鐘艷梅，曾憲錄，鄭清梅，何曼怡

（嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州514015）

利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶澄清紅茶茶湯的研究

鐘艷梅，曾憲錄，鄭清梅，何曼怡

（嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州514015）

為得到優(yōu)質(zhì)紅茶飲料，利用外源木瓜蛋白酶和α-淀粉酶對(duì)紅茶茶湯進(jìn)行沉淀澄清研究。結(jié)果表明：兩種酶均能顯著提高茶湯透光率，起到澄清作用，且效果相當(dāng)。木瓜蛋白酶最佳反應(yīng)條件為酶添加量0.3 U/mL、作用溫度50℃、作用時(shí)間45 min、pH6；α-淀粉酶最佳反應(yīng)條件為酶添加量30 U/mL、作用溫度45℃、作用時(shí)間15 min、pH5，但在各自最佳條件下兩種酶未表現(xiàn)出協(xié)同作用。

木瓜蛋白酶；α-淀粉酶；紅茶；澄清

在我國(guó)茶飲料生產(chǎn)中，茶湯沉淀問(wèn)題成為制約其市場(chǎng)迅速發(fā)展的主要因素[1]?，F(xiàn)代茶學(xué)研究理論認(rèn)為，茶飲料沉淀形成主要是蛋白質(zhì)、茶多酚、咖啡堿等分子間氫鍵與疏水作用，茶湯溫度較高時(shí)，這些物質(zhì)各自呈游離狀態(tài)存在，但當(dāng)溫度降低，茶黃素、茶紅素及其沒(méi)食子酸酯等多酚類物質(zhì)的酚羥基，可分別與蛋白質(zhì)的肽鍵、咖啡堿以氫鍵結(jié)合形成絡(luò)合物，從而產(chǎn)生茶湯沉淀即“冷后渾”現(xiàn)象[2]。

沉淀形成不僅會(huì)影響茶飲料的風(fēng)味和外觀品質(zhì)，也會(huì)導(dǎo)致大量有效成分損失。酶法轉(zhuǎn)溶茶湯沉淀是近幾年來(lái)茶飲料加工技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一[3-6]，目前應(yīng)用較多的酶有單寧酶（Tannase）、果膠酶（Pectase）、木瓜蛋白酶（Papain）等，寧井銘[7]的研究結(jié)果表明，單寧酶、果膠酶、木瓜蛋白酶對(duì)綠茶茶湯抗沉淀影響達(dá)極顯著性水平，經(jīng)木瓜蛋白酶處理的茶湯蛋白質(zhì)含量減少，氨基酸含量有一定的增加；黃彤[8]也證實(shí)了上述3種酶能減少綠茶茶湯沉淀產(chǎn)生，此外還發(fā)現(xiàn)單寧酶和葡萄糖氧化酶具有復(fù)合作用，不僅能有效延緩綠茶茶湯貯存過(guò)程色度升高，還能顯著減少茶湯沉淀產(chǎn)生；Coopper[9]的研究也表明，經(jīng)木瓜蛋白酶處理的茶湯在0℃～2℃下過(guò)濾后，即使加入檸檬酸等物質(zhì)，在低溫下長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存也不會(huì)產(chǎn)生沉淀。另外，α-淀粉酶（α-Amylase）能夠分解茶湯中的淀粉物質(zhì)，提高茶湯的澄清度[10]。綜合目前國(guó)內(nèi)外液態(tài)茶飲料酶澄清技術(shù)來(lái)看，主要以單寧酶為主，但利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶來(lái)澄清紅茶茶湯的研究目前還鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究可為紅茶飲料加工提供技術(shù)上的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：梅州清涼山紅茶加工過(guò)程中的茶葉碎（含部分茶梗）。

T6可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；FB224電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH.SY11-N14數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州華冠儀器廠；L420臺(tái)式低速離心機(jī)：濟(jì)南博華儀器設(shè)備有限公司；木瓜蛋白酶（Papain，100 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；α-淀粉酶（α-Amylase，20 000 U/g）：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司。

1.2 紅茶茶湯制備

將紅茶粉碎過(guò)40目篩，茶水比1∶20（g/mL），超聲波輔助浸提20 min～30 min，浸提溫度60℃，冷卻后以3 500 r/min離心15 min得到紅茶茶湯。

