黃旭東，晁魯平，項(xiàng)慶琰，蔣益虹

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，馥莉食品研究院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心，浙江杭州310058）

不同產(chǎn)地荷葉功能性成分的評(píng)價(jià)

黃旭東，晁魯平，項(xiàng)慶琰，蔣益虹*

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，馥莉食品研究院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心，浙江杭州310058）

測(cè)定廣昌贛蓮（江西廣昌）、江蘇紅蓮（江蘇寶應(yīng)）、洪湖蓮（湖北洪湖）、湘白蓮（湖南湘潭）、建蓮（福建建寧）這5個(gè)產(chǎn)地的荷葉中生物堿、黃酮、甾醇及揮發(fā)物的含量。以乙醇水溶液為提取劑超聲提取荷葉粉末，通過(guò)分光光度法分析，得到荷葉生物堿含量最高的是湘白蓮4.08 mg/g；荷葉中黃酮含量最高的是寶應(yīng)紅蓮19.99 mg/g。利用有機(jī)溶劑提取法得到甾醇粗提物，經(jīng)過(guò)皂化，SPE柱萃取，衍生，氮吹后，GC-MS測(cè)定荷葉中甾醇含量。荷葉中甾醇含量最高的是寶應(yīng)紅蓮0.25 mg/g，主要的甾醇為β-谷甾醇。利用水蒸氣蒸餾法提取荷葉中的揮發(fā)油，并利用GC-MS測(cè)定揮發(fā)油的含量及成分，荷葉揮發(fā)油含量最高的是洪湖蓮0.75%，荷葉揮發(fā)油中植醇、葉綠醇、烯類(lèi)較多。

荷葉；生物堿；黃酮；甾醇；揮發(fā)油；氣相質(zhì)譜

荷，睡蓮科蓮屬，多年水生植物。荷葉在我國(guó)有十分豐富的資源，是天然的藥食兩用的保健食品[1]。子蓮（荷）品種較多，主要分布在福建、湖北、江西、湖南、江蘇等地。根據(jù)其地域分布特征，通常將分布于福建的子蓮稱為建蓮，湖南的俗稱湘蓮，江西廣昌寧都石城的俗稱白蓮[2]。荷葉中，含有較多的生物堿[3]、黃酮類(lèi)物質(zhì)[4]。荷葉生物堿和黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化[5]、抗炎癥[6]、抗衰老[7]、降低血脂[8-9]、抑菌[10-11]、清除自由基[12]等功能，保健用途廣泛，是中藥研究的熱點(diǎn)。荷葉成分中含有β-谷甾醇[1]，甾醇能通過(guò)降低膽固醇減少心血管病的風(fēng)險(xiǎn)。新鮮荷葉具有淡雅的清香，香氣成分復(fù)雜，主要為烯類(lèi)成分，含有一定量的醇類(lèi)、少量的醛類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、烷類(lèi)、酚類(lèi)、氧化物成分[13]。對(duì)荷葉生物堿、黃酮的提取一般采用乙醇提取法[8，14]，然后通過(guò)分光光度法測(cè)定吸光值。目前對(duì)甾醇與揮發(fā)油的測(cè)定，多用氣質(zhì)聯(lián)用的技術(shù)[13]。

荷葉中含有較多的生物堿類(lèi)化合物及黃酮類(lèi)化合物，而對(duì)其中的甾醇、揮發(fā)油等成分的研究非常少見(jiàn)；并且缺少對(duì)不同產(chǎn)地荷葉中各個(gè)功能成分含量的比較。本試驗(yàn)將測(cè)定不同產(chǎn)地（江西廣昌、江蘇寶應(yīng)、湖北洪湖、湖南湘潭、福建建寧）中荷葉中各個(gè)功能成分的含量，并對(duì)其做出比較分析。通過(guò)檢測(cè)不同產(chǎn)地荷葉生物堿、黃酮、甾醇、揮發(fā)油的含量，建立部分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，以及對(duì)不同產(chǎn)地荷葉進(jìn)行功能評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

試驗(yàn)材料選自我國(guó)5大蓮代表品系，分別為廣昌贛蓮（江西廣昌）、江蘇紅蓮（江蘇寶應(yīng)）、洪湖蓮（湖北洪湖）、湘白蓮（湖南湘潭）、建蓮（福建建寧）。樣品于2014年6月采集于各個(gè)地區(qū)。將新鮮采集的荷葉樣品充分烘干后粉碎，過(guò)80目篩，備用。

