王玉欣，趙天淼，包 芳，韓艷華，孔麗麗，孫 梅

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肺腺癌EZH2蛋白的表達(dá)及其與表皮生長(zhǎng)因子受體突變的關(guān)系

王玉欣1，趙天淼2，包 芳3，韓艷華4，孔麗麗5，孫 梅5

目的 分析肺腺癌中EZH2蛋白的表達(dá)，尋找更有效的肺腺癌治療方法和為降低表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制藥(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)耐藥性提供理論依據(jù)。方法 免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)肺組織中EZH2蛋白表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)肺腺癌EGFR基因突變狀況。比較EZH2蛋白在腺癌、正常肺組織和肺良性病變組織中的表達(dá)差異，分析EZH2的表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性。結(jié)果 EZH2在腺癌組織中的表達(dá)率(84.00%)明顯高于正常肺組織(12.00%)和肺良性病變組織(11.11%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腺癌中EZH2的表達(dá)程度與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)；與腫瘤的大小，組織學(xué)亞型及T分期有關(guān)(P<0.05)；與EGFR基因突變無(wú)關(guān)。結(jié)論 EZH2可能參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)與EGFR基因突變無(wú)關(guān)，有可能成為肺腺癌治療的新靶點(diǎn)。

肺腺癌；EZH2；EGFR突變

肺癌已成為威脅人類(lèi)健康的一種嚴(yán)重疾病，隨著環(huán)境污染的加重，肺癌的發(fā)病率還會(huì)繼續(xù)增加。80%以上的肺癌是非小細(xì)胞肺癌[1]，其中腺癌占大多數(shù)。由于診療技術(shù)的不斷提高，特別是靶向藥物的應(yīng)用，如表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制藥(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)，肺癌患者的生存率已明顯提高[2]，但是這類(lèi)藥物僅適用于EGFR突變敏感的患者，而且很快出現(xiàn)耐藥性，所以開(kāi)發(fā)新的靶向藥物和克服EGFR-TKIs耐藥性成為目前肺癌研究的熱點(diǎn)。果蠅Zest基因增強(qiáng)子人類(lèi)同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可使組蛋白H3第27位賴(lài)氨酸殘基發(fā)生甲基化[3]，引起下游上百種基因表達(dá)的沉默[4]。它在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，有可能成為腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)。但EZH2在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其與EGFR基因突變關(guān)系的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)肺組織中EZH2蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)肺腺癌EGFR基因突變狀況，并分析肺腺癌中EZH2蛋白表達(dá)的意義及其與EGFR基因突變的關(guān)系，為研發(fā)新的靶向藥物和降低EGFR-TKIs耐藥性提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 收集武警吉林總隊(duì)醫(yī)院和吉林大學(xué)二院2013-10至2015-10根治性手術(shù)切除肺腺癌標(biāo)本50例。男21例，女29例。年齡35～79歲，平均59.36歲。腫瘤直徑0.5～7 cm，平均2.81 cm。其中貼壁樣生長(zhǎng)為主型4例，腺泡樣為主型29例，實(shí)體性為主型11例，乳頭狀為主型2例，黏液腺癌4例。T1期16例，T2期33例，T3期1例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例，無(wú)轉(zhuǎn)移者36例。正常肺組織為距癌腫3 cm以上的非癌組織。另取18例肺良性病變組織作為對(duì)照，其中支氣管擴(kuò)張3例，肺結(jié)核4例，肺大皰5例，炎性病變6例。所有病例均經(jīng)兩位病理醫(yī)師復(fù)診確認(rèn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 采用PV-9002兩步法，試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。蠟塊常規(guī)切片脫蠟，枸櫞酸鹽溶液電磁爐加熱修復(fù)，H2O2阻斷，滴加EZH2抗體(CST公司，1∶150)，4 ℃過(guò)夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染顯微鏡下觀察。PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照，用胎盤(pán)絨毛組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 染色結(jié)果判斷 染色結(jié)果以染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比綜合計(jì)分作定性分析。染色強(qiáng)度分為：無(wú)色0分，淺黃色1分，黃色2分，棕褐色3分。每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(400×)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。陰性為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。上述兩項(xiàng)分值相乘所得積進(jìn)行評(píng)分，0～1分為陰性，2分以上為陽(yáng)性。EZH2位于細(xì)胞核，呈棕黃色。

