基于響應(yīng)面法優(yōu)化?；创莶枧浞降难芯?/h1>
2017-06-22 13:25莫韓御蘇小軍李清明郭時(shí)印
食品研究與開發(fā) 2017年12期
莫韓御，蘇小軍，2，3，李清明，郭時(shí)印，*
（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省作物種植創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128；3.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128）
基于響應(yīng)面法優(yōu)化?；创莶枧浞降难芯?/p>
莫韓御1，蘇小軍1，2，3，李清明1，郭時(shí)印1，*
（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省作物種植創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128；3.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128）
為了開發(fā)出一款功能型袋泡茶，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化袋泡茶配方：以干桑葉、干淮山片作為原料，經(jīng)過打粉、過篩、裝袋、沖泡后，以感官評定和體外降糖抑制率作為評價(jià)指標(biāo)，分別探討了桑葉產(chǎn)地、每包凈重、桑葉粒度和?；促|(zhì)量比對桑淮袋泡茶的的影響；在感官評定優(yōu)秀的基礎(chǔ)上，再通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化分析每包凈重、桑葉粒度和桑淮質(zhì)量比對?；创莶梵w外降糖抑制率的影響。結(jié)果表明：用廣東產(chǎn)地的干桑葉，每包凈重4.14 g，桑葉粒度為18目，?；促|(zhì)量比5∶1確定為?；创莶璧难兄婆浞?。
桑葉；袋泡茶；降糖；Box-Behnken響應(yīng)面法
桑屬?？疲∕oraceae），是具有400多年歷史的藥食同源草本植物[1]。桑葉（Mori Folium）是植物桑Morus alba L.的干燥葉[2]，最常用做蠶的食物，也可用于民間用藥[3]，用來民間治療Ⅱ型糖尿病等相關(guān)的慢性病[4-8]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，桑葉富含生物堿類成分、黃酮類成分、多糖類成分、有機(jī)酸類成分、微量元素等[9]多種生物活性成分，具有降血脂[10]、降血糖[11]、降血壓[12]、抗氧化[13]、抗炎[14]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[15]、抗腫瘤[16]、抗驚厥[17]和血管擴(kuò)張[18]的作用。
淮山又稱山藥，是傳統(tǒng)藥食兩用植物，是薯蕷科（Dioscoreaceae）植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb）的塊莖[19]?；瓷狡湮陡市云?，具有提高免疫功能、改善消化功能、促進(jìn)降血糖血脂等功效，可用于治療肺虛咳喘、脾虛久瀉、糖尿病等癥狀[20]。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病是一種由于體內(nèi)胰島素分泌相對或絕對不足而引起的以糖代謝紊亂為主要特征的內(nèi)分泌代謝性疾病[21]，其發(fā)病率不斷增長，目前已成為發(fā)達(dá)國家中繼心血管和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[22]。為開發(fā)具有輔助降糖功效的天然食品，提高桑葉和淮山的使用價(jià)值，本試驗(yàn)對?；唇堤谴莶璧呐浞胶凸に囘M(jìn)行了研究。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
干桑葉、干淮山片：養(yǎng)天和大藥房；α-葡萄糖苷酶：Sigma-Aldrich試劑公司；對-硝基苯酚99.5%（4-Nitrophenol，PNP）分析標(biāo)準(zhǔn)品、對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷 99%（4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）：阿拉?。话⒖úㄌ牵ˋcarbose）：德國拜耳；無水碳酸鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8）：廈門海標(biāo)科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
可見光分光光度計(jì)（WFJ7200）：尤尼柯上海儀器公司；多功能粉碎機(jī)（750T）：鉑歐五金廠；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-6）：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；電子天平（BSA224S）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Dragon Lab移液槍（100μL～1000μL；1000μL～5000 μL）：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；冷凍離心機(jī)（5804R）：德國Eppendorf公司。
1.3 袋泡茶工藝流程
干桑葉、干淮山片→粉碎→過篩→調(diào)配裝袋→包裝→滅菌→成品→分析檢測
1.4 方法
1.4.1 ?；创莶枧浞降膬?yōu)化
用規(guī)格為6 cm×8 cm的抽線玉米纖維茶袋，淮山產(chǎn)地為河南，以感官評定和體外降糖抑制率作為評判指標(biāo)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置初始條件為桑葉產(chǎn)地為廣東、每包凈重為4 g、桑葉粒度為20目、?；促|(zhì)量比為6∶1，采取考察一個(gè)因素，固定其他因素的方法，考察各因素變化對感官評定和體外降糖抑制率的影響，平行3次。通過單因素試驗(yàn)的測定，在感官品質(zhì)好的因素水平基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則，采取對體外降糖抑制率影響較為顯著的因素，對配方進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。
