孫曉慧，王 燕，牟艷玲

(1.濟南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東 濟南 250062;3.國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點實驗室，山東 濟南 250062;4.山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250062)

2型糖尿病大鼠心肌PI3K/Akt/mTOR信號通路的改變及Sirt1的調(diào)控機制研究

孫曉慧1,2,3,4，王 燕2,3,4，牟艷玲2,3,4

(1.濟南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東 濟南 250062;3.國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點實驗室，山東 濟南 250062;4.山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250062)

目的 檢測Sirt1及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白在糖尿病大鼠心肌及高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中的表達變化，明確其在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素建立2 型糖尿病大鼠模型，實驗將大鼠分為糖尿病2周、4周、8周模型組和對照組，超聲心動圖檢測大鼠心功能變化，Western blot檢測大鼠心肌Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1蛋白表達變化。將H9C2細(xì)胞分為正常對照組、DMSO組(78.12 mmol·L-1)、高糖(HG)組(33 mmol·L-1)、白藜蘆醇(Res)組(20 μmol·L-1)、尼克酰胺(Nam)組(40 mmol·L-1)，Western blot及qRT-PCR研究心肌細(xì)胞Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)錄及表達，研究Sirt1對該信號通路的調(diào)控機制。結(jié)果 在動物實驗中，與2周DM大鼠比較，8周DM大鼠心肌Sirt1蛋白表達明顯增加。2周模型組大鼠相對于正常對照組心肌PI3K、Akt、mTOR、S6K1表達明顯增加，且S6K1表達4 周模型組比2周模型組增加更明顯，但8周表達降低。在高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中，與對照組相比，高糖組Sirt1, PI3K, Akt, mTOR和S6K1表達明顯增高。Nam處理組Sirt1表達明顯降低，PI3K, Akt, mTOR和S6K1表達增高。Res處理組Sirt1表達明顯增高，而PI3K, Akt, mTOR和S6K1表達降低。結(jié)論 Sirt1通過負(fù)調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路參與糖尿病心肌損傷，參與早期糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。

2型糖尿??；PI3K/Akt/mTOR信號通路；Sirt1；心功能；心肌損傷；白藜蘆醇；尼克酰胺

近年來，糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率急劇上升，已成為影響人類身體健康的主要疾病之一。糖尿病若未能得到及時診斷和正規(guī)治療，可引起多種慢性并發(fā)癥。其中，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是DM心血管并發(fā)癥中一種獨立、特異的心肌病，與糖尿病患者發(fā)生心力衰竭和死亡率升高密切相關(guān)，是DM患者死亡的主要原因[1]。 研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生命活動，包括細(xì)胞的生長、增殖和分化，其過度激活參與糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、認(rèn)知功能障礙和胰島素抵抗等[2]。此外，Sirt1作為體內(nèi)關(guān)鍵的生物信號調(diào)節(jié)因子，廣泛參與多種信號通路的激活與抑制調(diào)控，已被廣泛研究。有研究表明[3]，Sirtl失活條件下，PI3K/Akt/mTOR通路激活，進而誘發(fā)動脈粥樣硬化發(fā)生。而在2型DCM中，Sirt1對該信號通路的調(diào)控作用尚未明確。本文通過檢測Sirtl及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白在DM大鼠心肌及高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中的表達變化，并將白藜蘆醇和尼克酰胺——Sirt1的特異性激動劑及抑制劑作用于高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中，探討Sirtl對該信號通路的調(diào)控作用，為糖尿病心肌病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型建立 體質(zhì)量200～220 g的♂健康SD大鼠40只，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用高脂飲食(豬油30%，膽固醇2.5%，脫氧膽酸鈉1%,常規(guī)飼料66.5%)隨機對30只大鼠灌胃，設(shè)為糖尿病模型組(DM組)，另設(shè)正常對照組(Control組)10只，并于5周末禁食12 h后，DM組大鼠一次性腹腔注射1%鏈脲菌素(30 mg·kg-1，pH=4.5檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液)，Control組大鼠注射同體積檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。72 h后尾靜脈采血，血糖試紙檢測空腹血糖值(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。DM組造模成功大鼠隨機分為2周模型組、4周模型組和8周模型組，繼續(xù)高脂飲食灌胃，Control組繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)8周。

1.2 細(xì)胞及模型建立 大鼠心肌細(xì)胞株H9C2，由美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所提供。將對數(shù)生長期細(xì)胞分為正常對照組、DMSO組(78.12 mmol·L-1)、高糖(HG)組(33 mmol·L-1)、白藜蘆醇(Res)組(20 μmol·L-1)、尼克酰胺(Nam)組(40 mmol·L-1)，作用24 h。

