王萍，董貴軍，喬勇升，張占林

（江蘇泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇泰州225300）

顯色培養(yǎng)基上沙門(mén)氏菌及干擾菌的分離鑒定

王萍，董貴軍，喬勇升，張占林

（江蘇泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇泰州225300）

研究比較沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基（CAS)上干擾菌與沙門(mén)氏菌的區(qū)別，提高沙門(mén)氏菌的分離鑒定效率。使用沙門(mén)氏菌和7株干擾菌（銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、施氏假單胞菌、熒光假單胞菌、斯氏普羅威登斯菌、摩氏摩根菌摩根亞種、糞產(chǎn)堿菌亞種）分別接種CAS、BS、XLD和HE培養(yǎng)基，觀察菌落形態(tài)特征，分析生化試驗(yàn)結(jié)果，考察TTB和SC選擇性增菌液對(duì)7株干擾菌的選擇效果。7株干擾菌在CAS培養(yǎng)基上都是紫色菌落，仔細(xì)辨認(rèn)大部分都可與沙門(mén)氏菌區(qū)分，無(wú)法從菌落形態(tài)區(qū)分的惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌通過(guò)在BS上的生長(zhǎng)情況或生化試驗(yàn)可以排除，TTB和SC選擇性增菌液對(duì)7株干擾菌的選擇效果各不相同，提示檢測(cè)過(guò)程中TTB和SC兩種增菌液須同時(shí)使用，相互補(bǔ)充，提高檢出率。

沙門(mén)氏菌；干擾菌；顯色培養(yǎng)基；分離鑒定

沙門(mén)氏菌是引起食物中毒的重要病原菌，是食品安全與質(zhì)量檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)，世界各國(guó)普遍規(guī)定食品中不得檢出沙門(mén)氏菌[1]，在GB 29921-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)沙門(mén)氏菌的檢出要求更為嚴(yán)格。在權(quán)威的沙門(mén)氏菌檢測(cè)國(guó)標(biāo)中，將選擇性增菌液接種鑒別培養(yǎng)基，分離可疑菌落這一環(huán)節(jié)非常重要，首先要挑選特異性強(qiáng)的分離培養(yǎng)基，減少干擾菌的影響，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間；其次還要挑選靈敏度好的分離培養(yǎng)基，以防出現(xiàn)假陰性造成漏檢；最后需要檢驗(yàn)人員豐富的經(jīng)驗(yàn)去挑選可疑菌落，避免可疑菌落的后續(xù)生化鑒定試驗(yàn)中造成的人力物力的浪費(fèi)。

近年來(lái)大量的文獻(xiàn)[2-5]報(bào)道了沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基（CAS）由于具有較高的敏感性和特異性，被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)中。該培養(yǎng)基利用培養(yǎng)基中的細(xì)菌特異性酶的顯色底物與沙門(mén)氏菌特有的辛酯酶反應(yīng)，從而通過(guò)觀察菌落顏色就可直接對(duì)菌落進(jìn)行初步判定。但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，往往還有一些干擾菌在此培養(yǎng)基上出現(xiàn)與沙門(mén)氏菌屬相似的菌落，從而干擾檢驗(yàn)人員的判斷。文中將沙門(mén)氏菌與在CAS培養(yǎng)基上分離得到的7株干擾菌做了分析比較，從而為沙門(mén)氏菌的分離鑒定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

銅綠假單胞菌 CGMCC1.10274、大腸埃希菌CGMCC1.4245和沙門(mén)氏菌CGMCC1.10603：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；惡臭假單胞菌、施氏假單胞菌、熒光假單胞菌、斯氏普羅威登斯菌、摩氏摩根菌摩根亞種、糞產(chǎn)堿菌亞種為江蘇泰州市食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室從樣品中分離保存且經(jīng)過(guò)梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀VITEK 2 Compact鑒定的菌株。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、HE瓊脂（HE）、平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）和三糖鐵瓊脂（TSI）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基（CAS）：法國(guó)科瑪嘉公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基和試劑的制備均按照商品說(shuō)明書(shū)制備。