1.4.2 感官評定
參考GB/T 23776-2009《茶葉感官評審方法》[23]和GB/T 24690-2009《袋泡茶》制定標(biāo)準(zhǔn)[24]，并結(jié)合本產(chǎn)品特點(diǎn)，從袋泡茶的香氣、滋味、色澤、料包四方面制定感官評定表，見表1。
表1 感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Graded standard of sense quality
組織有食品專業(yè)背景或有感官評定經(jīng)驗(yàn)的6人組成感官評定小組，每5種試樣為一批，在進(jìn)行品評時(shí)隨機(jī)放置。每次只對一個(gè)指標(biāo)評價(jià)，6人評分的平均值為樣品的評價(jià)值。
1.4.3 降糖功效的測定
1.4.3.1 繪制PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線
精確稱取PNP標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，加超純水定容至100 mL容量瓶中，搖勻即為母液。精確吸取母液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，分別置于25 mL具塞刻度管中加超純水稀釋至10 mL，得10個(gè)質(zhì)量濃度梯度：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 mg/mL，搖勻后靜置10 min，每個(gè)梯度平行3次，于400 nm處測定分光光度計(jì)的吸光值。將10個(gè)梯度的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，以標(biāo)準(zhǔn)品PNP濃度梯度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=21.182x+0.030 3，R2=0.999 6。
1.4.3.2 樣品溶液的提取
將袋泡茶用150 mL、100℃熱水沖泡5 min后，取20 mL茶湯于離心管，加入2 g活性炭，震蕩混勻后4 000 r/min離心10 min，注射器吸取后用0.2 μm濾膜過濾，得到樣品溶液。
1.4.3.3 α-葡萄糖苷酶體外降糖抑制實(shí)驗(yàn)
根據(jù)Li的方法[25]并通過預(yù)試驗(yàn)調(diào)整劑量，用0.3mL α-葡萄糖苷酶模擬人體小腸上端消化吸收糖分，以0.4 mL無色PNPG溶液作為底物，在37℃的水浴條件下反應(yīng)可生成產(chǎn)物PNP，反應(yīng)體系呈黃色。如果有抑制劑的加入，反應(yīng)體系中生成產(chǎn)物PNP的量將會(huì)減少，黃色變淺。試驗(yàn)分為樣品組、陽性對照組和空白組：樣品組的抑制劑為0.1 mL的樣品溶液，陽性對照組的抑制劑為0.1 mL的阿卡波糖溶液，空白對照組的抑制劑為0.1 mL的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8），37℃的水浴中反應(yīng)30 min后，加入0.8 mL終止溶液Na2CO3溶液，震蕩搖勻，加超純水定容至5 mL，在400 nm分光光度計(jì)測定的吸光值。反應(yīng)體系中各物質(zhì)濃度分別為：α-葡萄糖苷酶為2 U/mL；PNPG為2 mg/mL；阿卡波糖為5 mg/mL；Na2CO3溶液為25 mg/mL。
抑制率/%=（X空白-X樣品）/X空白×100
式中：X空白為空白組生成物PNP的平均質(zhì)量濃度（mg/mL）；X樣品為樣品組生成物PNP的平均質(zhì)量濃度（mg/mL）。
1.4.4 數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用WPS Office 2016、Design-Expect V.8.0.6和SPSS工具進(jìn)行處理，用Duncan多重比較法檢測數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 桑葉產(chǎn)地對袋泡茶成品質(zhì)量的影響
桑葉產(chǎn)地對袋泡茶成品質(zhì)量的影響見圖1。
圖1 桑葉產(chǎn)地對袋泡茶成品質(zhì)量的影響Fig.1 The effect of different place of origin of mulberry leaves on the quality of teabag
如圖1所示，桑葉產(chǎn)地對袋泡茶品質(zhì)有一定影響。廣東產(chǎn)地的桑葉袋泡茶有桑葉的清香，茶色深淺適中有光澤，入口柔順，料包均勻無破損，感官評分85.8分，抑制率63.60%，較其他產(chǎn)地更強(qiáng)；湖南產(chǎn)地的桑葉袋泡茶雖在香氣上比安徽產(chǎn)地的更明顯，色澤和滋味上得分不及安徽的高，總體感官評分低于安徽，同時(shí)抑制率也比安徽低；但與茶色平淡、口感無奇的河南和江蘇產(chǎn)地的兩種桑葉袋泡茶相比，湖南產(chǎn)地的感官評分和抑制率更好。
2.1.2 每包凈重對袋泡茶成品質(zhì)量的影響
每包凈重對袋泡茶成品質(zhì)量的影響見圖2。
圖2 每包凈重對袋泡茶成品質(zhì)量的影響Fig.2 The effect of different net weight of teabag on the quality of teabag
如圖2所示，每包凈重對袋泡茶品質(zhì)有一定影響。隨著每包凈重的增加桑葉量也增加，桑葉清香更明顯但袋泡茶的色澤和口感由淡轉(zhuǎn)濃，抑制率越來越高，但從每包凈重4 g到每包凈重5 g時(shí)抑制率趨于平緩，就感官評價(jià)和產(chǎn)品成本出發(fā)，每包凈重為4 g時(shí)袋泡茶就可以達(dá)到香氣純正，有桑葉淮山復(fù)合清香味，入口柔和，色澤均勻呈棕色透明且無沉淀，料包均勻無破損，感官評分84分，抑制率為62.99%，是較佳每包凈重。
2.1.3 桑葉粒度對袋泡茶成品質(zhì)量的影響
桑葉粒度對袋泡茶成品質(zhì)量的影響見圖3。
圖3 ?；戳６燃?jí)對袋泡茶成品質(zhì)量的影響Fig.3 The effect of different grain size of mulberry leaves on the quality of teabag
