汪成成

（遼寧省林業(yè)科學研究院，遼寧 沈陽 110032）

利用SRAP標記分析日本落葉松2代優(yōu)樹的遺傳多樣性

汪成成

（遼寧省林業(yè)科學研究院，遼寧 沈陽 110032）

為研究日本落葉松2代優(yōu)樹間的遺傳多樣性，該文利用SRAP分子標記的方法對選擇的80個樣本進行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：篩選出的8對引物共擴增出235條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶223條，多態(tài)性百分率為94.89%，每對引物可擴增出20～37條多態(tài)性條帶，平均每對引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)為29.4條。利用UPGMA法進行聚類，當相似系數(shù)為0.824時將80個日本落葉松種質(zhì)材料劃分為4個類群。聚類基本與子一代的親緣關系符合，類群間遺傳基礎較狹窄，親緣關系較近，為日后建立日本落葉松2代種子園的工作提供了理論依據(jù)。

日本落葉松；2代優(yōu)樹；遺傳多樣性；SRAP

日本落葉松Larix kaempferi系松科落葉松屬喬木，因其適應性強、生長快、材質(zhì)好、用途廣，生長量遠遠地超過了鄉(xiāng)土樹種長白落葉松和華北落葉松，已成為我國北方地區(qū)引種最成功的造林樹種之一。日本落葉松的苗木主要是靠種子園或母樹林產(chǎn)種獲得，日本落葉松優(yōu)樹選擇和初級種子園營建工作早在1963年就開始了，但是初級種子園是按表型選擇的優(yōu)株建成的。由于選優(yōu)林地生態(tài)環(huán)境條件較復雜，造成表型選擇誤選率較高，不經(jīng)子代測定就全部納入種子園的構建，不可避免地影響了種子園的總體遺傳水平。以往主要是依靠子代測驗來評估種子園遺傳增益，由于組成種子園優(yōu)樹的不同，這種評價往往不能真實地體現(xiàn)種子園的總體遺傳水平，對于種質(zhì)資源保護和遺傳改良都非常不利[1-2]。本研究欲通過SRAP分子標記技術對日本落葉松2代優(yōu)樹的遺傳多樣性進行評價，力求在日本落葉松2代種子園的建成中，既獲得較高的遺傳增益，又具有較高的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 樣 品

供試的80個日本落葉松樣品均采自遼寧省撫順市清原縣大孤家國營林場日本落葉松2代優(yōu)樹，采集后用錫紙包裹，然后在錫紙上編號，投入液氮罐后及時帶回實驗室，保存于－80℃超低溫冰箱中備用。80個供試材料的基本情況見表1。

表1 日本落葉松的供試材料

1.2 DNA提取與檢測

采用CTAB法提取DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度與純度，取部分基因組DNA稀釋到50 ng·μL-1，保存于－20℃的冰箱內(nèi)備用。

1.3 SRAP擴增與檢測

SRAP分子標記的引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成生產(chǎn)，本試驗所用的引物序列見表2。SRAP-PCR反應總體積為25 μL，其中模板DNA 2 μL，引物0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL。

PCR反應程序為94℃預變性5 m in；94℃變性1 m in，35℃退火1 m in，72℃延伸1 m in，一共循環(huán)5次；然后4℃變性1 m in，35℃退火，72℃延伸1 min，一共循環(huán)35次；最后72℃延伸10 m in，4℃保存。PCR產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠于150 V的恒壓下電泳，電泳后通過固定、銀染、顯影后拍照分析。

表2 SRAP引物代號及序列

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計引物對供試材料所擴增的清晰可辨的總帶數(shù)，按DNA條帶的有或無賦值，有記為“1”，無記為“0”，構建二維數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)SRAP擴增的結(jié)果，利用NTSYS-pc version 2.1軟件對統(tǒng)計的“0/1”數(shù)據(jù)矩陣進行分析，得到Dice相似性系數(shù)，并利用UPGMA法進行聚類分析，構建樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP標記的遺傳多態(tài)性分析

經(jīng)過初篩和復篩，從64對引物組合中篩選出8對擴增條帶清晰且數(shù)目較多、多態(tài)性高、重復性較好的引物組合進行PCR擴增，擴增的片段大部分集中在70～220 bp，其中ME6-EM 8組合的擴增圖譜見圖1-3。