1.3 材料與試劑 鏈脲菌素、戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；血糖試紙(強生中國醫(yī)療器材有限公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TRIzol(上海東洋紡生物科技有限公司)；RIPA裂解液、Western轉(zhuǎn)膜液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和SDS-PAGE電泳液均購自碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜(0.45 μm，美國SERVA公司)；所用單克隆抗體為：Sirt1(美國Novus公司)，PI3K、Akt、mTOR(美國Cell Signaling Technology公司)，S6K1(美國Abcam公司)。

1.4 大鼠空腹血糖檢測 DM組大鼠分別于2、4和8周末禁食12 h，頸靜脈竇取血，離心分離血清，檢測FBG及胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，計算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitive index，ISI)，公式為 ISI=ln[1/(FINS×FBG)]。

1.5 大鼠超聲心動圖 大鼠分別于造模2、4、8周末，禁食12 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，并固定于手術(shù)臺上，使用小動物超聲成像系統(tǒng)Vevo 2100(維勝中國)檢測左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)、左室舒張末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in diastole，LVPWd)、左室收縮末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in systole，LVPWs)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)及左心室質(zhì)量(left ventricular mass，LV Mass)。

1.6 大鼠心肌標(biāo)本收集 大鼠麻醉后迅速取出心臟，用預(yù)冷生理鹽水洗凈并用濾紙吸干，剔除血管、脂肪等非心肌組織，分別稱取心臟重量(heart weight，HW)和左心室(含室間隔)重量(LV Mass)，并計算心臟(左心)指數(shù)=心臟(左心室)重量(mg)/體重(g)，置于-80℃中保存待用。

1.7 Western blot實驗 提取蛋白，BCA法測定各組總蛋白濃度，于SDS-PAGE凝膠電泳進行分離。冰浴下濕法轉(zhuǎn)膜2h后，用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜。次日與辣根過氧化物標(biāo)記的二抗共孵育，用增強型化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析。

1.8 qRT-PCR 將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1，離心5 min收集細(xì)胞。按TRIzol提取程序(說明書)提取細(xì)胞總RNA，按AWV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄后，4℃保存。各目的基因的擴增引物序列如Tab 1所示，擴增條件：94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性30 s，55℃變性30 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，快速冷卻至4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀察。用BandScan5.0軟件測定條帶灰度值，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

Tab 1 PCR primer used in experiment

2 結(jié)果

2.1 大鼠DM模型建立情況 實驗期間，Control組大鼠一般狀態(tài)良好、健壯、皮毛有光澤，對外界反應(yīng)靈敏，無死亡。與Control組比較，DM組大鼠精神萎靡，皮毛無光澤，出現(xiàn)多飲、多食、多尿，腥臊酮臭味加重等。STZ造模后72 h，檢測高糖模型成功28只。DM組大鼠與對照組大鼠比較，血清FBG、FINS明顯升高(P<0.05)，ISI明顯下降(P<0.01)，表明2型糖尿病大鼠造模成功。見Tab 2。

GroupnFBG/mmol·L-1FINS/mU·L-1ISIControl105.973±0.13722.147±0.586-5.084±0.998DMMod-el2831.341±0.368*28.817±0.743*-7.132±0.577**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2 糖尿病大鼠超聲心動圖變化 與對照組比較，2周 DM大鼠的LVIDd及LVIDs值明顯增大(P<0.05)，LVPWd及LVPWs明顯增厚(P<0.05)，F(xiàn)S及LV Mass值明顯降低(P<0.01)，LVEF及LVMass/Body Weight值無明顯變化；隨著糖尿病的發(fā)展，4周、8周 LVIDd、LVIDs、LVPWd及LVPWs值增加更明顯(P<0.01)，F(xiàn)S、LVEF及LV Mass值降低更明顯(P<0.01)，LV Mass/Body Weight值增加更明顯(P<0.01)，且與2周 DM組比較，都具有明顯差異(P<0.05)。見Fig 1和Tab 3。

Tab 3 Changes of structural and functional parameters in left ventricle of DM ±s)

LVIDd, Left ventricle(LV) internal diameter in diastole;LVIDs,LV internal diameter in systole;LVEF,LV ejection fraction;FS,fractional shortening,and LV Mass(AW) were automatically calculated by the ultrasound machine.*P<0.05,**P<0.01vsND group;△P<0.05,△△P<0.01vs2 week DM

