucosamine in glycosylated protein.

TS252.7

A

1005-9369（2017）05-0058-07

時間2017-5-23 12:38:37[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170523.1238.016.html

張英華,劉艷樂,劉天舒,等.RP-HPLC測定乳清蛋白糖基化產(chǎn)物中的氨基葡萄糖[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2017,48(5):58-64.

Zhang Yinghua,Liu Yanle,Liu Tianshu,et al.Analysis of glucosamine in glycosylated whey protein-glucosamine using reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(5):58-64. (in Chinese with English abstract)

2017-03-15

國家自然科學基金（31201453）

張英華（1974-），女，教授，博士，研究方向為食品科學與工程。E-mail:yhzhang2000@126.com