1.3 單酶源澄清紅茶茶湯的研究

1.3.1 單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 酶不同添加量

分別取100 mL紅茶茶湯，調(diào)節(jié)pH值為6.0，木瓜蛋白酶分別按0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 U/mL的量添加，60℃水浴30 min；α-淀粉酶則分別按10、20、30、40、50、60 U/mL的量添加，60℃水浴10 min，以透光率為指標(biāo)分別篩選最佳酶添加量。

1.3.1.2 酶不同反應(yīng)溫度

木瓜蛋白酶添加量為0.2 U/mL，設(shè)置不同水浴溫度分別為45、50、55、60、65、70℃；α-淀粉酶添加量為20 U/mL，設(shè)置不同溫度為35、40、45、50、55、60℃，其它條件和處理同1.3.1.1，以透光率分別篩選最佳反應(yīng)溫度。

1.3.1.3 酶不同反應(yīng)時(shí)間

木瓜蛋白酶添加量0.2 U/mL，水浴溫度60℃，設(shè)置不同反應(yīng)時(shí)間分別為15、30、45、60、75、90 min；α-淀粉酶添加量20 U/mL，水浴溫度60℃，分別反應(yīng)5、10、15、20、25、30 min，其它條件和處理同1.3.1.2，以透光率分別篩選最佳酶反應(yīng)時(shí)間。

1.3.1.4 不同反應(yīng)pH值

木瓜蛋白酶添加量0.2 U/mL，設(shè)置不同反應(yīng)pH分別為3、4、5、6、7、8，60℃水浴30 min；α-淀粉酶添加量20 U/mL，pH設(shè)置與木瓜蛋白酶同，60℃水浴10 min，以透光率分別篩選最佳酶反應(yīng)pH值。

1.3.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別對(duì)兩種酶的添加量、水浴溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值主要影響因子進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，正交因素水平設(shè)計(jì)如表1。

1.4 木瓜蛋白酶與α-淀粉酶協(xié)同作用澄清紅茶茶湯的研究

先木瓜蛋白酶后α-淀粉酶（處理1）、先α-淀粉酶后木瓜蛋白酶（處理2）：兩種酶澄清紅茶茶湯時(shí)均采用正交優(yōu)化后的最佳試驗(yàn)條件，以無(wú)加酶和只加木瓜蛋白酶或α-淀粉酶作對(duì)照。

表1 單酶源澄清茶湯的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design of clarification of tea soup by single enzyme

1.5 透光率測(cè)定

將酶澄清處理后的紅茶湯沸水浴30 s終止反應(yīng)，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min后用錫箔紙密封，置于4℃下冷藏過(guò)夜，次日取出，待樣品恢復(fù)室溫后，以蒸餾水為參比，在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)其透光率。T=10-A（式中：T為透光率；A為吸光度）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2003和Originpro 8.5軟件進(jìn)行分析，采用Duncan法（P<0.05）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶源澄清紅茶茶湯結(jié)果

2.1.1 酶不同添加量對(duì)茶湯透光率的影響

酶不同添加量對(duì)茶湯透光率的影響結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 木瓜蛋白酶不同添加量的茶湯透光率Fig.1 The tea soup transmittance of different amount of papain

由圖1、圖2可知，兩種酶都有一個(gè)共同特點(diǎn)：即在一定濃度范圍內(nèi)，茶湯透光率隨著酶添加量增加而升高，說(shuō)明兩種酶對(duì)紅茶茶湯均有澄清作用，但濃度再增加時(shí)透光率變化趨勢(shì)平緩甚至略有下降，原因可能是酶固體制劑過(guò)多添加，導(dǎo)致酶殘留在茶湯中所致。由圖可知，木瓜蛋白酶最適添加量為0.4 U/mL，α-淀粉酶最適添加量為40 U/mL。

圖2 α-淀粉酶不同添加量的茶湯透光率Fig.2 The tea soup transmittance of different amount of αamylase

2.1.2 酶不同反應(yīng)溫度對(duì)茶湯透光率的影響

酶不同反應(yīng)溫度對(duì)茶湯透光率的影響如圖3、圖4所示。

圖3 木瓜蛋白酶不同反應(yīng)溫度的茶湯透光率Fig.3 The tea soup transmittance of different temperatures of papain

圖4 α-淀粉酶不同反應(yīng)溫度的茶湯透光率Fig.4 The tea soup transmittance of different temperatures of αamylase

