趙子丹，葛謙，牛艷，王曉菁，張艷

（寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，寧夏銀川750002）

HPLC測定黑果枸杞中花青素的成分及含量

趙子丹，葛謙，牛艷，王曉菁*，張艷

（寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，寧夏銀川750002）

建立黑果枸杞中花青素的高效液相色譜檢測方法。采用酸化乙醇溶液超聲提取黑果枸杞中的花青素，置于沸水浴中將花青素水解為常見的花色素。選用高效液相色譜-紫外檢測器、Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱，以乙腈/ 0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，在525 nm波長處對6種常見花色素（矢車菊色素、天竺葵色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素）進行定量檢測。結(jié)果表明，6種花色素在濃度為0.2 mg/L～100 mg/L范圍內(nèi)，與響應(yīng)值呈線性關(guān)系，分別獲得標準曲線方程及相關(guān)系數(shù)，r＞0.999；矢車菊色素、天竺葵色素、飛燕草色素、芍藥色素、錦葵色素的儀器檢出限均為0.02 mg/L，牽牛花色素的儀器檢出限為0.05 mg/L；6種花色素的平均回收率在84%～106%，RSD值在0.5%～7.9%。

黑果枸杞；花青素；水解；高效液相色譜

花青素（anthocyanidin）是一類水溶性植物色素，廣泛存在于植物的花、果實、莖、葉中，是植物的主要呈色物質(zhì)，使它們呈現(xiàn)紅、藍、紫等不同的顏色?；ㄇ嗨卦谧匀粭l件下很少以游離狀態(tài)存在，常與各種單糖以糖苷鍵的形式結(jié)合形成花色苷。黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬多年生灌木，是我國西北地區(qū)特有的野生植物品種，其果實富含花青素，是典型的天然花色苷類植物色素資源[1]。近年研究表明，黑果枸杞花青素具有多種生理功能，包括抗氧化[2-4]、抗輻射[5]、抗衰老[6]以及調(diào)節(jié)血脂功能[7]，能有效防治動脈粥樣硬化等慢性疾病[8]。同時，黑果枸杞花青素還具有安全、無毒、藥食兼用的特性，作為一種天然色素在食品行業(yè)中的應(yīng)用前景非常廣闊[9-10]。

目前，對黑果枸杞花青素含量的測定方法有紫外-可見分光光度法[11-13]、高效液相色譜法[14-16]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-18]等。紫外-可見分光光度法操作相對簡便，但無法測定出花青素的種類和準確含量；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適合測定花青素含量較低的植物性樣品，同時可用于鑒定一些未知結(jié)構(gòu)的花色苷，然而含量較高的樣品容易超出其線性范圍；高效液相色譜法是目前檢測花青素報道最多的方法，但是現(xiàn)有相關(guān)研究均只選擇一種或兩種花色素標準品進行檢測，測定結(jié)果有失偏頗。自然存在的花青素種類繁雜、品種眾多，利用高效液相色譜法直接分析需要購置多種標準品，成本較高，難以用于實際檢測中。自然界中存在6種常見的花色素，分別是矢車菊色素（cyanidin）、天竺葵色素（pelargonidin）、飛燕草色素（delphinidin）、芍藥色素（peonidin）、牽?；ㄉ兀╬etunidin）和錦葵色素（malvidin）。通過強酸水解可將花青素轉(zhuǎn)化成6種常見花色素中的一種或幾種，因此，通過分析花色素來確定花青素的成分就成為一種簡便有效的分析方法。本試驗對黑果枸杞中花青素的提取試劑、提取條件、色譜條件等進行了較為細致的研究，以期建立黑果枸杞中花青素成分及含量測定的高效液相色譜法，為黑果枸杞中花青素的研究提供技術(shù)支撐，也為完善黑果枸杞的質(zhì)量標準檢測體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、乙醇（色譜純）：美國Fisher公司；鹽酸、磷酸（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；超純水（過0.22 μm濾膜）。

飛燕草色素標準物質(zhì)（純度≥97%）、矢車菊色素標準物質(zhì)（純度≥96%）、天竺葵色素標準物質(zhì)（純度≥97%）、芍藥色素標準物質(zhì)（純度≥97%）、錦葵色素標準物質(zhì)（純度≥97%）：法國Extras Synthese公司；牽?；ㄉ貥藴饰镔|(zhì)（純度≥99%）：日本Tokiwa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695液相色譜儀（配2487紫外檢測器）：美國Waters公司；XS205 DualRange電子天平（精度0.000 1 g）：瑞士Mettler Toledo公司；T25 digital型高速勻漿機：德國IKA公司；MS3 basic渦旋混勻器：德國IKA公司；DS-2510DTH型超聲波清洗器：上海生析超聲儀器有限公司；水浴鍋：上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；TDL-40離心機：上海安亭儀器有限公司；純水機：美國Millipore公司；DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒儀器有限公司；精密移液槍：法國Gilson公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備