如圖3所示，桑葉粒度對袋泡茶品質(zhì)有一定影響。隨著桑葉粒度變細(xì)（目數(shù)增加），袋泡茶色澤越淺、香氣越淡、口感越平，抑制率越小，可能因?yàn)榱６仍郊?xì)粒度間的空隙越小而密，不利于與水接觸；反之桑葉粒度的增加（目數(shù)減?。?，粒度間的空隙越大越松，雖然增加了與水的接觸面，但是過多的接觸面導(dǎo)致色澤太深影響感官評分，還增加了裝袋的難度，綜上分析桑葉粒度級(jí)為20目時(shí)，感官評分87.8分，抑制率為58.55%，是較佳桑葉粒度級(jí)。
2.1.4 ?；促|(zhì)量比對袋泡茶成品質(zhì)量的影響
?；促|(zhì)量比對袋泡茶成品質(zhì)量的影響見圖4。
圖4 ?；促|(zhì)量比對袋泡茶成品質(zhì)量的影響Fig.4 The effect of different quality ratio of mulberry leaves and yam on the quality of teabag
如圖4所示，?；促|(zhì)量比對袋泡茶品質(zhì)有一定影響。隨著桑葉比重的增加，袋泡茶的色澤加深，但對抑制率的提升由快到平緩。桑葉比重過小或不夠時(shí)，袋泡茶的香氣和滋味感官評分低。當(dāng)桑淮質(zhì)量比是6∶1時(shí)袋泡茶的感官品質(zhì)得分最高為86.4分，其次是桑淮質(zhì)量比為5∶1時(shí)感官評分為84.7分，但抑制率在5∶1時(shí)最佳，達(dá)到了71.52%，而抑制率在6∶1時(shí)為66.48%，綜合考慮這兩個(gè)水平的感官品質(zhì)都在80分以上，最終選擇5∶1作為較佳?；幢取?/p>
2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)
2.2.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果
通過SPSS將上述單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，運(yùn)用Design-Expect V8.0.6軟件，選擇每包凈重、桑葉粒度級(jí)、?；促|(zhì)量比3個(gè)影響因子設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對各因素進(jìn)行三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因子編碼值試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。因?yàn)閱我蛩卦囼?yàn)中感官評分都在75.4分～87.8分，均達(dá)到良好的感官品質(zhì)，所以將對α-葡萄糖苷酶的抑制率設(shè)為響應(yīng)面試驗(yàn)的評判標(biāo)準(zhǔn)。
2.2.2 模型的建立及方差分析
運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。分別對各因素進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)回歸模型擬合。得到的數(shù)學(xué)模型為：
表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and test result
Y（抑制率）=71.45+4.16A-3.50B+0.33C-2.33AB-0.62AC-1.16BC-17.32A2-7.58B2-4.77C2
從方差分析及相關(guān)系數(shù)見表4。
表4 方差分析Table 4ANOVA
續(xù)表4 方差分析Continue table 4 ANOVA
可知，試驗(yàn)所選的二次多項(xiàng)式模型F=731.71，模型的P值<0.000 1，具有極顯著性，說明模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)在P=0.05水平上影響不顯著（P=0.127 5＞0.05），說明該模型無失擬，對模型有利，擬合程度良好可以很好地反映過程，具有實(shí)用價(jià)值；整個(gè)模型的決定系數(shù)R2=0.998 2，說明響應(yīng)值的變化有99.82%來源于所選因素，模型的校正決定系數(shù)Adj R2=0.995 8，僅有總變異的0.42%不能用此模型來解釋，進(jìn)一步說明該模型擬合度好，能很好地描述試驗(yàn)結(jié)果；模型的相關(guān)系數(shù)Pred R2=0.976 2，說明預(yù)測值與實(shí)測值之間具有高度的相關(guān)性?；貧w模型中一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB及二次項(xiàng)A2、B2、C2的P值均<0.01，達(dá)到級(jí)顯著，交互項(xiàng)BC的P值小于0.05達(dá)到顯著，而其余項(xiàng)顯著性較差，說明各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值是非線性關(guān)系。通過對回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對值大小比較，結(jié)合方差分析表中F值，可得到影響抑制率的主次順序，在桑葉產(chǎn)地為廣東的條件下，每包凈重對袋泡茶體外降糖抑制率的影響最大，其次是桑葉粒度，最后為?；幢龋矗篈>B>C。
2.2.3 交互作用分析及最佳配方的確定
響應(yīng)面的曲面變化及等高線橢圓形狀結(jié)合表4可以反映因素的交互作用。響應(yīng)面坡度越陡峭，說明響應(yīng)值對因素的改變越敏感，反之響應(yīng)面的曲面坡度越平緩，說明響應(yīng)值對因素的改變越遲鈍，根據(jù)回歸方程分析結(jié)果，作出綜合效應(yīng)隨因素變化的響應(yīng)面圖，如圖5～圖7所示，反映了各顯著影響因素交互作用對響應(yīng)值的影響。
圖5 每包凈重和桑葉粒度級(jí)對袋泡茶體外降糖抑制率的影響Fig.5 Effect of net weight of teabag and grain size of mulberry leaves on in vitro hypoglycemic inhibition rate of teabag
圖6 每包凈重和?；促|(zhì)量比對袋泡茶體外降糖抑制率的影響Fig.6 Effect of net weight of teabag and quality ratio of mulberry leaves and yam on in vitro hypoglycemic inhibition rate of teabag
