孫稚菁，王靈芝，任國杰，張國翠，盧熠川

（大連市產品質量檢測研究院，遼寧大連116630）

QuEChERS-HPLC-MS/MS快速測定染色黃魚中3種堿性橙類染料

孫稚菁，王靈芝，任國杰*，張國翠，盧熠川

（大連市產品質量檢測研究院，遼寧大連116630）

采用高效液相色譜-串聯質譜法建立快速檢測染色黃魚中堿性橙Ⅱ，堿性橙21和堿性橙22的分析方法。將待測樣品經QuEChERS法進行預處理，選用乙腈溶液超聲提取，經氯化鈉和C18粉末凈化，以10 mmol/L的醋酸銨溶液（含有0.1%甲酸）-乙腈（含有0.1%甲酸）作為流動相，經Agilent poroshell 120 EC-C18（2.7 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱分離，采用多反應檢測模式（MRM）檢測。用標準曲線外標法進行定量。在優(yōu)化條件下，目標物的線性范圍為1 μg/L～100 μg/L，相關系數均大于0.999。該3種堿性橙類染料的定量下限為5 μg/kg。在3個濃度水平下，各目標物的回收率均大于85%，相對標準偏差（RSD）均低于5%。方法準確、快速、簡便、靈敏、可靠?？捎糜谌旧S魚中此3種堿性橙類染料的快速測定。

QuEChERS；高效液相色譜-串聯質譜法；堿性橙；黃花魚

堿性橙Ⅱ（Basic OrangeⅡ）是一種偶氮類堿性工業(yè)染料，俗名“王金黃”、“塊黃”等，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色[1]。由于在中性或偏堿性條件下，堿性橙Ⅱ與蛋白質吸附較牢固，比其他水溶性染料如檸檬黃、日落黃等更易于在豆類制品以及鮮海魚上染色且不易褪色，因此一些不法商販用堿性橙Ⅱ對豆腐皮、黃魚進行染色，以次充好，以假冒真，欺騙消費者。另外堿性橙21和堿性橙22也是常見的堿性橙類工業(yè)染料。由于這些工業(yè)染料具有致癌、致畸變性，會對人體造成嚴重的危害，因此在衛(wèi)生部和農業(yè)部等公布的《151種食品和飼料中非法添加物質名單》中禁止堿性橙染料在食品中使用。

通過文獻和標準檢索發(fā)現，這3種堿性橙染料的檢測方法主要為高效液相色譜法[2-6]、高效液相色譜-串聯質譜法[7-14]，另外還有氣相色譜-串聯質譜質譜法[15]和薄層色譜法[16]等方法。通過文獻分析發(fā)現，這些方法多數前處理比較復雜，費時費力，多為關于堿性橙Ⅱ的檢測，且多側重于豆制品中堿性橙類染料的檢測，關于堿性橙21和堿性橙22的檢測方法較少。本文針對頻發(fā)的染色黃魚現象，通過試驗開發(fā)了一種基于QuEChERS快速前處理方法基礎上的高效液相色譜-串聯質譜法。該方法操作簡單、靈敏度高，結果準確可靠，回收率和重現性良好，保證了消費者的安全，提高了市場監(jiān)督的效率，為食品安全監(jiān)管部門提供技術參考和支持。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22（純度均大于98%）：德國CNW公司；醋酸銨（色譜純）：美國Alfa Aesar公司；乙腈和甲醇（色譜純）：德國Merck公司。

Agilent 6490高效液相色譜-串聯質譜儀（ESI源）：安捷倫；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-250DB超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；3-18KS離心機：Sigma公司；IKA T18均質器：Basic公司；XW-80A漩渦混合器：上海精科實業(yè)有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標準儲備溶液

稱取堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22各10 mg（精確至0.1 mg），分別置于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，冷卻后用甲醇定容至刻線，配制成濃度為0.2 mg/mL的標準儲備溶液。