由圖3、圖4可知，木瓜蛋白酶澄清茶湯時(shí)，在45℃～55℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高茶湯透光率迅速升高，在55℃時(shí)最高，但高于55℃時(shí)，透光率下降；而α-淀粉酶澄清茶湯時(shí)也有類似情況出現(xiàn)，在35℃～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高茶湯透光率升高，在50℃時(shí)最高，但溫度進(jìn)一步升高時(shí)，透光率迅速下降。原因可能是升溫加快酶失活的效應(yīng)占主導(dǎo)地位，特別是α-淀粉酶對(duì)溫度尤其敏感。因此，木瓜蛋白酶的最適溫度選擇55℃，α-淀粉酶最適溫度選擇50℃。

2.1.3 酶不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)茶湯透光率的影響

酶不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)茶湯透光率的影響如圖5、圖6所示。

圖5 木瓜蛋白酶不同反應(yīng)時(shí)間的茶湯透光率Fig.5 The tea soup transmittance of different times of papain

圖6 α-淀粉酶不同反應(yīng)時(shí)間的茶湯透光率Fig.6 The tea soup transmittance of different times of α-amylase

由圖5、圖6可知，木瓜蛋白酶作用時(shí)間在15 min～60 min范圍內(nèi)，茶湯透光率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間增加到75 min時(shí)，茶湯透光率有所下降，再延長(zhǎng)到90 min時(shí)又升高，可能是時(shí)間長(zhǎng)產(chǎn)生靜置沉淀作用，故選取60 min為木瓜蛋白酶最適反應(yīng)時(shí)間。α-淀粉酶也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，故選取20 min為其最適反應(yīng)時(shí)間。

2.1.4 不同反應(yīng)pH值對(duì)茶湯透光率的影響

pH值不但會(huì)影響酶的反應(yīng)速度，還對(duì)茶湯透光率有影響，酶不同反應(yīng)pH值對(duì)茶湯透光率的影響如圖7、圖8所示。

圖7 木瓜蛋白酶不同反應(yīng)pH值的茶湯透光率Fig.7 The tea soup transmittance of different pH of papain

圖8 α-淀粉酶不同反應(yīng)pH值的茶湯透光率Fig.8 The tea soup transmittance of different pH of α-amylase

由圖7、圖8可知兩種酶共同特點(diǎn)為：反應(yīng)pH值在3～5范圍內(nèi)，茶湯透光率隨pH值升高而顯著增加，pH值為5時(shí)，兩者透光率達(dá)到最大值；以后隨著pH值增加，茶湯的透光率急劇下降。故兩種酶澄清茶湯的最適pH值均選擇5。

2.1.5 單酶澄清茶湯沉淀工藝條件的正交優(yōu)化

木瓜蛋白酶與α-淀粉酶正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表2和表3。

表2 木瓜蛋白酶與α-淀粉酶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment of papain and αamylase

續(xù)表2 木瓜蛋白酶與α-淀粉酶正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 The results of orthogonal experiment of papain and α-amylase

表3 木瓜蛋白酶與α-淀粉酶正交試驗(yàn)的方差分析Table 3 The variance analysis of the orthogonal experiment of papain and α-amylase

木瓜蛋白酶澄清茶湯時(shí)，據(jù)表2極差分析結(jié)果，各因素對(duì)茶湯透光率影響的大小順序?yàn)镈＞B＞A＞C，即pH值影響最大，溫度次之，酶添加量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最小。優(yōu)組合為A1B1C3D3，但據(jù)表3方差分析結(jié)果可知D因素（pH值）對(duì)茶湯透光率影響顯著，其它因素則不顯著。從節(jié)約時(shí)間和能源角度出發(fā)，工藝條件經(jīng)正交優(yōu)化后，以A1B1C1D3組合為優(yōu)，即酶添加量0.3 U/mL，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間45 min，pH 6。

α-淀粉酶澄清茶湯時(shí)，從表2可知各因素對(duì)茶湯透光率影響的大小順序?yàn)镈＞A＞B＞C，說(shuō)明pH值是影響茶湯透光率的主要因素。優(yōu)組合為A3B3C3D2，從表3方差分析結(jié)果可知D因素（pH值）對(duì)茶湯透光率影響顯著，其它因素也不顯著。從節(jié)約能源和時(shí)間角度出發(fā)，優(yōu)化后的最佳工藝條件組合為A1B1C1D2，即酶添加量30 U/mL，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時(shí)間15 min，pH 5。

對(duì)兩種酶的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明：木瓜蛋白酶澄清茶湯的透光率達(dá)到63.3%，而α-淀粉酶的也達(dá)到62.0%，具有良好的澄清效果。