分別精密稱取飛燕草色素、矢車菊色素、牽?；ㄉ?、天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素6種標準物質(zhì)各5.0 mg，分別用5%HCl甲醇溶解并定容至10 mL，充分搖勻，配制成500 mg/L的標準儲備液，-20℃冷凍保存。

1.3.2 樣品前處理

將黑果枸杞干果用高速萬能粉碎機粉碎，準確稱取1.000 0 g，置于250 mL磨口錐形瓶中，加入50 mL酸化乙醇提取溶劑。超聲提取30 min后，置于沸水浴中冷凝回流1 h，取出后迅速冷卻。當(dāng)達到室溫時，立即將樣品過0.22 μm水相濾膜到2 mL的棕色小瓶中，待檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent-ZORBAXSB-C18（4.6mm×250mm，5 μm），流動相為乙腈/0.1%磷酸溶液，流速0.8 mL/min，柱溫為40℃，檢測波長525 nm，進樣體積10 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱及流動相的選擇

分別選擇 Waters-XbridgeTM HILIC色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），Waters-XbridgeTM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以不同的流動相體系及不同的體積配比對6種花色素標準品的液相色譜檢測條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱，以乙腈與0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，既與干擾組分達到有效分離，且同時保持6種花色素的基線分離度。6種花色素的相對保留時間分別為：12.1、15.8、16.9、19.4、20.8、21.5 min，重現(xiàn)性好。最終確定的梯度洗脫條件見表1，色譜圖見圖1。

圖1 6種花色素色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the six kind of anthocyanidins

2.2 黑果枸杞花青素提取方法的建立

2.2.1 黑果枸杞花青素提取試劑的選擇

通常游離狀態(tài)的花青素不穩(wěn)定，在中性和堿性條件下極易分解，但在強酸條件下能穩(wěn)定存在。目前，文獻中記載關(guān)于花青素的提取方法主要有酸化水溶液提取法[19]、酸化乙醇提取法[20-21]、酸化有機溶劑提取法（包括甲醇、乙腈、丙酮）[22-24]等。因2.1中確定的流動相為乙腈與磷酸溶液，同時考慮乙醇提取的無毒性，因此分別選擇酸化乙腈與酸化乙醇作為提取試劑，并針對兩種提取試劑設(shè)計相應(yīng)的提取優(yōu)化試驗，具體見表2。

表2 不同提取試劑條件下6種花色素的提取率Table 2 Extraction rates of the six kind of anthocyanidins with different reagents

結(jié)果表明，乙醇∶50%鹽酸溶液（體積比50/50）相較于其它組合，提取率最高，因此選擇該比例的酸化乙醇溶液作為提取試劑。

2.2.2 黑果枸杞花青素提取條件的選擇

針對2.2.1確定的提取試劑，對黑果枸杞花青素的提取條件，即對酸解的溫度及時間進行相應(yīng)的優(yōu)化，具體見表3。

結(jié)果表明，冷凝回流沸水浴加熱的效果比烘箱加熱的效果好，且冷凝回流沸水浴加熱60 min時的提取率最高，因此，選擇該條件為最佳提取條件。

表3 不同提取條件下6種花色素的提取率Table 3 Extraction rates of the six kind of anthocyanidins with different conditions

續(xù)表3 不同提取條件下6種花色素的提取率Continue table 3 Extraction rates of the six kind of anthocyanidins with different conditions

通過試驗，確定樣品經(jīng)乙醇：50%鹽酸溶液（體積比50/50）超聲提取，再經(jīng)過冷凝回流沸水浴水解60 min，即得黑果枸杞花青素提取液。待樣品冷卻后，過0.22 μm水相濾膜，上機檢測。

2.3 標準曲線與檢出限

分別配制0、0.2、1.0、5.0、10、50、100 mg/L 6種花色素的標準溶液系列，按照1.4的條件進行測定，測定結(jié)果采用外標峰面積定量，以標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，分別獲得標準曲線方程及R2值，結(jié)果表明6種花色素標準溶液的質(zhì)量濃度與相應(yīng)的色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，具體見表4。根據(jù)稱樣量為1 g，定容體積為50 mL，以3倍信噪比計算儀器檢出限。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一黑果枸杞樣品提取液，按1.4色譜條件，將樣品分別放置0、2、4、6、8、12、24 h后，通過高效液相色譜儀進行分析，記錄保留時間及峰面積，計算樣品中花色素保留時間及峰面積的RSD，結(jié)果其RSD值分別在0.13%～0.42%與0.22%～1.2%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 回收率和精密度