1.3.2 菌株的復(fù)蘇與接種

從9株菌株的保藏管中各挑取一環(huán)菌苔，分別劃線接種于PCA平板上，36℃過(guò)夜培養(yǎng)復(fù)蘇菌株。將復(fù)蘇后的沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、施氏假單胞菌、熒光假單胞菌、斯氏普羅威登斯菌、摩氏摩根菌摩根亞種、糞產(chǎn)堿菌亞種8株菌株分別劃線接種于BS、XLD、HE、CAS平板，36℃培養(yǎng)18 h～24 h后觀察各菌落形態(tài)（其中BS平板36℃培養(yǎng)40 h～48 h）。

1.3.3 選擇性增菌液對(duì)沙門(mén)氏菌和干擾菌株的增菌效果測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]，將PCA平板上復(fù)蘇的菌株接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中36℃培養(yǎng)過(guò)夜，制備10倍系列稀釋的菌懸液，取10-5～10-7稀釋液各1 mL傾注平板各兩塊，36℃培養(yǎng)18 h～24 h，作接種量計(jì)數(shù)，推算出10-5～10-7稀釋液1 mL中所含的菌數(shù)。接種1 mL含菌量為1 000 CFU～5 000 CFU的稀釋液于10 mL TTB和SC增菌液中，TTB增菌液置42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h，SC增菌液置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h。取TTB、SC增菌液各10 μL于平板中，每個(gè)增菌液做兩平行，用PCA瓊脂傾注平板，36℃培養(yǎng)18 h～24 h，計(jì)算兩個(gè)平行平板的平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 沙門(mén)氏菌和干擾菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)沙門(mén)氏菌和7株干擾菌在各分離培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和顯色情況見(jiàn)表1。

表1 沙門(mén)氏菌和7株干擾菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Table 1 The colony morphology of Salmonella strain and seven kinds of interfering bacteria in different media

在CAS顯色平板上各菌株都呈類(lèi)似的紫色菌落，但從菌落形態(tài)看，銅綠假單胞菌菌落較小，易與沙門(mén)氏菌菌落區(qū)分；施氏假單胞菌菌落有皺折；糞產(chǎn)堿菌亞種菌落不規(guī)則；而斯氏普羅威登斯菌和摩氏摩根菌摩根亞種在18 h觀察時(shí)CAS顯色平板上是乳白色和灰白色菌落，隨著時(shí)間延長(zhǎng)至38 h，菌落轉(zhuǎn)為淡紫色菌落，由此說(shuō)明控制好CAS顯色平板的培養(yǎng)時(shí)間可以減少一些干擾菌的產(chǎn)生。惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌在CAS顯色平板上的紫色菌落從形態(tài)和顏色上無(wú)法與沙門(mén)氏菌區(qū)別，需通過(guò)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)才能區(qū)分。

XLD、HE平板上斯氏普羅威登斯菌為灰白色菌落，其他6株干擾菌為粉紅色菌落；BS平板上銅綠假單胞菌為綠色菌落、斯氏普羅威登斯菌為灰綠色菌落、摩氏摩根菌摩根亞種為淺綠色菌落，而其他4株干擾菌都被抑制沒(méi)有生長(zhǎng)。

2.2 沙門(mén)氏菌和干擾菌的生化試驗(yàn)情況

挑取PCA平板上培養(yǎng)18 h～24 h的新鮮培養(yǎng)物做生化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)TSI瓊脂和氧化酶試驗(yàn)，銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、施氏假單胞菌、熒光假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌亞種5株菌可直接判定為非沙門(mén)氏菌，斯氏普羅威登斯菌、摩氏摩根菌摩根亞種雖然賴氨酸脫羧酶為陰性，但還需要結(jié)合靛基質(zhì)、pH7.2尿素、氰化鉀生化試驗(yàn)才能排除是甲型副傷寒沙門(mén)氏菌。