2.2 木瓜蛋白酶與α-淀粉酶協(xié)同作用澄清茶湯結(jié)果

木瓜蛋白酶與α-淀粉酶協(xié)同澄清茶湯結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 木瓜蛋白酶與α-淀粉酶協(xié)同澄清茶湯結(jié)果Table 4 The results of synergy clarification of tea soup by papain and α-amylase

兩種酶的最佳反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH值不一樣，故不能同時(shí)添加，只能先后添加，否則會(huì)影響酶制劑的作用效果。由表4可知，在各自最優(yōu)條件下，與無(wú)加酶組對(duì)比，單獨(dú)添加時(shí)，無(wú)論是木瓜蛋白酶還是α-淀粉酶，都能顯著提高茶湯透光率，起到澄清作用，且兩種酶效果相當(dāng)。但兩種酶協(xié)同作用時(shí)，對(duì)茶湯的澄清效果并不明顯，反而比各自單獨(dú)添加時(shí)的透光率要降低，這一現(xiàn)象說(shuō)明：紅茶茶湯中沉淀物質(zhì)的量是一定的，過(guò)多添加外源酶對(duì)沉淀物的去除未必有益，反而因酶殘留造成澄清度下降。

3 結(jié)論與討論

本研究以紅茶加工中產(chǎn)生的碎茶為原料，對(duì)其茶湯通過(guò)添加外源木瓜蛋白酶和α-淀粉酶進(jìn)行澄清處理，結(jié)果表明添加這兩種酶制劑均能提高茶湯透光率，起到澄清茶湯作用，得到木瓜蛋白酶最佳添加量為0.3 U/mL、反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間45 min，pH 6；α-淀粉酶最佳添加量為30 U/mL，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時(shí)間15 min，pH 5，為紅茶廢物利用和茶飲料加工提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

木瓜蛋白酶可促進(jìn)茶湯蛋白質(zhì)分解，減少蛋白質(zhì)-茶多酚復(fù)合物形成[4]，故在紅茶飲料加工中可使茶湯澄清。α-淀粉酶能將茶湯中淀粉物質(zhì)切斷成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精和少量的低分子糖類，從而使淀粉糊的黏度迅速下降，起到降低稠度和“液化”的作用，從而提高茶湯澄清度。將這兩種酶應(yīng)用于紅茶茶湯澄清，不會(huì)把有益成分去除，只是轉(zhuǎn)變了物質(zhì)的存在形式而已，故具有一定的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。

木瓜蛋白酶和α-淀粉酶的協(xié)同作用沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)期效果，可能因添加的酶量過(guò)多，影響了茶湯透光率，可通過(guò)調(diào)整兩者的添加量及比例，探討協(xié)同效應(yīng)，從而使研究結(jié)果更有參考價(jià)值。此外還應(yīng)通過(guò)感官評(píng)價(jià)兩種酶的添加導(dǎo)致蛋白質(zhì)和淀粉的減少，是否會(huì)影響茶湯的色澤、口感等。

單寧酶是目前用于茶湯澄清的主要酶制劑，但價(jià)格高、成本大，木瓜蛋白酶和α-淀粉酶的價(jià)格相對(duì)較低，而且具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，因此不失為茶飲料加工中澄清劑的一種好選擇。此外我們還可以研究這3種酶的共同作用，制作高效且性能穩(wěn)定的復(fù)合酶制劑。

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Research on the Clarification of Black Tea Soup with Papain and α-Amylase

ZHONG Yan-mei，ZENG Xian-lu，ZHENG Qing-mei，HE Man-yi
（School of Life Sciences，Jiaying University，Meizhou 514015，Guangdong，China）

The clarification effect of exogenous papain and α-amylase on black tea soup were investigated.Results indicated that both two enzymes were able to significantly increase the transmittance rate，and the two enzymes demonstrated no significant difference for clarification of tea.The optimal reaction conditions for papain were：addition amount of enzyme to be 0.3 U/mL，treatment temperature to be at 50℃，treatment time 45 min at pH 6；and the optimal conditions for α-amylase were：enzyme amount to be 30 U/mL，treatment temperature to be at 45℃，treatment time to be 15 min at pH 5.

papain；α-amylase；black tea；clarification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.018

2016-09-23

廣東省教育廳自然科學(xué)基金（Yq2013152）

鐘艷梅（1975—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品資源研究開(kāi)發(fā)。