分別向黑果枸杞空白試樣中添加6種花色素的標準溶液，每種花色素的添加質(zhì)量濃度各不相同，分別設(shè)計3個濃度水平，每個水平設(shè)計5個重復(fù)，靜置30 min后與空白試樣一同進行測定。結(jié)果表明，6種花色素的平均回收率為84%～106%，相對標準偏差為0.5%～7.9%，回收率、精密度均能滿足檢測要求，具體見表5，圖2、圖3。

表5 6種花色素的添加回收率和精密度結(jié)果（n=5）Table 5 Fortified recovery and precision of the six kind of anthocyanidins（n=5）

2.6 黑果枸杞樣品的測定

在市場上購買不同產(chǎn)地的黑果枸杞樣品，應(yīng)用本研究建立的方法對樣品進行檢測分析，具體見表6。

結(jié)果表明，被檢樣品中均含有至少4種花色素，分別為飛燕草色素、牽?；ㄉ亍⑸炙幧睾湾\葵色素，且主要為牽牛花色素。所檢測的黑果枸杞樣品中花青素的含量最高可達11.0 mg/g。

圖2 黑果枸杞樣品空白色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample of Lycium ruthenicum

3 討論與結(jié)論

研究表明，花青素在光照條件下易降解，因此在樣品制備和檢測過程中，應(yīng)盡量避光，以保證樣品的穩(wěn)定性。本研究僅對黑果枸杞中花青素經(jīng)強酸水解成的常見花色素進行了分析研究。通過對購自不同產(chǎn)地的黑果枸杞進行測定，發(fā)現(xiàn)所含花青素的成分基本一致，僅在含量上有所差別，青海產(chǎn)地的黑果枸杞花青素含量總體高于其他產(chǎn)地，分析可能與產(chǎn)地環(huán)境有關(guān)。且黑果枸杞中所含色素主要為牽牛花色素，這與藍莓所含色素主要為錦葵色素可做一區(qū)分。

圖3 黑果枸杞樣品添加標準品色譜圖Fig.3 Chromatogram of Lycium ruthenicum added with standards

表6 試驗樣品中花青素的檢測結(jié)果Table 6 Contents of Anthocyanins in different samples

本研究建立了高效液相色譜檢測黑果枸杞中花青素成分及含量的方法。方法采用酸化乙醇溶液經(jīng)沸水浴水解提取花青素，操作簡便；提取樣品無需再凈化，直接過濾膜就可上機檢測；應(yīng)用高效液相色譜儀，采用Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，花青素與樣品中的干擾物有效分離，從而達到準確定量。通過添加不同水平的6種花色素標準溶液，證明本方法精密度好、準確度高，是一種高效、準確、實用的方法。該方法的建立為黑果枸杞的產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定理論與實踐基礎(chǔ)，為黑果枸杞的開發(fā)和利用提供數(shù)據(jù)支撐。

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Determination of Anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

ZHAO Zi-dan，GE Qian，NIU Yan，WANG Xiao-jing*，ZHANG Yan
（Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products of Ningxia，Yinchuan 750002，Ningxia，China）

A high performance liquid chromatographic（HPLC）method was estabolished for the determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr..The anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.were extracted ultrasound with acidified ethanol，and then hydrolyzed into major anthocyanins in boiling water bath.A mixture of acetonitrile and 0.1%phosphoric acid was used as the mobile phase gradient elution for the chromatographic separation on Agilent-ZORBAX SB-C18 column by HPLC-UV detector.The six kinds of anthocyanidins including cyanidin，pelargonidin，delphinidin，peonidin，petunidin and malvidin were detected at 525 nm wavelength.Results showed that the linearity of the method（r>0.999）was good over the concentration range from 0.2 mg/L to 100 mg/L for six anthocyanidins.The limits of detection（LODs）of cyanidin，pelargonidinm，delphinidin，peonidin and malvidin were 0.02 mg/L，and the LOD of petunidin was 0.05 mg/L.The ranges of spiked average recoveries at different levels were 84%-106%with the relative standard deviations（RSDs）of 0.5%-7.9%in a real sample.

Lycium ruthenicum Murr.；anthocyanidin；hydrolysis；high-performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.027

2016-09-22

寧夏農(nóng)林科學(xué)院院科技先導(dǎo)資金項目(NKYQ-14-06)；農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管局特質(zhì)性食用農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)組分識別與驗證評估項目（GJFP201601501）

趙子丹（1985—），女（漢），助理研究員，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究。

*通信作者：王曉菁（1972—），女（漢），研究員，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)與安全檢測研究。