圖7 桑葉粒度級(jí)和桑淮質(zhì)量比對袋泡茶體外降糖抑制率的影響Fig.7 Effect of quality ratio of mulberry leaves and yam and grain size of mulberry leaves on in vitro hypoglycemic inhibition rate of teabag
由圖5可知，每包凈重和桑葉粒度的交互作用十分顯著。抑制率隨每包凈重的增加和桑葉粒度變細(xì)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。由圖6可知，每包凈重和?；幢鹊慕换プ饔幂^不顯著。抑制率隨每包凈重和?；促|(zhì)量比的增加均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。由圖7可知，桑葉粒度和?；促|(zhì)量比的交互作用較顯著。在桑葉粒度較粗的情況下，抑制率隨?；促|(zhì)量比的增加趨勢變化不太明顯，隨著桑葉粒度的變粗，抑制率的趨勢為先緩慢升高后下降。
由Design-Expert 8.0.6分析軟件的響應(yīng)優(yōu)化器對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化后，該模型預(yù)測最優(yōu)解為每包凈重4.14 g，桑葉粒度為17.44目，桑淮質(zhì)量比為5.06∶1，在此條件下，抑制率的理論值為72.19%。根據(jù)實(shí)際操作的局限性，將袋泡茶的配方工藝條件修正為每包凈重4.14 g，桑葉粒度18目，?；促|(zhì)量比5∶1。
2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)
按優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果綜合效應(yīng)值分別為72.17%，71.57%，72.71%，與理論預(yù)測值基本吻合，說明該模型預(yù)測較好，得到的擬合方程可較好地描述因素與指標(biāo)的關(guān)系，說明利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化桑葉淮山袋泡茶配方工藝是可行的。
3 結(jié)論
以桑葉作為主要原料，淮山作為輔料，通過α-葡萄糖體外降糖抑制試驗(yàn)證明，?；创莶杈哂幸欢ń堤枪π?。通過人工品嘗和體外降糖抑制試驗(yàn)篩選單因素最優(yōu)條件，即桑葉產(chǎn)地：廣東；桑葉粒度級(jí)：20目；?；纯傎|(zhì)量/包：4 g；?；促|(zhì)量比：5∶1。再采用了Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行擬合，充分考慮了各因素之間的相互作用，得到了明確的回歸方程Y=71.45+4.16A-3.50B+0.33C-2.33AB-0.62AC-1.16BC-17.32A2-7.58B2-4.77C2，通過方差分析來預(yù)測結(jié)果，預(yù)測最佳結(jié)果為，在桑葉產(chǎn)地為廣東的條件下，每包凈重4.14 g，桑葉粒度17.44目，?；促|(zhì)量比5.06∶1，理論抑制率為72.193 4%。為提高試驗(yàn)的預(yù)測性和準(zhǔn)確性，再經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)表明該方法合理穩(wěn)定，可利用此模型優(yōu)化桑葉淮山袋泡茶的配方工藝，對具有降糖功效的袋泡茶和桑葉的開發(fā)利用有一定的指導(dǎo)意義。
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Optimization of Recipe of Mulberry and Yam Teabag by Response Surface Methodology
MO Han-yu1，SU Xiao-jun1，2，3，LI Qing-ming1，GUO Shi-yin1，*
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2.Hunan Province Key Laboratory of Crop Cultivation and Resource Utilization，Changsha 410128，Hunan，China；3.Hunan Collaborative Innovation for Utilization of Botanical Function Ingredient，Changsha 410128，Hunan，China）
In order to develop a functional teabag tea，single factor experiments and response surface methodology were used to optimize the teabag recipe：the dry mulberry leaves and dried yam slices were used as raw materials.After the powder，sieving，bagging and brewing，sensory evaluation and in vitro hypoglycemic inhibition rate were used as evaluation indexes.The effects of mulberry leaf origin，net weight per pack，mulberry leaf grain size and mulberry and yam quality ratio on mulberry-yam tea were discussed respectively.Then，based onthe excellent method of sensory evaluation，the effects of net weight per bag，mulberry leaf size and mulberry quality on the hypoglycemia inhibition rate of mulberry-yam tea were analyzed by Box-Behnken response surface method.The results showed that the dry mulberry leaves in Guangdong were 4.14 g per bag，and the grain size of mulberry leaves was 18 mesh.The quality ratio of mulberry leaves and yam was 5∶1.