乙醇、鹽酸、氨水、三氯甲烷、冰醋酸、香草醛、高氯酸、乙醚、正己烷（分析純）、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品、豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁試劑有限公司。

RE-52AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海嘉鵬科技有限公司；EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：METTLER TOLEDO（上海）有限公司；722E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；B8/224S電子分析天平（萬(wàn)分之一）：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SK8210HP超聲波清洗器：上海科導(dǎo)（KUDOS）超聲儀器有限公司；F30400209水浴加熱器：意大利VELP公司；ProElut Silica 500 mg/6 ml/30/ pkg：迪馬科技有限公司；7890B氣相色譜儀、5977A質(zhì)譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.2 生物堿和黃酮的測(cè)定

按王穎瀅優(yōu)化的方法，超聲提取生物堿，以荷葉堿為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品總生物堿的含量[15]。按照蔣益虹的方法，提取黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品總黃酮含量[16]。

1.3 甾醇含量的測(cè)定

稱取豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用正己烷定容至100mL。分別吸取豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、0.8、1.2、1.6、2.0 mL至5個(gè)10 mL容量瓶，分別用正己烷定容至10 mL。將得到的樣品分別取1 mL放入氣相瓶，氮吹至干。分別加入衍生劑100 μL，60℃衍生60 min，氮吹干。分別加入1 mL正己烷，即可進(jìn)行GC-MS進(jìn)樣。平行測(cè)定3次試驗(yàn)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取荷葉粗提物0.1 g左右，加入配置好的3 mol/L KOH-乙醇溶液0.4 mL，在70℃下水浴2 h。對(duì)皂化好的樣品進(jìn)行正己烷萃取，萃取2次，每次5 mL，合并萃取液并用5 mL水洗，輕微搖動(dòng)，將正己烷相吸出備用。對(duì)SPE柱用10 mL正己烷活化，將備用的樣液過(guò)柱后，用5%乙醚-95%正己烷10 mL洗柱子后，再用30%乙醚-70%正己烷10 mL洗脫柱子，并收集這10 mL洗脫液。將洗脫液氮吹至1 mL，放入氣相瓶，繼續(xù)氮吹至干燥。加入衍生劑100 μL，60℃下衍生60 min氮吹干，最后加入1 mL正己烷，進(jìn)行GC-MS進(jìn)樣。

GC-MS條件：HP-5 MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m× 250 μm×0.25 μm），程序升溫：初始溫度80℃，保持1 min，以40℃/min升溫至280℃，保持20 min；載氣為高純氦氣，流量1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣。EI電離：70 eV；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；傳輸線溫度：250℃；掃描質(zhì)量范圍m/z：40～450；溶劑延遲：5.0 min。圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST05版標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)。

1.4 揮發(fā)油的提取

采用水蒸氣蒸餾的方法提取荷葉中的揮發(fā)性成分，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，用峰面積歸一化法測(cè)定各個(gè)化合物在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量。改用曾紅燕的氣質(zhì)方法[13]，對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)樣。GC-MS條件：HP-5 MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m× 250 μm×0.25 μm），程序升溫：初始溫度80℃，保持3 min，以10℃/min升溫至280℃，保持5 min；載氣為高純氦氣，流量1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣。EI電離：70 eV；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；傳輸線溫度：250℃；掃描質(zhì)量范圍m/z：40～450；溶劑延遲：5.0 min。圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST05版標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地荷葉生物堿、黃酮、甾醇、揮發(fā)油的含量分析

荷葉堿、蘆丁、豆甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

不同產(chǎn)地荷葉生物堿、黃酮、甾醇、揮發(fā)油的含量見(jiàn)表1。

不同產(chǎn)地子蓮中荷葉生物總堿的含量有一定差別，范圍大約在1.5 mg/g～4 mg/g之間。其中生物堿含量最高的為湘白蓮4.08 mg/g，生物堿含量最低的為洪湖蓮1.60 mg/g。荷葉中黃酮含量最高的為寶應(yīng)紅蓮19.99 mg/g，黃酮含量最低的為湘白蓮13.24 mg/g。