表2 沙門(mén)氏菌和7株干擾菌的生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biochemical test results of Salmonella strain and seven kinds of interfering bacteria

2.3 TTB和SC選擇性增菌液對(duì)干擾菌的選擇性情況以沙門(mén)氏菌和大腸埃希氏桿菌為對(duì)照，檢測(cè)了

TTB和SC兩種選擇性增菌液對(duì)7種干擾菌株的增菌效果，見(jiàn)表3。

表3 TTB和SC增菌液對(duì)7株干擾菌的選擇性效果Table 3 The selective effect of TTB and SC Broth on seven kinds of interfering bacteria

從表3可以看出，TTB和SC對(duì)目標(biāo)菌沙門(mén)氏菌的增菌效果好，對(duì)非目標(biāo)菌大腸埃希氏桿菌部分抑制；7株干擾菌中，兩種增菌液對(duì)銅綠假單胞菌和斯氏普羅威登斯菌都有增菌作用，對(duì)熒光假單胞菌和糞產(chǎn)堿菌亞種兩株菌幾乎是完全抑制，對(duì)于惡臭假單胞菌、施氏假單胞菌這兩種菌SC增菌液的選擇性強(qiáng)于TTB增菌液，對(duì)于摩氏摩根菌摩根亞種則是TTB選擇性強(qiáng)于SC。

3 結(jié)論與討論

沙門(mén)氏菌一般生化特性是利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)H2S，不發(fā)酵乳糖和蔗糖；氧化酶陰性；賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性。一些培養(yǎng)基（如XLD、HE、BS）就是根據(jù)這些原理設(shè)計(jì)而成，但這些一般特征并不是沙門(mén)氏菌的獨(dú)有特征，同時(shí)還有一些個(gè)別的沙門(mén)氏菌沒(méi)有這些特征，如，奇異變形桿菌及檸檬酸桿菌等一些干擾菌在XLD和HE培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和沙門(mén)氏菌相似，豬霍亂沙門(mén)氏菌和甲型副傷寒沙門(mén)氏菌由于不產(chǎn)或延遲產(chǎn)H2S在XLD和HE培養(yǎng)基上又會(huì)漏檢，此外傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌及一部分雞白痢沙門(mén)氏菌不產(chǎn)氣，亞利桑那沙門(mén)氏菌和雙相亞利桑那沙門(mén)氏菌一部分菌株可以發(fā)酵乳糖，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的賴氨酸脫羧酶為陰性，BS平板上一些腸桿菌與沙門(mén)氏菌的形態(tài)特征很相似，難以分辨，檢驗(yàn)者既不能把貌似沙門(mén)氏菌的細(xì)菌當(dāng)做沙門(mén)氏菌，也不能把沙門(mén)氏菌當(dāng)做非沙門(mén)氏菌，因此在分離檢測(cè)沙門(mén)氏菌時(shí)培養(yǎng)基的選擇以及可疑菌落的挑選很重要。

XLD、HE平板上除了斯氏普羅威登斯菌以外，其他6株干擾菌都與不產(chǎn)H2S的沙門(mén)氏菌菌落形態(tài)相似；CAS平板上7株干擾菌都是紫色菌落，除了惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌外，其余菌株通過(guò)仔細(xì)辨認(rèn)都可與沙門(mén)氏菌區(qū)分，CAS培養(yǎng)時(shí)間控制在24 h以內(nèi)可以減少一些干擾菌的出現(xiàn)；BS平板上大部分菌都被抑制不生長(zhǎng)，包括CAS平板上無(wú)法從菌落形態(tài)區(qū)分的惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌，而其他生長(zhǎng)的干擾菌也是非典型菌落，由此可見(jiàn)BS平板與CAS平板搭配使用是篩選分離沙門(mén)氏菌的最好選擇。