mulberry leaf；teabag；hypoglycemic；Box-Behnken response surface method
10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.017
2017-03-27
湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（14B091）
莫韓御（1992—），女(漢)，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。
*通信作者：郭時(shí)?。?975—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)，功能食品。
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莫韓御，蘇小軍，2，3，李清明，郭時(shí)印，*
（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省作物種植創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128；3.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128）
基于響應(yīng)面法優(yōu)化?；创莶枧浞降难芯?/p>
莫韓御1，蘇小軍1，2，3，李清明1，郭時(shí)印1，*
（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省作物種植創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128；3.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128）
為了開發(fā)出一款功能型袋泡茶，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化袋泡茶配方：以干桑葉、干淮山片作為原料，經(jīng)過打粉、過篩、裝袋、沖泡后，以感官評定和體外降糖抑制率作為評價(jià)指標(biāo)，分別探討了桑葉產(chǎn)地、每包凈重、桑葉粒度和?；促|(zhì)量比對桑淮袋泡茶的的影響；在感官評定優(yōu)秀的基礎(chǔ)上，再通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化分析每包凈重、桑葉粒度和桑淮質(zhì)量比對?；创莶梵w外降糖抑制率的影響。結(jié)果表明：用廣東產(chǎn)地的干桑葉，每包凈重4.14 g，桑葉粒度為18目，?；促|(zhì)量比5∶1確定為?；创莶璧难兄婆浞?。
桑葉；袋泡茶；降糖；Box-Behnken響應(yīng)面法
桑屬?？疲∕oraceae），是具有400多年歷史的藥食同源草本植物[1]。桑葉（Mori Folium）是植物桑Morus alba L.的干燥葉[2]，最常用做蠶的食物，也可用于民間用藥[3]，用來民間治療Ⅱ型糖尿病等相關(guān)的慢性病[4-8]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，桑葉富含生物堿類成分、黃酮類成分、多糖類成分、有機(jī)酸類成分、微量元素等[9]多種生物活性成分，具有降血脂[10]、降血糖[11]、降血壓[12]、抗氧化[13]、抗炎[14]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[15]、抗腫瘤[16]、抗驚厥[17]和血管擴(kuò)張[18]的作用。
淮山又稱山藥，是傳統(tǒng)藥食兩用植物，是薯蕷科（Dioscoreaceae）植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb）的塊莖[19]?；瓷狡湮陡市云?，具有提高免疫功能、改善消化功能、促進(jìn)降血糖血脂等功效，可用于治療肺虛咳喘、脾虛久瀉、糖尿病等癥狀[20]。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病是一種由于體內(nèi)胰島素分泌相對或絕對不足而引起的以糖代謝紊亂為主要特征的內(nèi)分泌代謝性疾病[21]，其發(fā)病率不斷增長，目前已成為發(fā)達(dá)國家中繼心血管和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[22]。為開發(fā)具有輔助降糖功效的天然食品，提高桑葉和淮山的使用價(jià)值，本試驗(yàn)對?；唇堤谴莶璧呐浞胶凸に囘M(jìn)行了研究。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
干桑葉、干淮山片：養(yǎng)天和大藥房；α-葡萄糖苷酶：Sigma-Aldrich試劑公司；對-硝基苯酚99.5%（4-Nitrophenol，PNP）分析標(biāo)準(zhǔn)品、對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷 99%（4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）：阿拉?。话⒖úㄌ牵ˋcarbose）：德國拜耳；無水碳酸鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8）：廈門海標(biāo)科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
可見光分光光度計(jì)（WFJ7200）：尤尼柯上海儀器公司；多功能粉碎機(jī)（750T）：鉑歐五金廠；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-6）：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；電子天平（BSA224S）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Dragon Lab移液槍（100μL～1000μL；1000μL～5000 μL）：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；冷凍離心機(jī)（5804R）：德國Eppendorf公司。
1.3 袋泡茶工藝流程
干桑葉、干淮山片→粉碎→過篩→調(diào)配裝袋→包裝→滅菌→成品→分析檢測
1.4 方法
1.4.1 ?；创莶枧浞降膬?yōu)化
用規(guī)格為6 cm×8 cm的抽線玉米纖維茶袋，淮山產(chǎn)地為河南，以感官評定和體外降糖抑制率作為評判指標(biāo)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置初始條件為桑葉產(chǎn)地為廣東、每包凈重為4 g、桑葉粒度為20目、?；促|(zhì)量比為6∶1，采取考察一個(gè)因素，固定其他因素的方法，考察各因素變化對感官評定和體外降糖抑制率的影響，平行3次。通過單因素試驗(yàn)的測定，在感官品質(zhì)好的因素水平基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則，采取對體外降糖抑制率影響較為顯著的因素，對配方進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。