圖1 引物組合M 6E8對21-40號日本落葉松DNA的擴增結(jié)果

圖2 引物組合M 6E8對41-70號日本落葉松DNA的擴增結(jié)果

圖3 引物組合M 6E8對71-100號日本落葉松DNA的擴增結(jié)果

8對SRAP引物擴增統(tǒng)計結(jié)果見表3。8對SRAP引物共擴增出235條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶223條，多態(tài)性百分率94.89%，每對引物可擴增出20～37條多態(tài)性條帶，平均每對引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)29.4。這些統(tǒng)計結(jié)果表明，供試的日本落葉松材料之間存在著豐富的遺傳多樣性。

表3 SRAP引物組合擴增帶數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)

2.2 基于SRAP標記的遺傳相似系數(shù)分析

利用NTSYS-pc version2.1軟件對擴增結(jié)果進行相似系數(shù)計算，得到SRAP標記擴增結(jié)果的相似性系數(shù)矩陣。SRAP擴增結(jié)果的遺傳相似性在0.791 1～0.917 2，其中編號為31和80的遺傳相似系數(shù)最低為0.791 1（圖4），表明二者親緣關系最遠；編號為78和79的遺傳相似系數(shù)最高為0.917 2（圖5），表明二者親緣關系最近。從整個相似性系數(shù)來看，變幅為0.126 1，表明所選材料之間的差異不是很明顯。相似性系數(shù)越大，遺傳距離越小，說明兩者之間的親緣關系越親近；反之亦然。從結(jié)果看所選材料差異較明顯，具有較豐富的遺傳多樣性，這也是日本落葉松種質(zhì)資源多樣性的分子基礎。

圖4 SRAP標記中包含編號31和80的部分供試材料之間的相似性系數(shù)

圖5 SRAP標記中包含編號78和79的部分供試材料之間的相似性系數(shù)

2.3 基于SRAP標記的聚類分析

基于日本落葉松SRAP遺傳相似性系數(shù)，利用UPGMA法進行聚類，獲得聚類樹狀圖（圖6）。當相似系數(shù)為0.824時，可將80個日本落葉松種質(zhì)材料劃分為4個類群。類群Ⅰ包括46個樣本材料，該類群在相似系數(shù)為0.844時又可以劃分為4個亞類群，其中亞類群Ⅰ-1包括19個樣本材料；亞類群Ⅰ-2只有編號為25這1個樣本材料；亞類群Ⅰ-3包括24個樣本材料；亞類群Ⅰ-4只有編號為63和66這2個樣本材料。類群Ⅱ包括30個樣本材料，類群Ⅲ和類群Ⅳ分別只有2個樣本材料。從劃分的類群可以看出，所選的80份日本落葉松樣本間的遺傳基礎較狹窄，親緣關系比較近。

3 結(jié)論與討論

SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相關序列擴增多態(tài)性）[3]是由美國加州大學作物系LI和QUIROS博士[4]在2001年提出來的，這項標記技術是一種無需任何序列信息即可直接PCR擴增的新型分子標記技術[5]。因其具有操作簡便、多態(tài)性強、中等產(chǎn)量、易于分離條帶及測序等優(yōu)點，目前被廣泛應用于遺傳多樣性分析[6-10]、性狀的標記[11]、基因定位及QTL分析、基因克隆、遺傳圖譜構建[12]等領域。顧曉燕[13]等利用SRAP分子標記技術對來自亞洲的84份老芒麥種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳關系進行了分析，結(jié)果顯示23個引物組合共產(chǎn)生337條擴增條帶，其中多態(tài)性條帶為203條，多態(tài)性比率為60.24%，在GS=0.84時，將供試種質(zhì)劃分成2個明顯不同的組群。陳大霞[14]等利用SRAP分子標記的方法對12個不同來源地的大黃進行遺傳關系的分析，24對引物組合共擴增出272條條帶，其中有199條為多態(tài)性條帶，占73.2%，遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.578 4～0.941 6。李杰勤[15]等利用SRAP分子標記技術對20個黑麥草品系的遺傳多樣性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)53個引物組合共擴增出705條條帶，其中多態(tài)性條帶共597條，多態(tài)性比率為78.95%，以閾值為0.63時可將這20個品系分為4類。目前許多學者的研究證明SRAP是一項能夠揭示種質(zhì)間遺傳多樣性的有效的分子標記技術。

圖6 80個日本落葉松SRAP聚類圖

利用SRAP分子標記技術分析日本落葉松2代優(yōu)樹遺傳多樣性，結(jié)果表明篩選出的8對引物共擴增出235條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶223條，多態(tài)性百分率為94.89%，每對引物可擴增出20～37條多態(tài)性條帶，平均每對引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)為29.4條。利用UPGMA法進行聚類，當相似系數(shù)為0.824時將80個日本落葉松種質(zhì)材料劃分為4個類群。聚類基本符合與子一代的親緣關系，類群間遺傳基礎較狹窄，親緣關系較近，為日后建立日本落葉松2代種子園的工作提供了理論依據(jù)。

［1］樸楚炳，張萬雄，劉君.興安落葉松天然優(yōu)良林分改造為母樹林的研究初報［J］.林業(yè)科技，1991，16（3）：17-23.