Fig 1 Representative images of M-modechocardiogram

A:Control group;B:2 wk DM;C:4 wk DM; D:8 wk DM

2.3 糖尿病大鼠心肌SIRT1/PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的變化 WB結(jié)果表明，2周、4周 DM大鼠心肌中Sirt1蛋白的表達相對于Control組無明顯變化，但與2周 DM大鼠比較，8周 DM大鼠心肌表達明顯增加(P<0.01)。與Control組大鼠比較，2周 DM大鼠PI3K、Akt、mTOR及S6K1表達明顯增加(P<0.01)，2周之后，PI3K、Akt、mTOR表達無明顯變化，但S6K1在4周增加最明顯(P<0.01)，8周表達降低。見Fig 2。

2.4 高糖條件下大鼠心肌細(xì)胞SIRT1/PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的變化 WB結(jié)果表明，與對照組相比，高糖組Sirt1, PI3K, Akt, mTOR 和S6K1表達明顯增高。與高糖組相比，Nam處理組Sirt1表達明顯降低，PI3K、Akt、mTOR和S6K1表達增高。Res處理組PI3K、Akt、mTOR和S6K1表達降低，結(jié)果見Fig 3。

Fig 2 Expression of PI3K,Akt,mTOR,S6K1,Sirt1 in cardiac tissue from each group via ±s,n=28)

A:Respresentative Western blot analysis of the time-dependent changes of protein levels; B:Bar graph shows quantification of protein levels(fold of net intensity of bands with β-actin).**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vs2 wk DM

2.5 qRT-PCR檢測高糖條件下大鼠心肌細(xì)胞SIRT1/PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)基因的變化 qRT-PCR結(jié)果與上述WB結(jié)果相一致，高糖培養(yǎng)H9C2細(xì)胞中Sirt1及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)基因(PI3K、 Akt、mTOR、S6K1)表達明顯增高。Nam處理組Sirt1表達明顯降低， PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)基因表達增高。Res處理組Sirt1表達明顯增高，而PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)基因表達降低，見Fig 4。

Fig 3 Expression of Sirt1,PI3K,Akt,m-TOR

A:Respresentative Western blot analysis of the changes of protein levels; B:Bar graph shows quantification of protein levels(fold of net intensity of bands with β-actin).**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsHG group

Fig 4 The mRNA expression of Sirt1,PI3K, Akt, mTOR and S6K1 in total RNA extracts from H9C2 cells using ±s)

Bar graph shows quantification of mRNA expression(2-ΔCt).**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsHG

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號通路是目前研究的熱點[4]。PI3K作為該信號通路的起始因子，可被多種生長因子激活，各種生長因子作用于膜受體而使PI3K激活，然后質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號蛋白Akt和PDK1結(jié)合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Thr308位點，促使Akt活化?；罨腁kt可以磷酸化激活其下有多種靶蛋白如mTOR，進而誘導(dǎo)細(xì)胞生長，促進細(xì)胞存活，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent informationregulator1，Sirt1)為哺乳動物Sirtuins家族成員之一，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙?；福c酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent informationregulator 2, Sir2)高度同源。人們將在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的Sir2的同源基因按照其發(fā)現(xiàn)的先后順序依次稱為Sirt1-7，并統(tǒng)稱為Sirtuins家族。其中，Sirt1在DNA修復(fù)、體內(nèi)能量平衡、氧化還原平衡、抗衰老及胰島素分泌等方面具有重要的調(diào)控功能[5-6]。白藜蘆醇是葡萄中含有的一種多羥基酚類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、保護心血管、保護肝細(xì)胞、抗肥胖的功效，特異性激活Sirt1[7]，提高Sirt1蛋白表達量并升高其活性[8]。尼克酰胺是Sirt1特異性抑制劑，能防止STZ處理的胰島細(xì)胞中NAD+減少，抑制胰島素前體合成，延遲STZ誘導(dǎo)的糖尿病的發(fā)生[9]。Sirt1可以通過調(diào)節(jié)FOXOs、Wnt等相關(guān)信號通路，對多種心血管疾病的病理生理過程產(chǎn)生重要影響，發(fā)揮保護心肌、舒張血管、抑制動脈粥樣硬化等作用[10-12]。研究表明[13]，Sirt1可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Takeda等[3]認(rèn)為，在單核-吞噬細(xì)胞中，Sirtl失活條件下，PI3K/Akt/mTOR通路激活，進而誘發(fā)動脈粥樣硬化發(fā)生。但是，Sirt1在2型糖尿病心血管系統(tǒng)對PI3K/Akt/mTOR信號通路的調(diào)節(jié)還不清楚。