1.4.2 感官評定
參考GB/T 23776-2009《茶葉感官評審方法》[23]和GB/T 24690-2009《袋泡茶》制定標(biāo)準(zhǔn)[24]，并結(jié)合本產(chǎn)品特點(diǎn)，從袋泡茶的香氣、滋味、色澤、料包四方面制定感官評定表，見表1。
表1 感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Graded standard of sense quality
組織有食品專業(yè)背景或有感官評定經(jīng)驗(yàn)的6人組成感官評定小組，每5種試樣為一批，在進(jìn)行品評時(shí)隨機(jī)放置。每次只對一個(gè)指標(biāo)評價(jià)，6人評分的平均值為樣品的評價(jià)值。
1.4.3 降糖功效的測定
1.4.3.1 繪制PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線
精確稱取PNP標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，加超純水定容至100 mL容量瓶中，搖勻即為母液。精確吸取母液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，分別置于25 mL具塞刻度管中加超純水稀釋至10 mL，得10個(gè)質(zhì)量濃度梯度：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 mg/mL，搖勻后靜置10 min，每個(gè)梯度平行3次，于400 nm處測定分光光度計(jì)的吸光值。將10個(gè)梯度的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，以標(biāo)準(zhǔn)品PNP濃度梯度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=21.182x+0.030 3，R2=0.999 6。
1.4.3.2 樣品溶液的提取
將袋泡茶用150 mL、100℃熱水沖泡5 min后，取20 mL茶湯于離心管，加入2 g活性炭，震蕩混勻后4 000 r/min離心10 min，注射器吸取后用0.2 μm濾膜過濾，得到樣品溶液。
1.4.3.3 α-葡萄糖苷酶體外降糖抑制實(shí)驗(yàn)
根據(jù)Li的方法[25]并通過預(yù)試驗(yàn)調(diào)整劑量，用0.3mL α-葡萄糖苷酶模擬人體小腸上端消化吸收糖分，以0.4 mL無色PNPG溶液作為底物，在37℃的水浴條件下反應(yīng)可生成產(chǎn)物PNP，反應(yīng)體系呈黃色。如果有抑制劑的加入，反應(yīng)體系中生成產(chǎn)物PNP的量將會(huì)減少，黃色變淺。試驗(yàn)分為樣品組、陽性對照組和空白組：樣品組的抑制劑為0.1 mL的樣品溶液，陽性對照組的抑制劑為0.1 mL的阿卡波糖溶液，空白對照組的抑制劑為0.1 mL的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8），37℃的水浴中反應(yīng)30 min后，加入0.8 mL終止溶液Na2CO3溶液，震蕩搖勻，加超純水定容至5 mL，在400 nm分光光度計(jì)測定的吸光值。反應(yīng)體系中各物質(zhì)濃度分別為：α-葡萄糖苷酶為2 U/mL；PNPG為2 mg/mL；阿卡波糖為5 mg/mL；Na2CO3溶液為25 mg/mL。
抑制率/%=（X空白-X樣品）/X空白×100
式中：X空白為空白組生成物PNP的平均質(zhì)量濃度（mg/mL）；X樣品為樣品組生成物PNP的平均質(zhì)量濃度（mg/mL）。
1.4.4 數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用WPS Office 2016、Design-Expect V.8.0.6和SPSS工具進(jìn)行處理，用Duncan多重比較法檢測數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 桑葉產(chǎn)地對袋泡茶成品質(zhì)量的影響
桑葉產(chǎn)地對袋泡茶成品質(zhì)量的影響見圖1。
圖1 桑葉產(chǎn)地對袋泡茶成品質(zhì)量的影響Fig.1 The effect of different place of origin of mulberry leaves on the quality of teabag
如圖1所示，桑葉產(chǎn)地對袋泡茶品質(zhì)有一定影響。廣東產(chǎn)地的桑葉袋泡茶有桑葉的清香，茶色深淺適中有光澤，入口柔順，料包均勻無破損，感官評分85.8分，抑制率63.60%，較其他產(chǎn)地更強(qiáng)；湖南產(chǎn)地的桑葉袋泡茶雖在香氣上比安徽產(chǎn)地的更明顯，色澤和滋味上得分不及安徽的高，總體感官評分低于安徽，同時(shí)抑制率也比安徽低；但與茶色平淡、口感無奇的河南和江蘇產(chǎn)地的兩種桑葉袋泡茶相比，湖南產(chǎn)地的感官評分和抑制率更好。
2.1.2 每包凈重對袋泡茶成品質(zhì)量的影響
每包凈重對袋泡茶成品質(zhì)量的影響見圖2。
圖2 每包凈重對袋泡茶成品質(zhì)量的影響Fig.2 The effect of different net weight of teabag on the quality of teabag
如圖2所示，每包凈重對袋泡茶品質(zhì)有一定影響。隨著每包凈重的增加桑葉量也增加，桑葉清香更明顯但袋泡茶的色澤和口感由淡轉(zhuǎn)濃，抑制率越來越高，但從每包凈重4 g到每包凈重5 g時(shí)抑制率趨于平緩，就感官評價(jià)和產(chǎn)品成本出發(fā)，每包凈重為4 g時(shí)袋泡茶就可以達(dá)到香氣純正，有桑葉淮山復(fù)合清香味，入口柔和，色澤均勻呈棕色透明且無沉淀，料包均勻無破損，感官評分84分，抑制率為62.99%，是較佳每包凈重。
2.1.3 桑葉粒度對袋泡茶成品質(zhì)量的影響
桑葉粒度對袋泡茶成品質(zhì)量的影響見圖3。
圖3 ?；戳６燃?jí)對袋泡茶成品質(zhì)量的影響Fig.3 The effect of different grain size of mulberry leaves on the quality of teabag
