王丹陽 趙淑述 康亞玲 羅小龍 譚亞超 張愛蓮 張富春

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源與基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

新疆栽培一枝蒿粗多糖對OVA抗體水平及T淋巴細胞亞群的影響

王丹陽 趙淑述 康亞玲 羅小龍 譚亞超 張愛蓮 張富春

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源與基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

初步探討新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖（Un-deproteinization of cultivated Artemisia rupestris L. crude polysaccharides，UCARCP）對模式抗原卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA）免疫小鼠后抗體水平以及T淋巴細胞亞群的影響。將UCARCP配伍OVA皮下免疫小鼠，初免1次，加強1次，鋁佐劑為陽性對照組，間接ELISA法檢測小鼠血清中IgG及亞類IgG1、IgG2a的抗體水平；流式細胞術檢測脾細胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞亞群的含量。結果顯示，UCARCP能顯著提高小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a的抗體水平（P＜0.05），且與鋁佐劑組相比無顯著性差異（P＞0.05）；UCARCP能顯著促進CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞亞群的含量（P＜0.05），與鋁佐劑組相比沒有顯著差異（P＞0.05）。新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖能顯著促進模式抗原OVA免疫后小鼠的體液免疫水平和細胞免疫水平，與鋁佐劑相當。

栽培一枝蒿；OVA；抗體；T淋巴細胞

病毒性疾病嚴重損害人類及動物的健康，疫苗接種仍是控制病毒性疾病最常用的有效方法［1］。為了提高疫苗的接種效果，大多數(shù)疫苗需要與佐劑配伍以增加其效力和刺激相應的免疫反應［2］，所以研制良好的疫苗佐劑來提高疫苗的免疫效力已被視為疫苗成功的一個重要策略［3］。

新疆地處亞洲腹地，具有獨特的氣候群，這里天然藥物資源豐富。大量的證據(jù)表明，中草藥作為疫苗佐劑具有很多優(yōu)勢，如自然資源豐富、療效好、毒副作用低等［4，5］。近年來，研究者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)中草藥中的多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理活性，也可以作為新型疫苗佐劑調節(jié)機體的免疫功能［6-8］。隨著中藥研究領域的擴大及中藥制劑新技術的應用，新疆一枝蒿（Artemisia rupestris L.）作為一種療效確切的藥材，已被廣泛應用于臨床［9-11］。由于對一枝蒿用藥量的不斷增大，野生資源難以滿足市場需要，栽培一枝蒿在新疆已經(jīng)成功種植［12］。而且，前期研究發(fā)現(xiàn)新疆栽培一枝蒿粗多糖可以通過顯著增強骨髓來源的樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）表面分子CD40、CD86及CD80、細胞因子IL-12和TNF-α的表達來促進DC的成熟［13］，又研究了新疆栽培一枝蒿除蛋白的粗多糖對OVA蛋白的免疫作用，發(fā)現(xiàn)它能夠作為 OVA蛋白的佐劑來增強小鼠體液和細胞免疫應答［14］。

為了有效開發(fā)和利用新疆栽培一枝蒿，本研究在前期研究的基礎上，選用新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖為候選佐劑，配伍模式抗原OVA皮下免疫小鼠，初步探究新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖對OVA的抗體水平和T淋巴細胞亞群的影響，為從新疆栽培一枝蒿中篩選新型疫苗佐劑提供實驗參考。Sigma公司；辣根過氧化物酶標記的Goat Anti-Mouse IgG、IgG1、IgG2a購自美國Southbiotech公司；N-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購自上海藍季科技發(fā)展有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；PE Rat-Anti Mouse CD3、APC Rat-Mouse CD4、FITC Rat-Anti Mouse CD8a等均購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫 用UCARCP配伍OVA，以ICR雌性小鼠為實驗動物模型，采用皮下注射的方式免疫小鼠，UCARCP以多糖含量表示，鋁佐劑為陽性對照組，每只小鼠的注射體積為100 μL，共免疫2次，初免后2 周加強1次。免疫分組情況見表1。免疫后每周對小鼠進行眼眶采血，并分離制備血清。

表1 實驗分組及免疫（n=7）

1 材料與方法

1.1 材料

6-8周的ICR雌性小鼠（購自新疆醫(yī)科大學試驗動物中心），新疆栽培一枝蒿未除蛋白粗多糖UCARCP（實驗室制備，多糖含量15.23 %），新疆栽培一枝蒿除蛋白粗多糖（Cultivated Artemisia rupestris L. crude polysaccharides，CARCP，實驗室制備，多糖含量23.80 %）；雞卵清白蛋白OVA購于