圖1 荷葉堿、蘆丁、豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Nuciferine，rutin，stigmasterol

表1 不同產(chǎn)地荷葉生物堿、黃酮、甾醇、揮發(fā)油的含量Table 1 Contents of alkaloids，flavonoids，sterol and volatile oil in the lotus leaves of different origins

不同產(chǎn)地荷葉的甾醇含量差異不大，最高為寶應(yīng)紅蓮荷葉0.25 mg/g，最低為贛蓮荷葉0.15 mg/g，荷葉中主要的甾醇為β-谷甾醇。

2.2 荷葉揮發(fā)油的成分含量分析

不同產(chǎn)地荷葉揮發(fā)油的GC-MS總離子圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同產(chǎn)地荷葉和揮發(fā)油GC-MS總離子圖Fig.2 Total ion chromatogram of GC-MS of volatile oil of lotus leaves from different origins

荷葉的揮發(fā)油含量最高的是洪湖蓮0.75%，最低的是贛蓮荷葉0.43%。由于不同產(chǎn)地荷葉揮發(fā)油數(shù)據(jù)較多（見(jiàn)圖2），這里分析洪湖蓮荷葉揮發(fā)油數(shù)據(jù)，見(jiàn)表2。

從表2中得出，洪湖蓮荷葉揮發(fā)油共檢測(cè)到29個(gè)峰，占總揮發(fā)油的99.85%。其中主要化合物，烷烴類(lèi)占40.2%，烯烴類(lèi)26.7%，氧化物占12.3%，n-棕櫚酸5.96%，植醇6.77%，脂類(lèi)酚類(lèi)占1.98%。含量較高的是十七烷烯11.78%、十五烷17.85%、十六碳-6，9-二烯13.91%。

表2 洪湖蓮荷葉揮發(fā)油成分Table 2 Volatile oil constitute of Hong Hu lotus leaves

表2 洪湖蓮荷葉揮發(fā)油成分Table 2 Volatile oil constitute of Hong Hu lotus leaves

3 討論與結(jié)論

陳凌通過(guò)乙醇回流提取荷葉生物堿，高效液相色譜檢測(cè)到湖南長(zhǎng)沙荷葉荷葉堿的含量為0.10%～0.12%[17]。肖娟以湖北洪湖荷葉為原料，利用響應(yīng)曲面試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，在最佳條件下，提取溫度84℃，乙醇體積90.65%，提取時(shí)間2.01 h，料液比29.74∶1（mL/g），得到荷葉中荷葉堿的含量為0.186%[18]。何曉曦研究用高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地不同采收期荷葉生物堿的含量，發(fā)現(xiàn)湖南荷葉荷葉堿含量0.98%，而湖北荷葉荷葉堿含量為0.11%[19]。這些都與我們的試驗(yàn)結(jié)果（湖南湘蓮荷葉生物堿含量為4.08 mg/g，而湖北洪湖荷葉生物堿含量?jī)H為1.60 mg/g）類(lèi)似，湖南荷葉荷葉堿含量相對(duì)多于湖北荷葉荷葉堿含量。處于長(zhǎng)三角地區(qū)的3種子蓮品種，江蘇寶應(yīng)紅蓮、江西廣昌贛蓮以及福建建蓮的荷葉生物堿含量都較高。

荷葉中黃酮含量都較高，且差異不大，黃酮含量最高的是寶應(yīng)紅蓮荷葉19.99 mg/g。建寧荷葉荷葉堿含量為2.18 mg/g，荷葉黃酮含量為16.52 mg/g。林木先用50%乙醇（0.2%HCl）為提取劑，60℃反復(fù)提取，測(cè)得建寧荷葉中荷葉堿的含量為0.51%，黃酮含量為2.9%[20]。這比我們的試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)更大。高夢(mèng)祥用機(jī)械化學(xué)法提取湖北荊州西郊塘荷葉黃酮，檢測(cè)到含量在3.0 mg/g～4.0 mg/g[21]。荷葉中生物堿、黃酮含量受到產(chǎn)地、采收期等因素影響。