如圖3所示，桑葉粒度對袋泡茶品質(zhì)有一定影響。隨著桑葉粒度變細(xì)（目數(shù)增加），袋泡茶色澤越淺、香氣越淡、口感越平，抑制率越小，可能因?yàn)榱６仍郊?xì)粒度間的空隙越小而密，不利于與水接觸；反之桑葉粒度的增加（目數(shù)減?。?，粒度間的空隙越大越松，雖然增加了與水的接觸面，但是過多的接觸面導(dǎo)致色澤太深影響感官評分，還增加了裝袋的難度，綜上分析桑葉粒度級(jí)為20目時(shí)，感官評分87.8分，抑制率為58.55%，是較佳桑葉粒度級(jí)。
2.1.4 ?；促|(zhì)量比對袋泡茶成品質(zhì)量的影響
?；促|(zhì)量比對袋泡茶成品質(zhì)量的影響見圖4。
圖4 ?；促|(zhì)量比對袋泡茶成品質(zhì)量的影響Fig.4 The effect of different quality ratio of mulberry leaves and yam on the quality of teabag
如圖4所示，?；促|(zhì)量比對袋泡茶品質(zhì)有一定影響。隨著桑葉比重的增加，袋泡茶的色澤加深，但對抑制率的提升由快到平緩。桑葉比重過小或不夠時(shí)，袋泡茶的香氣和滋味感官評分低。當(dāng)桑淮質(zhì)量比是6∶1時(shí)袋泡茶的感官品質(zhì)得分最高為86.4分，其次是桑淮質(zhì)量比為5∶1時(shí)感官評分為84.7分，但抑制率在5∶1時(shí)最佳，達(dá)到了71.52%，而抑制率在6∶1時(shí)為66.48%，綜合考慮這兩個(gè)水平的感官品質(zhì)都在80分以上，最終選擇5∶1作為較佳?；幢取?/p>
2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)
2.2.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果
通過SPSS將上述單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，運(yùn)用Design-Expect V8.0.6軟件，選擇每包凈重、桑葉粒度級(jí)、?；促|(zhì)量比3個(gè)影響因子設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對各因素進(jìn)行三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因子編碼值試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。因?yàn)閱我蛩卦囼?yàn)中感官評分都在75.4分～87.8分，均達(dá)到良好的感官品質(zhì)，所以將對α-葡萄糖苷酶的抑制率設(shè)為響應(yīng)面試驗(yàn)的評判標(biāo)準(zhǔn)。
2.2.2 模型的建立及方差分析
運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。分別對各因素進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)回歸模型擬合。得到的數(shù)學(xué)模型為：
表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and test result
Y（抑制率）=71.45+4.16A-3.50B+0.33C-2.33AB-0.62AC-1.16BC-17.32A2-7.58B2-4.77C2
從方差分析及相關(guān)系數(shù)見表4。
表4 方差分析Table 4ANOVA
續(xù)表4 方差分析Continue table 4 ANOVA
可知，試驗(yàn)所選的二次多項(xiàng)式模型F=731.71，模型的P值<0.000 1，具有極顯著性，說明模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)在P=0.05水平上影響不顯著（P=0.127 5＞0.05），說明該模型無失擬，對模型有利，擬合程度良好可以很好地反映過程，具有實(shí)用價(jià)值；整個(gè)模型的決定系數(shù)R2=0.998 2，說明響應(yīng)值的變化有99.82%來源于所選因素，模型的校正決定系數(shù)Adj R2=0.995 8，僅有總變異的0.42%不能用此模型來解釋，進(jìn)一步說明該模型擬合度好，能很好地描述試驗(yàn)結(jié)果；模型的相關(guān)系數(shù)Pred R2=0.976 2，說明預(yù)測值與實(shí)測值之間具有高度的相關(guān)性?；貧w模型中一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB及二次項(xiàng)A2、B2、C2的P值均<0.01，達(dá)到級(jí)顯著，交互項(xiàng)BC的P值小于0.05達(dá)到顯著，而其余項(xiàng)顯著性較差，說明各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值是非線性關(guān)系。通過對回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對值大小比較，結(jié)合方差分析表中F值，可得到影響抑制率的主次順序，在桑葉產(chǎn)地為廣東的條件下，每包凈重對袋泡茶體外降糖抑制率的影響最大，其次是桑葉粒度，最后為?；幢龋矗篈>B>C。
2.2.3 交互作用分析及最佳配方的確定
響應(yīng)面的曲面變化及等高線橢圓形狀結(jié)合表4可以反映因素的交互作用。響應(yīng)面坡度越陡峭，說明響應(yīng)值對因素的改變越敏感，反之響應(yīng)面的曲面坡度越平緩，說明響應(yīng)值對因素的改變越遲鈍，根據(jù)回歸方程分析結(jié)果，作出綜合效應(yīng)隨因素變化的響應(yīng)面圖，如圖5～圖7所示，反映了各顯著影響因素交互作用對響應(yīng)值的影響。
圖5 每包凈重和桑葉粒度級(jí)對袋泡茶體外降糖抑制率的影響Fig.5 Effect of net weight of teabag and grain size of mulberry leaves on in vitro hypoglycemic inhibition rate of teabag
圖6 每包凈重和?；促|(zhì)量比對袋泡茶體外降糖抑制率的影響Fig.6 Effect of net weight of teabag and quality ratio of mulberry leaves and yam on in vitro hypoglycemic inhibition rate of teabag
圖7 桑葉粒度級(jí)和桑淮質(zhì)量比對袋泡茶體外降糖抑制率的影響Fig.7 Effect of quality ratio of mulberry leaves and yam and grain size of mulberry leaves on in vitro hypoglycemic inhibition rate of teabag