無(wú)法從菌落形態(tài)排除為非沙門(mén)氏菌的可疑菌落應(yīng)結(jié)合生化反應(yīng)做判斷，TSI瓊脂和氧化酶試驗(yàn)可以快速排除部分干擾菌菌株，對(duì)于一些易在CAS平板上造成混淆的假單胞菌來(lái)說(shuō)，氧化酶試驗(yàn)更是方便快捷。賴氨酸脫羧酶、靛基質(zhì)、pH7.2尿素、氰化鉀是進(jìn)一步鑒定沙門(mén)氏菌的重要生化反應(yīng)，由于微量生化系統(tǒng)和全自動(dòng)分析儀都只有賴氨酸脫羧酶一項(xiàng)，因此需要實(shí)驗(yàn)人員額外補(bǔ)做試驗(yàn)。

食品樣品基質(zhì)多樣復(fù)雜，增菌后除了少量的目標(biāo)污染菌，還會(huì)有大量的雜菌產(chǎn)生，因此要提高食品中沙門(mén)氏菌的檢出率，非選擇性前增菌時(shí)要控制好8 h～18 h時(shí)間[7]，盡可能地減少其他干擾菌的生長(zhǎng)。選擇性增菌液TTB和SC的選擇性強(qiáng)弱對(duì)7株干擾菌各不相同，有的完全抑制，有的部分抑制，有的反而促進(jìn)了干擾菌的生長(zhǎng)，因此在檢測(cè)過(guò)程中TTB和SC兩種增菌液須同時(shí)使用，才可以相互補(bǔ)充，提高檢出率。

[1]黃寶瑩,佘之蘊(yùn),林耀文.四種方法檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的比較[J].食品工業(yè)科技,2014,35(15)：185-192

[2]Pere JM,Cavalli P,Roure C,et a1.Comparison of four chromogenic media and hektoen agar for detection and presumptive identification of Salmonella strains in human Stools[J].J Clin Microbiol,2003,41：1130-1134

[3]劉振,于奐,肖強(qiáng),等.一種有效檢測(cè)沙門(mén)氏菌的顯色培養(yǎng)基的研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2007,19(6)：520-523

[4]盧勉飛,蔡芷荷,吳清平,等.顯色培養(yǎng)基快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌效果的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(12)：2618-2620

[5]王志偉.不同沙門(mén)氏菌及干擾菌的分離鑒定[J].食品研究與開(kāi)發(fā), 2012,33(1)：168-170

[6]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB4789.28-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2013：13-14

[7]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB4789.4-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010：4

Isolation and Identification of Salmonella and Interference Strains in Chromogenic Medium

WANG Ping， DONG Gui-jun，QIAO Yong-sheng，ZHANG Zhan-lin
（Jiangsu Taizhou Institute for Food and Drug Control，Taizhou 225300，Jiangsu，China）

To compare the differences between interference strains and Salmonella in Chromogenic agar Salmonella（CAS）and improve efficiency of isolating and identifying Salmonella.Salmonella and seven kinds ofinterfering bacteria（Pseudomonas aeruginosa，Pseudomonas putida，Pseudomonas stutzeri，Pseudomonas fluorescens，Providencia stuartii，Morganella morganii ssp morganii，Alcaligenes faecalis ssp faecalis）were inoculated in isolation medium（CAS，BS，XLD and HE）to observe the characteristics of the colony form，analyzed biochemical test results，investigated the selective effect of TTB and SC Broth on seven kinds of interfering bacteria.Seven kinds of interfering bacteria in CAS medium were purple colonies，most of them can be differentiated from Salmonella by recognizing carefully.Pseudomonas putida，Pseudomonas fluorescens could be excluded by BS medium or biochemical tests，the selective effect of TTB and SC Broth on seven kinds of interfering bacteria was different，suggested that TTB and SC Broth must be used together，then they will complement each other nicely to improve efficiency in detection.

Salmonella；interference strain；chromogenic medium；isolation and identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.034

2016-07-17

王萍（1983—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品微生物檢測(cè)。