1.2.2 ELISA檢測抗體水平 通過間接ELISA法檢測小鼠血清中OVA特異性抗體的水平。首先用100 μL 10 μg/mL的OVA溶液作為抗原包被96孔ELISA板，4℃過夜；200 μL PBST洗兩次，再用5 %脫脂奶粉37℃封閉1 h；PBST洗兩次后加入稀釋的待測血清100 μL作為一抗，37℃孵育1 h；PBST洗后再加入100 μL HRP標記的抗鼠IgG、IgG1、IgG2a二抗，孵育1h；經(jīng)PBST洗3次后，用四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液避光顯色10 min，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀于450 nm/655 nm雙波長下檢測光吸收值。

1.2.3 流式細胞術檢測脾臟中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞的含量 小鼠初免21 d后，取出脾臟經(jīng)裂解紅細胞后制成細胞濃度為1×107cells/mL的單細胞懸液。取100 μL脾細胞懸液加入8 mL PBS/0.5 %FBS，經(jīng)1 200 r/min離心7 min后，棄上清得到細胞沉淀，細胞計數(shù)后，每份1×106cells/100 μL用PE-CD3、APC-CD4、FITC-CD8a進行三染法，常溫避光染色30 min，8 mL PBS/0.5% FBS終止染色后，1 200 r/min離心7 min，棄上清用400 μL PBS重懸后經(jīng)200目的銅網(wǎng)過濾至流式上樣管中，經(jīng)流式細胞儀檢測后用Flowjo 7.6.1分析CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞亞群的百分比。

2 結果

2.1 UCARCP免疫后對小鼠抗體IgG水平的影響

為探究UCARCP配伍OVA免疫后對小鼠體液免疫反應的影響，本實驗以多糖含量為標準，選用低（24 μg）、中（71 μg）、高（214 μg）3個劑量篩選合適的UCARCP劑量，通過間接ELISA法檢測初免后14 d的IgG抗體水平，結果如圖1，UCARCP中劑量配伍OVA免疫能極顯著提高IgG的表達水平（P＜0.01），與鋁佐劑相當，而低劑量和高劑量不能顯著提高IgG的表達水平（P＞0.05）。

圖1 間接ELISA法檢測小鼠初免疫14 d血清中抗體IgG水平

以上實驗結果確定了UCARCP的最佳免疫劑量為中劑量，因此，用間接ELISA法檢測了中劑量組免疫后不同時期小鼠血清中OVA特異性IgG水平的差異。結果如圖2所示，初免后7 d、14 d、21 d的抗體水平逐漸升高；UCARCP單獨免疫組沒有激發(fā)抗體水平，但中劑量的OVA/UCARCP組免疫激發(fā)的抗體水平均顯著高于OVA組（P＜0.05），且作用效果與OVA/Alum相當（P＞0.05）。

圖2 間接ELISA法檢測初免后不同時間點抗體IgG

2.2 UCARCP免疫后對小鼠血清中IgG1和IgG2a抗體分型的影響

間接ELISA法測定初免后21 d小鼠血清中抗體IgG及亞型的結果如圖3所示，OVA誘導抗體IgG1的表達水平最高，IgG次之，IgG2a最低；UCARCP單獨免疫并不能誘導OVA特異性抗體水平，但中劑量的OVA/UCARCP組抗體IgG及IgG1水平顯著高于OVA組（P＜0.05），且極顯著促進IgG2a的表達（P＜0.01），作用效果均與OVA/Alum無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 間接ELISA法檢測初免后21 d小鼠血清中抗體IgG及亞型

2.3 UCARCP免疫后對小鼠脾臟CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的影響

為了觀察小鼠免疫后T細胞的免疫水平，于小鼠初免后21 d，通過流式細胞術檢測脾臟淋巴細胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的含量，結果如圖4A-D所示，中劑量的UCARCP配伍OVA后，CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞在脾臟淋巴細胞中的百分率與對照組OVA相比有所升高，均顯著高于OVA單獨免疫組（P＜0.05）；OVA/UCARCP組和OVA/Alum組的相比沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖4 流式細胞術檢測CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞

2.4 UCARCP與CARCP免疫后對小鼠血清中抗體及抗體分型的影響

為了比較新疆栽培一枝蒿未除蛋白和除蛋白的粗多糖佐劑效果的差異，以多糖含量為標準，分別用其配伍OVA皮下免疫小鼠后，通過間接ELISA法檢測21 d抗體及分型水平。結果如圖5，UCARCP和CARCP組均能顯著提高抗體IgG及分型IgG1和IgG2a水平（P＜0.05），而且兩者相比無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

研究表明，植物提取成分的活性與其劑量有很大的相關性［15］。基于此，本研究首先對UCARCP的免疫劑量進行初步篩選，結果發(fā)現(xiàn)UCARCP中劑量配伍OVA能夠有效激發(fā)小鼠的抗體水平，因此后續(xù)實驗采用中劑量進行相關實驗指標的檢測。本實驗選用鋁佐劑為陽性對照，以多糖含量為標準配伍OVA進行免疫實驗，間接ELISA法測定初免后7 d、14 d、21 d小鼠抗體IgG水平，UCARCP能顯著促進OVA免疫誘導的抗體水平，且初免后21d小鼠的IgG1和IgG2a的抗體水平也顯著升高，且與鋁佐劑組的水平相當，說明新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖對OVA抗原誘導的特異性體液免疫有顯著的增強效果，且能平衡地促進Th1/Th2混合型免疫反應。