1.2.3 EGFR基因突變檢測(cè) 采用羅氏CobasEGFR等位基因突變特異性擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。試劑盒均購(gòu)于羅氏生物技術(shù)有限公司，蠟塊切卷片5～7片放入EP管中，脫蠟烘干，按照CobasDNA樣品制備試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，按照CobasEGFR基因突變檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系，應(yīng)用Cobasz480實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀進(jìn)行EGFR等位基因特異性擴(kuò)增與檢測(cè)，將自動(dòng)檢測(cè)出EGFR基因突變狀況和突變類(lèi)型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件，定性資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，EZH2表達(dá)和EGFR突變的關(guān)系用Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EZH2在人正常肺組織、肺良性病變和肺腺癌中的表達(dá) EZH2在腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肺組織和肺良性病變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在正常肺組織和肺良性病變組織中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1，表1)。

圖1 EZH2蛋白在肺組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，200×)

A.正常肺組織；B.肺大皰；C.肺炎性病變；D.貼壁樣生長(zhǎng)為主型；E.腺泡樣生長(zhǎng)為主型；F.實(shí)體性生長(zhǎng)為主型；G.乳頭狀生長(zhǎng)為主型；H.黏液腺癌

表1 EZH2蛋白在人正常肺組織、肺良性病變和肺腺癌中的表達(dá)

2.2 EZH2蛋白在肺腺癌不同亞型中的表達(dá) EZH2蛋白表達(dá)在肺腺癌不同亞型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)，在貼壁型明顯低于腺泡型和實(shí)性型(P=0.014；P=0.009)，而腺泡型和實(shí)性型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他亞型之間比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1，表2)。

表2 EZH2蛋白在肺腺癌不同亞型中的表達(dá)

2.3 EZH2蛋白表達(dá)與腺癌部分臨床指標(biāo)的關(guān)系 EZH2蛋白在肺腺癌中的表達(dá)與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)，與腫瘤的大小及T分期有關(guān)，腫物越大，分期越高，EZH2陽(yáng)性率越高(P<0.05)。但與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，盡管在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率(92.86%)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率(80.56%，表3)。

2.4 EZH2蛋白的表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性分析 50例腺癌組織中26例發(fā)生EGFR基因突變，突變率為52.00%，其中EZH2陽(yáng)性組中21例突變，突變率為50.00%，EZH2陰性組中5例突變，突變率為62.50%，EGFR基因突變率在EZH2陰性組略高于EZH2陽(yáng)性組，但是二者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EZH2的表達(dá)與EGFR基因突變無(wú)相關(guān)性。

2.5 EZH2蛋白的表達(dá)與EGFR基因突變類(lèi)型的分析 EGFR基因突變中外顯子19突變率最高，其次是外顯子21的突變，二者占所有突變的84.61%。EZH2的表達(dá)與EGFR基因突變類(lèi)型無(wú)相關(guān)性(表4)。

表3 EZH2蛋白表達(dá)與腺癌部分臨床指標(biāo)的關(guān)系

表4 EZH2蛋白的表達(dá)與EGFR基因突變類(lèi)型的分析

3 討 論

EGFR-TKIs通過(guò)抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，進(jìn)而阻斷EGFR介導(dǎo)的下游信號(hào)傳導(dǎo)，最終抑制腫瘤的增殖，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[5]。該類(lèi)藥物特異性高，不良反應(yīng)小，能顯著延長(zhǎng)患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期[2]。然而這些藥物僅適用于EGFR突變敏感的患者，而且常會(huì)在服藥9個(gè)月后不可避免地出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，使肺癌患者的治療陷入了新的困境，所以尋找新的靶向藥物，降低患者EGFR-TKIs的耐藥性已成為研究的熱點(diǎn)。