［2］張源潤，周全良，梅曙光，等.華北落葉松無性系種子園子代測定研究［J］.寧夏農(nóng)學院學報，2004，25（4）:8-11.

［3］RUIZ JJ,GARCIA-MARTINEZ S,PICO B,et al.Genetic variability and relationship of closely related Spanish traditional cultivars of tomato as detected by SRAP and SSR markers［J］.J Am Soc Horticult Sci,2005,130（1）：88-94.

［4］LI G,QUIROS C F.Sequence-related amplified polymerphism(SRAP),A new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theor Appl Genet,2001,103:455-461.

［5］NEVENA N,JOHN W,ROBERT L.Detection of DNA polymorphism in sugar beet bulks by SRAP and RAPD markers［J］.Journal of Biotechnology,2007,131:32-35.

［6］姜樹坤，馬慧，劉君，等.利用SRAP標記分析玉米遺傳多樣性［J］.分子植物育種，2007，5（3）：412-416.

［7］文雁成，王漢中，沈金雄，等.用SRAP標記分析中國甘藍型油菜品種的遺傳多樣性和遺傳基礎［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39（2）：246-256.

［8］RIAZ A,Li G,QURESH Z,et al.Genetic diversity of oilseedBrassica napusinbred lines based on sequencerelated amplified polymorphism and its relation to hybrid performance［J］.Plant Breeding,2001,120:411-415.

［9］FERRIO M,PICO B,NUEZ F.Genetic diversity of a germplasm collection ofCucurbita pepousing SRAP and AFLP markers［J］.Theoretical and App lied Genetics, 2003,107:271-282.

［10］BUDAK H,SHEARMAN R C,PARMAKSIZ I,et al. Molecular characterization of buffalo grass germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers［J］.Theoretical and App lied Genetics,2004,108:328-334.

［11］海燕，何寧，康明輝，等.新型分子標記SRAP及其應用［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，2006，（9）：9-11.

［12］LI X G,LIU N,HUANG B H,et al.Phylogenetic analysis and genetic mapping of Chinese Hedychium using SRAP markers［J］.Scientia Horticulturae,2008, 117:369-377.

［13］顧曉燕，郭志慧，張新全，等.老芒麥種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析［J］.草業(yè)學報，2014，23（1）：205-216.

［14］陳大霞，李隆云，鐘國躍，等.用SRAP標記分析正品大黃的遺傳關系［J］.中國中藥雜志，2008，33（20）：2309-2312.

［15］李杰勤，王麗華，詹秋文，等.20個黑麥草品系的SRAP遺傳多樣性分析［J］.草業(yè)學報，2013，22（2）：158-164.

（責任編輯：張素清）

Analysis of genetic diversity of second-generation tree of Larix kaempferi by SRAP

WANG Chengcheng
（Liaoning Academy of Forestry Science，Shenyang 10032，China）

In this study，we used SRAP molecular marker technology to analyze genetic diversity among 80 populations of second-generation tree of Larix kaempferi.The result showed that 8 SRAP primers amplified 235 DNA bands，223 polymorphism bands among these，the polymorphic percentage was 94.89%.Each pair of primers can amplify the article 20 to 37 polymorphism bands,the average number of polymorphic bands was 29.4.Using UPGMA method for clustering,when the similarity coefficient of 0.824,80 materials of Larix kaempferi were divided into four groups.Clustering in line w ith and son generation of genetic relationship,between groups they had a narrow genetic basis and a close genetic relationship,it provided a theoretical basis to set up the second generation seed orchard of Larix kaempferi in the future work.

Larix kaempferi；Second-generation tree；genetic diversity；SRAP

S791.223

A

1001-1714（2017）02-0019-07

2016-11-25

國家“十二五”科技支撐項目（2012BAD01B01）。

汪成成（1985-），女，工程師，現(xiàn)從事森林培育研究。E-mail：yuanlinwcc@163.com。