圖5 間接ELISA法檢測初免后21 d小鼠血清中抗體IgG及亞型

4 結論

新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖配伍OVA免疫小鼠后能夠顯著性提高小鼠抗體IgG、抗體分型IgG1和IgG2a的水平，能顯著提高OVA免疫誘導CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的表達，且與鋁佐劑組的水平相當。此外，未除蛋白的新疆栽培一枝蒿粗多糖誘導小鼠抗體IgG及分型的水平與除蛋白的新疆栽培一枝蒿粗多糖無顯著差異。

CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群主要由細胞免疫介導的，CD3+CD4+T細胞是Th2型細胞，能夠分泌抗體或細胞因子，作用于B淋巴細胞或抗原遞呈細胞，促進B細胞成熟或增強抗原遞呈細胞遞呈抗原的能力。CD3+CD8+T細胞是Th1型細胞，能夠直接殺傷靶細胞［16，17］。因此研究CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的含量是檢測細胞免疫反應的重要指標。近幾年的研究表明，中草藥提取物能夠增強黃羽肉雞生產(chǎn)性能和T淋巴細胞亞群［18］，不同制備工藝板藍根多糖對小鼠脾淋巴細胞具有增殖的作用［19］，野生仙人掌多糖對小鼠特異性免疫功能具有調節(jié)作用［20］，貴州南五味子多糖能促進雞細胞免疫和體液免疫，使CD4+/CD8+淋巴細胞比值明顯升高［21］。本實驗通過流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群的含量，結果發(fā)現(xiàn)UCARCP能顯著提高OVA免疫誘導CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的含量，且與鋁佐劑組的水平相當，說明UCARCP能增強Th1型和Th2型免疫反應。

為了提高栽培一枝蒿的利用率，降低候選佐劑的生產(chǎn)成本，本實驗以多糖含量為標準，比較了新疆栽培一枝蒿未除蛋白和除蛋白粗多糖對小鼠抗體水平的影響，結果發(fā)現(xiàn)小鼠初免后21 d 未除蛋白的粗多糖誘導IgG及分型的抗體水平與除蛋白的粗多糖無顯著差異。這些研究結果初步表明，未除蛋白的粗多糖與除蛋白的粗多糖差異不大，深入的比較實驗還需進一步進行。綜上所述，新疆一枝蒿未除蛋白的粗多糖能增強OVA免疫后小鼠誘導的體液免疫反應和細胞免疫反應，具有良好的免疫佐劑活性，為有效的利用栽培一枝蒿篩選疫苗佐劑提供了依據(jù)。

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（責任編輯 李楠）

Effects of Un-deproteinized Crude Polysaccharides from Cultivated Artemisia rupestris in Xinjiang on Antibody Level and T Lymphocyte Subsets

WANG Dan-yang ZHAO Shu-shu KANG Ya-ling LUO Xiao-long TAN Ya-chao ZHANG Ai-lian ZHANG Fu-chun
（College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This work aims to investigate the effect of un-deproteinized crude polysaccharides（UCARCP）from cultivated Artemisia rupestris L. on antibody level and T lymphocyte subsets in mice immunized ovalbumin（OVA）antigen. Mice were immunized subcutaneously with OVA formulated with UCARCP，priming one time，boosting one time，and aluminum adjuvant for the positive control group. Indirect ELISA assay was performed to evaluate IgG antibody levels，and CD3+CD4+and CD3+CD8+T lymphocyte subsets in splenocytes were determined by flow cytometry. As results，UCARCP significantly increased the antibody levels of IgG，IgG1and IgG2ain mice serum（P ＜0.05）；and in contrast to aluminum adjuvant group，there was no significant difference（P ＞ 0.05）. Moreover，UCARCP obviously enhanced the percentages of CD3+CD4+and CD3+CD8+T cells（P ＜ 0.05），and there was also no significant difference compared with that in aluminum adjuvant group（P ＞0.05）. In conclusion，UCARCP can significantly enhance the humoral and cellular immunity in mice immunized with OVA，and it has the same effects with aluminum adjuvant.

cultivated Artemisia rupestris L.；OVA；antibody；T lymphocyte

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0964

2016-10-21

國家自然科學基金項目（31360224）

王丹陽，女，碩士，研究方向：新型免疫佐劑；E-mail：592197463@qq.com

張愛蓮，女，副教授，研究方向：新型免疫佐劑；E-mail：xjzal@163.com