由圖5可知，每包凈重和桑葉粒度的交互作用十分顯著。抑制率隨每包凈重的增加和桑葉粒度變細(xì)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。由圖6可知，每包凈重和?；幢鹊慕换プ饔幂^不顯著。抑制率隨每包凈重和?；促|(zhì)量比的增加均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。由圖7可知，桑葉粒度和?；促|(zhì)量比的交互作用較顯著。在桑葉粒度較粗的情況下，抑制率隨?；促|(zhì)量比的增加趨勢變化不太明顯，隨著桑葉粒度的變粗，抑制率的趨勢為先緩慢升高后下降。
由Design-Expert 8.0.6分析軟件的響應(yīng)優(yōu)化器對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化后，該模型預(yù)測最優(yōu)解為每包凈重4.14 g，桑葉粒度為17.44目，桑淮質(zhì)量比為5.06∶1，在此條件下，抑制率的理論值為72.19%。根據(jù)實(shí)際操作的局限性，將袋泡茶的配方工藝條件修正為每包凈重4.14 g，桑葉粒度18目，?；促|(zhì)量比5∶1。
2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)
按優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果綜合效應(yīng)值分別為72.17%，71.57%，72.71%，與理論預(yù)測值基本吻合，說明該模型預(yù)測較好，得到的擬合方程可較好地描述因素與指標(biāo)的關(guān)系，說明利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化桑葉淮山袋泡茶配方工藝是可行的。
3 結(jié)論
以桑葉作為主要原料，淮山作為輔料，通過α-葡萄糖體外降糖抑制試驗(yàn)證明，?；创莶杈哂幸欢ń堤枪π?。通過人工品嘗和體外降糖抑制試驗(yàn)篩選單因素最優(yōu)條件，即桑葉產(chǎn)地：廣東；桑葉粒度級(jí)：20目；?；纯傎|(zhì)量/包：4 g；?；促|(zhì)量比：5∶1。再采用了Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行擬合，充分考慮了各因素之間的相互作用，得到了明確的回歸方程Y=71.45+4.16A-3.50B+0.33C-2.33AB-0.62AC-1.16BC-17.32A2-7.58B2-4.77C2，通過方差分析來預(yù)測結(jié)果，預(yù)測最佳結(jié)果為，在桑葉產(chǎn)地為廣東的條件下，每包凈重4.14 g，桑葉粒度17.44目，?；促|(zhì)量比5.06∶1，理論抑制率為72.193 4%。為提高試驗(yàn)的預(yù)測性和準(zhǔn)確性，再經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)表明該方法合理穩(wěn)定，可利用此模型優(yōu)化桑葉淮山袋泡茶的配方工藝，對具有降糖功效的袋泡茶和桑葉的開發(fā)利用有一定的指導(dǎo)意義。
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Optimization of Recipe of Mulberry and Yam Teabag by Response Surface Methodology
MO Han-yu1，SU Xiao-jun1，2，3，LI Qing-ming1，GUO Shi-yin1，*
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2.Hunan Province Key Laboratory of Crop Cultivation and Resource Utilization，Changsha 410128，Hunan，China；3.Hunan Collaborative Innovation for Utilization of Botanical Function Ingredient，Changsha 410128，Hunan，China）
In order to develop a functional teabag tea，single factor experiments and response surface methodology were used to optimize the teabag recipe：the dry mulberry leaves and dried yam slices were used as raw materials.After the powder，sieving，bagging and brewing，sensory evaluation and in vitro hypoglycemic inhibition rate were used as evaluation indexes.The effects of mulberry leaf origin，net weight per pack，mulberry leaf grain size and mulberry and yam quality ratio on mulberry-yam tea were discussed respectively.Then，based onthe excellent method of sensory evaluation，the effects of net weight per bag，mulberry leaf size and mulberry quality on the hypoglycemia inhibition rate of mulberry-yam tea were analyzed by Box-Behnken response surface method.The results showed that the dry mulberry leaves in Guangdong were 4.14 g per bag，and the grain size of mulberry leaves was 18 mesh.The quality ratio of mulberry leaves and yam was 5∶1.
mulberry leaf；teabag；hypoglycemic；Box-Behnken response surface method
10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.017
2017-03-27
湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（14B091）
莫韓御（1992—），女(漢)，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。
*通信作者：郭時(shí)?。?975—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)，功能食品。
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