果蠅Zest基因增強(qiáng)子人類(lèi)同源物2(Enhancer of Zeste homolog 2，EZH2)屬于PcG(Polycomb Group)家族，是一種組蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，可催化組蛋白H3第27位賴(lài)氨酸殘基發(fā)生甲基化[3]，引起下游上百種基因表達(dá)的沉默[4],在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)，且與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)，因此EZH2被認(rèn)為是一種癌基因。目前已有文獻(xiàn)[6,7]報(bào)道EZH2在肺癌中高表達(dá)，而在正常肺組織及肺良性病變組織中低表達(dá)或無(wú)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EZH2在肺腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肺組織和肺良性病變組織，而在正常肺組織和肺良性病變組織間無(wú)明顯差異。提示EZH2可能參與了肺腺癌的發(fā)生，可能是肺腺癌的驅(qū)動(dòng)基因。Hu等[8]發(fā)現(xiàn)，腫瘤越大，EZH2的表達(dá)率越高。Wan等[9]發(fā)現(xiàn)，EZH2的表達(dá)在小細(xì)胞癌明顯高于鱗癌和腺癌，且EZH2的表達(dá)與肺癌的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，分期越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者EZH2表達(dá)率越高。說(shuō)明EZH2參與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中EZH2的表達(dá)與腫瘤的大小及T分期有關(guān)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，雖然EZH2蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與研究對(duì)象個(gè)體差異及樣本量較少有關(guān)。另外，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)肺腺癌不同亞型間EZH2蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白表達(dá)在貼壁型明顯低于腺泡型和實(shí)性型，而腺泡型和實(shí)性型相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其他亞型之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明EZH2蛋白的表達(dá)在肺腺癌不同亞型之間存在一定差異。上述結(jié)果提示EZH2高表達(dá)與肺腺癌的惡性演變及侵襲生長(zhǎng)有關(guān)。

有研究報(bào)道，EZH2表達(dá)在鉑類(lèi)化療藥的敏感組中明顯低于耐藥組[10]，在EGFR突變組明顯低于未突變組[11]，當(dāng)抑制EZH2的表達(dá)后，癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力下降[12,13]，凋亡增強(qiáng)[14,15]，對(duì)順鉑的敏感性增強(qiáng)[10]，同時(shí)EGFR突變患者對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TOPII)抑制藥的敏感性增強(qiáng)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EZH2表達(dá)與EGFR基因突變狀況無(wú)關(guān)，與EGFR基因突變類(lèi)型亦無(wú)關(guān)。雖然EZH2表達(dá)在EGFR突變組低于未突變組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本量少有關(guān)。

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(2017-02-20收稿 2017-03-22修回)

(責(zé)任編輯 尤偉杰)

Relationships between EZH2 expression and EGFR mutation in lung adenocarcinoma

WANG Yuxin1, ZHAO Tianmiao2，BAO Fang3，HAN Yanhua4，KONG Lili5，and SUN Mei5.
1.Department of Pathology, 2.Department of Facilities，3. Department of Military Healthcare，Jilin Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Changchun 130052,China;4. Training Base of Jilin Provincial Corps, Chinese People’s Armed Police Force, Changchun 130032,China;5.Department of Pathology, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130042,China

Objective To explore the expression of EZH2 in lung adenocarcinoma and its associations with EGFR mutation.Methods Immunohistochemistry was used to examine the expression of EZH2 while EGFR mutation was detected with real-time fluorescence PCR.Results The expression of EZH2 in lung adenocarcinom(84.00%) was significantly higher than in normal lung tissues(12.00%) and in benign lung disease(11.11%) (P<0.05). EZH2 expression was related to tumor size, histological subtypes of adenocarcinoma and T stage(P<0.05), but not to EGFR mutation.Conclusion EZH2 may be involved in lung oncogenesis and development. The expression of EZH2 is not linked to EGFR mutation. It can be a new target for the treatment of lung adenocarcinoma.

lung adenocarcinoma；EZH2；EGFR mutation

吉林省直衛(wèi)生專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：3D5153523429)

王玉欣，本科學(xué)歷，主治醫(yī)師。

130052 長(zhǎng)春，武警吉林總隊(duì)醫(yī)院：1.病理科，2.器械科,3.軍療科； 4.130032 長(zhǎng)春，武警吉林總隊(duì)后勤訓(xùn)練保障基地衛(wèi)生隊(duì)；5.130042 長(zhǎng)春,吉林大學(xué)二院病理科

孫 梅，E-mail:sun.mei55@yahoo.com

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