1.2.2 標準溶液的配制

準確移取3種標準儲備液適量，用甲醇逐級稀釋配制100、80、50、25、10、1 μg/L的系列混合標準溶液，用于標準曲線的繪制。

1.3 試樣制備

稱取粉碎好的魚糜樣品5.0g，加入乙腈25 mL，均質，超聲10min，加入NaCl 2 g，渦旋混勻，經5 000 r/min離心處理3 min，取上清液2 mL加入C18粉末0.1 g，渦旋1 min，經0.22 μm微孔濾膜濾過，待測。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 液相分離條件

色譜柱：Agilent poroshell 120 EC-C18（2.7 μm，2.1 mm×50 mm）。流動相：A 10 mmol/L的醋酸銨溶液（含有0.1%甲酸）；B乙腈（含有0.1%甲酸）。梯度洗脫條件：0～3 min，40%～95%B；3 min～4 min，95%～40% B；4 min～6 min，40%B。柱溫：35℃。流速：0.2 mL/min。進樣量：2 μL。

1.4.2 質譜分析條件

離子源：電噴霧電離源（ESI源）；離子源溫度：300℃；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；霧化氣：氮氣，30 psi；干燥氣：氮氣，流速：14 L/min；鞘氣溫度：350℃，流速：11 L/min；碰撞氣：氮氣；毛細管電壓：3 500 V；碰撞電壓：380 V；其他質譜參數見表1。

1.5 定性分析與定量測定

1.5.1 定性分析

分別將試樣溶液與標準溶液按“1.4儀器分析條件”進行檢測，比較在相同條件下獲得的樣品溶液與標準物質的分離譜圖。以目標化合物色譜峰的保留時間與目標化合物兩個離子的豐度比進行定性分析。

1.5.2 定量測定

移取“1.2.2”系列標準溶液，按照“1.4”色譜條件進行儀器分析，以系列標準溶液的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線，用于定量計算。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

經試驗發(fā)現乙腈對于堿性橙類著色劑具有良好的提取效果，但在已經提取溶液中會含有大量的水及其水帶入的大極性雜質，氯化鈉的加入可以有效地分離出水分和大極性雜質，由于魚類產品含有一定的脂類物質，經乙腈提取后這些脂類的存在會影響目標物的測定，降低色譜柱的壽命，C18粉末的加入很好地能吸附這些小極性的雜質。經試驗驗證發(fā)現，樣品經乙腈提取后，經過氯化鈉和C18粉末的純化后，可以在保證目標物提取效率的前提條件下獲得較為純凈的提取溶液。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

試驗通過考察3種目標成分在C18色譜柱上的分離效果，發(fā)現目標物在普通C18色譜柱上峰型嚴重拖尾，為了保證目標物的正模式響應，流動相中酸的存在又加劇了目標物的拖尾現象。鑒于這3種化合物的結構性質，推測造成拖尾的原因可能是目標物與固定相上殘余硅羥基之間的相互作用所致。嘗試選擇Aiglent poroshell 120 EC-C18色譜柱用于改善3種目標化合物的色譜分離。研究顯示，在優(yōu)化的色譜條件下，可以獲得良好的色譜分離效果，試驗最終選擇Aiglent poroshell 120 EC-C18作為色譜柱進行分離。

2.2.2 流動相中洗脫溶劑及改性劑的優(yōu)化

液相色譜-串聯質譜分析中的流動相通常為乙腈或甲醇和水，為了保證化合物的離子響應通常會加入甲酸、乙酸、乙酸銨等不同的改性劑，經過試驗驗證發(fā)現，乙腈-水系統(tǒng)可以獲得良好的分離效果，加入甲酸的溶劑系統(tǒng)能明顯提高離子響應，在酸性條件下醋酸銨的加入可以改善離子響應強度，并能保持良好的峰型，經過多次試驗驗證，以10 mmol/L的醋酸銨溶液（含有0.1%甲酸）和乙腈（含有0.1%甲酸）作為流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫可以獲得良好的分離圖譜。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