荷葉揮發(fā)物具有抑菌、調(diào)脂作用，且其香氣成分及香味可用于開(kāi)發(fā)飲料，化妝品等等。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，不同產(chǎn)地荷葉揮發(fā)油中都含有植醇、葉綠醇、烯類(lèi)等。湖南湘蓮、湖北洪湖蓮、建寧蓮的荷葉揮發(fā)油含量相對(duì)較高。曾虹燕用水蒸氣提取法提取湖南湘潭荷葉揮發(fā)油，得率1.65%，用超臨界CO2萃取荷葉揮發(fā)油，得率4.36%，揮發(fā)油主要成分為反式石竹烯、反式異檸檬烯、十六酸等[13]。這比我們的試驗(yàn)結(jié)果更高。本實(shí)驗(yàn)得到荷葉揮發(fā)油中主要成分為葉綠醇、葉綠酸、植醇、烯類(lèi)等。

王玲玲從荷葉乙醇提取物中分離，用核磁共振鑒定得到β-谷甾醇2 mg/kg[22]，趙小亮用乙醇提取荷葉，并用正丁醇、乙酸乙酯萃取，用核磁共振鑒定，分離得到的β-谷甾醇11.5 mg/kg[23]。本試驗(yàn)通過(guò)SPE柱萃取、皂化、衍生的方法，GC-MS檢測(cè)，得到荷葉的甾醇，主要成分也是β-谷甾醇，荷葉中含量最高的是寶應(yīng)紅蓮荷葉（0.25 mg/g）。

綜合以上分析來(lái)看，處于長(zhǎng)三角地區(qū)的3種子蓮品種，江蘇寶應(yīng)紅蓮、江西廣昌贛蓮以及福建建蓮的各功能成分含量較多，且各功能性成分含量相近。而湖南湘蓮和湖北洪湖蓮功能性成分含量差異較大，湖南湘蓮荷葉生物堿含量較多，黃酮含量較少，湖北洪湖蓮荷葉生物堿含量較少，黃酮含量較多。荷葉這些功能性成分含量的差異受到地域以及采收期的影響。本實(shí)驗(yàn)研究不同產(chǎn)地荷葉的生物堿、黃酮、甾醇、揮發(fā)油含量的差異，對(duì)不同產(chǎn)地荷葉的功能性成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用荷葉資源奠定基礎(chǔ)，對(duì)荷葉功能性成分后續(xù)評(píng)價(jià)具有指導(dǎo)意義。

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Evaluation of Functional Components of Lotus Leaves from Different Regions

HUANG Xu-dong，CHAO Lu-ping，XIANG Qing-yan，JIANG Yi-hong*
（College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，F(xiàn)uli Institute of Food Science，Zhejiang Key Laboratory for Agri-Food Processing，Zhejiang R&D Center for Food Technology and Equipment，Hangzhou 310058，Zhejiang，China）

This research studied the contents of alkaloids，flavonoids，sterol as well as volatile oil from the lotus leaves of the five famous origins of lotus in China of Guangchang Lotus（Jiangxi Guangchang），Jiangsu Hong Lotus（Jiangsu Baoying），Hong Hu Lotus（Hubei Honghu），Xiang Lotus（Hu'nan）and Jian Lotus（Jianning，F(xiàn)ujian）.With ethanol as extraction solvent，physiologically active substances was extracted from lotus leaves powder by ultrasonic extraction way，and measured with spectrophotometry.The highest content of alkaloids in lotus leaves was Xiang Lotus 4.08 mg/g.The highest content of flavonoids in lotus leaves was BaoYing Hong Lotus 19.99 mg/g.Ethanolic extract from lotus leaves was carried on with saponification，solid phase extraction，derivation，and nitrogen blow，and after that the content of sterol in lotus leaves was detected by Gas Chro matography-Mass Spectrometer.The highest content of sterol in lotus leaves was Bao Ying Hong Lotus 0.25 mg/g，and the main kind of sterol was β-sitosterol.The volatile oil was extracted by steam distillation，and its content was detected by Gas Chromatography-Mass Spectrometer.The highest content of volatile oil in lotus leaves was Hong Hu Lotus 0.75%.The content of phytol and olefin played a major part in volatile oil of lotus leaves.

lotus leaves；alkaloids；flavonoids；sterol；volatile oil；gas chromatography mass spectrometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.033

2016-09-26

黃旭東（1991—），男（漢），碩士，研究方向：荷副產(chǎn)物的研究開(kāi)發(fā)。

*通信作者：蔣益虹，副教授。