本研究表明，DM大鼠Sirt1及PI3K、Akt、mTOR表達較對照組明顯增加，其下游S6K1表達2周模型組大鼠相對于正常對照組表達明顯增加，且4周模型組比2 周模型組增加更明顯，8周表達降低，說明8周之內(nèi)Sirt1被激活，而PI3K/Akt/mTOR信號通路有表達降低的趨勢，因此我們推斷，在2型DCM中，Sirt1可抑制該信號通路的表達。為了研究二者之間的調(diào)控機制，我們采用體外研究的方法，構(gòu)建細(xì)胞高糖模型。在高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中，WB及qRT-PCR結(jié)果表明，與對照組相比，高糖組Sirt1、PI3K、Akt、mTOR和S6K1表達明顯增高，表明高糖條件下H9C2細(xì)胞Sirt1及PI3K/Akt/mTOR信號通路激活，與DM大鼠心肌中相應(yīng)蛋白表達結(jié)果相一致。Nam處理組Sirt1表達明顯降低，導(dǎo)致PI3K、Akt、mTOR和S6K1表達增高。Res處理組Sirt1表達明顯增高，而PI3K, Akt, mTOR和S6K1表達降低。表明在高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中，Sirt1低表達時，PI3K/Akt/mTOR信號通路激活；Sirt1高表達時，PI3K/Akt/mTOR信號通路被抑制。因此，我們得出結(jié)論，Sirt1作為PI3K/Akt/mTOR信號通路的上游調(diào)節(jié)因子，通過負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路，參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Sirt1/PI3K/Akt/mTOR信號通路在糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展過程中被激活，參與早期糖尿病心肌損傷。糖尿病心肌病是糖尿病性心臟病的特異性病變，是糖尿病心血管嚴(yán)重并發(fā)癥的重要組成部分，明確其發(fā)生發(fā)展過程中心肌相關(guān)指標(biāo)的變化，進而做到早期診斷成為研究熱點。我們將深人了解其在糖尿病心肌病中的作用并闡明其機制，以期為糖尿病心肌病的早期治療提供理論依據(jù)。

(致謝：本實驗全部由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理學(xué)實驗室牟艷玲老師課題組獨立完成，感謝山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程的資助。)

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Alteration of PI3K/Akt/mTOR signaling during development of diabetic cardiomyopathy and regulation of SIRT1

SUN Xiao-hui1,2,3,4, Wang Yan2,3,4, MU Yan-ling2,3,4

(1.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250200,China;2.InstituteofMateriaMedica,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China;3.KeyLaboratoryforBiotech-Drugs,MinistryofHealth,Jinan250062,China;4.KeyLaboratoryforRare&UncommonDiseasesofShandongProvince,Jinan250062,China)

Aim To investigate the alteration of Sirt1 and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in type 2 diabetic rats′cardiomyopathy and clarify its role in development of diabetic myocardium.Methods The type 2 diabetes rat model was established by injection of streptozocin after five-week of high fat diet.The rats were randomly divided into model group of 2 weeks, model group of 4 weeks, model group of 8 weeks and control group.The changes of heart function were detected by echocardiography. The alteration of Sirt1, PI3K, Akt, mTOR and S6K1 in myocardium was determined by Western blot.The myocardial cells were randomly divided into following groups:① Control group(normal glucose concentration, 5.5 mmol·L-1);② DMSO group(78.12 mmol·L-1);③ High glucose group(HG,33 mmol·L-1);④ HG+Res(20 μmol·L-1) group;⑤ HG+Nam(40 mmol·L-1) group. The alteration of Sirt1, PI3K, Akt, mTOR and S6K1 in H9C2 cells was determined by Western blot and qRT-PCR.Results WB results showed that Sirt1 was markedly increased in 8 weeks DM rats,compared with 2 weeks DM rats. However,the expressions of PI3K, Akt and mTOR in 2 weeks were significantly increased, without significant change in 4 and 8 weeks. The increased expression of mTOR induced accumulation of S6K1, which was also remarkably increased in 4 weeks after STZ injection, and then it was decreased as DCM developed. WB and qRT-PCR results showed that the expressions of Sirt1, PI3K, Akt, mTOR and S6K1 in HG group were significantly increased compared with control group. Nam treatment significantly lowered Sirt1 expression, resulting in a higher expression of PI3K, Akt, mTOR and S6K1. However,H9C2 cells treated with Res showed a higher expression of Sirt1, resulting in a lower expression of PI3K, Akt, mTOR and S6K1.Conclusion Sirt1 could negatively regulate mTOR signaling in DCM and these changes may be valuable to find a new therapeutic target for diabetic cardiomyopathy.

type 2 diabetes;mTOR signaling pathway;Sirt1;heart function; myocardial injury; resveratol; nicotinamide

時間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.022.html

2016-12-15，

2017-02-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 30701022)；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金計劃(No BS2013SW008)

孫曉慧(1992-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：1214576499@qq.com； 牟艷玲(1975-)，女，博士，副研究員，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：myling501@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.011

A

1001-1978(2017)06-0793-06

R-332；R322.11；R341；R394.2；R587.2