將3種目標物的標準溶液在質譜上進行全掃描，在ESI（+）模式下得到3種目標化合物的分子離子峰。通過優(yōu)化碰撞能等參數，得到3種化合物的子離子，每種物質選擇2個子離子，將響應值高的離子作為定量離子，另一個作為定性離子。3種著色劑的MRM質譜參數見表1。

在該優(yōu)化儀器條件下，3種標準物質的多反應檢測譜圖如圖1所示（各標準物質濃度為5 μg/L）。

圖1 3種著色劑的多反應檢測譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 3 colorants

2.4 線性范圍與相關系數

移取濃度分別為100、80、50、25、10、1 μg/L的系列混合標準溶液，在優(yōu)化色譜條件下進行分析。研究結果表明：各目標物在1 μg/L～100 μg/L范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.999。各目標物的線性回歸方程及相關系數如表2所示。

表2 3種著色劑的線性方程，相關系數，檢出限與定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients（r），LODs and LOQs of 3 colorants

2.5 回收率與定量下限

向不含目標物質的空白樣品基質中定量添加混合標準溶液，進行加標試驗，計算信噪比（S/N）。以S/ N＞3為檢出限，以S/N＞10為定量下限，具體試驗結果見表3。對3種目標物分別在5、50、500 μg/kg 3個濃度水平下進行加標回收試驗，每個水平測定6個樣品，其回收率與相對標準偏差見表3。

由表3可知，各目標物的加標回收率為89.45%～99.49%，相對標準偏差（RSD）均低于5%。方法顯示了良好的回收率與精密度。

表3 3種著色劑的加標回收率與相對標準偏差Table 3 The average recoveries and RSDs of 3 colorants

2.6 實際樣品測試

應用本法對72個市售黃花魚樣品進行測定。通過對測定結果統(tǒng)計分析發(fā)現，共有1個檢出堿性橙Ⅱ，通過對陽性樣品的分離圖譜進行分析發(fā)現，分析圖譜中所存在的干擾很少，該方法適用于實際樣品的分析測定。

3 結論

本文采用QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法建立了染色黃魚中3種堿性橙類著色劑的快速替換方法?？瞻讟悠芳訕嗽囼灱皩嶋H樣品測定結果表明，該方法準確、簡便、靈敏、可靠，可用于染色黃魚中3種堿性橙類著色劑的快速替換和測定，能夠為政府法規(guī)的執(zhí)行和市場的質量監(jiān)管提供有效的技術支持和保障。

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Determination of 3 Basic Orange in Dyed Yellow Croaker by QuEChERS-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Zhi-jing，WANG Ling-zhi，REN Guo-jie*，ZHANG Guo-cui，LU Yi-chuan
（Dalian Institute of Product Quality Supervision&Inspection，Dalian 116630，Liaoning，China）

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）method was developed for the rapid determination of 3 basic orange in dyed yellow croaker.To pass through the QuEChERS method under test sample preprocessing，ultrasonic extraction with acetonitrile solution，purification by sodium chloride and C18powder，the extract was separated on an Agilent poroshell 120 EC-C18（2.7 μm，2.1 mm×50 mm）using a gradient elution program with mobile phase of 10 mmol/L ammonium acetate（containing 0.1%formic acid）-acetonitrile（containing 0.1%formic acid），with multiple reactions monitoring（MRM）mode for testing.Using external standard method for the quantitative standard curve.The linear ranges of 3 analytes were in the range of 1 μg/L-100 μg/L，with correlation coefficients more than 0.999.The limits of quantiation（LOQs）were 5 μg/kg.The average recoveries at three spiked levels were greater than 85%，with RSDs less than 10%.This method is accurate，simple，sensitive and reliable，and can be used for analysis of 3 basic orange in dyed yellow croaker.

QuEChERS；high performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry；basic orange；croaker

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.031

2017-03-06

孫稚菁（1972—），女（漢），高級工程師，本科，研究方向：食品和化工產品質量安全監(jiān)測。

*通信作者：任國杰（1987—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品、藥品以及化妝品檢測方法的研究與開發(fā)。