張多多鄭菲羅會穎李中媛羅學剛

（1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081；3北京林業(yè)大學生物科學與生物技術學院，北京 100083）

嗜熱子囊菌JCM12803的α-半乳糖苷酶基因tcgal27A在畢赤酵母中的表達

張多多1鄭菲2，3羅會穎2李中媛1羅學剛1

（1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081；3北京林業(yè)大學生物科學與生物技術學院，北京 100083）

從嗜熱子囊菌（Thermoascus crustaceus）JCM12803克隆α-半乳糖苷酶基因，并對其酶學性質進行系統(tǒng)的研究，旨為獲得工業(yè)應用性質優(yōu)良的α-半乳糖苷酶。通過RT-PCR方法從T. crustaceus JCM12803中克隆α-半乳糖苷酶基因序列，并對其酶學性質進行了系統(tǒng)的分析。結果顯示，tcgal27A屬于糖苷水解酶27家族，基因全長1 918 bp，含有4個內含子，cDNA全長1 419 bp，編碼472個氨基酸，預測tcgal27A N端含有24個氨基酸為其可能的信號肽。將TCGal27A在畢赤酵母中成功地進行了表達，所獲得的重組TCGal27A具有高比活（336.5 U/mg）及寬泛的底物特異性，對蜜二糖（14.4 U/mg）、棉子糖（9.1 U/mg）、角豆膠（3.6 U/ mg）、魔芋粉（1.6 U/mg）、瓜爾豆膠（1.3 U/mg）、水蘇糖（0.7 U/mg）都有著不同程度的降解作用。以pNPG為底物時的Km值為1.6 mol/mL，Vmax為536.8 μmoL/（min·mg）。TCGal27A的最適作用pH為4.5，最適溫度為65℃，50℃處理1 h之后酶活力還能保持86.0%。這些結果表明耐高溫TCGal27A性質優(yōu)良，可添加到飼料中，在消化和提高豆粕蛋白能量利用率方面有良好的潛在應用價值。

嗜熱真菌；α-半乳糖苷酶；熱穩(wěn)定性；異源表達

α-半乳糖苷酶又稱蜜二糖酶，可特異性水解底物中的α-1，6-半乳糖苷鍵，釋放出末端的半乳糖殘基。底物包括分支多糖（如半乳甘露聚糖）、半乳糖寡糖（如棉子糖、蜜二糖和水蘇糖）和半乳糖脂［1］。按照氨基酸序列一級結構的相似性和疏水基團可以把糖苷水解酶分成133個家族，其中α-半乳糖苷酶被劃分到4、27、32、36、57、97和110這7個不同的糖苷水解酶家族中［2］，其中對27家族和36家族α-半乳糖苷酶的研究比較深入，大多數(shù)真菌來源的α-半乳糖苷酶都屬于27家族。

α-半乳糖苷酶可以廣泛的應用在飼料、食品、化學、造紙和醫(yī)療等行業(yè)［3-5］，它們可以增加通用血型，提高糖結晶產量［6］，改善紙漿漂白［7］，增強動物飼料的營養(yǎng)價值［8］，從豆?jié){中除去棉子糖［9］，治療法布里疾病［10］可提高瓜爾豆膠的流變性［8，11］。目前α-半乳糖苷酶工業(yè)化產品主要是通過動植物提取和篩選微生物菌株發(fā)酵獲得，然而這些傳統(tǒng)的方法存在著酶活低、熱穩(wěn)定性差、生產效率不高等弊端，大大影響了α-半乳糖苷酶在工業(yè)生產及其他領域的應用［12］。隨著基因組測序技術的迅速發(fā)展，許多來源于微生物的α-半乳糖苷酶序列得以明確［13，14］，因此利用現(xiàn)代基因工程手段來提高酶的產量和簡化提取條件成為研究的熱點。到目前為止，已經有多個不同來源的α-半乳糖苷酶基因被克隆并在大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)進行了異源表達。本研究從嗜熱子囊菌（Thermoascus crustaceus）JCM12803中克隆得到一個新的α-半乳糖苷酶基因tcgal27A，構建了高效表達的畢赤酵母基因工程菌株，并對其酶學性質進行系統(tǒng)的研究，以期獲得工業(yè)應用的性質優(yōu)良的α-半乳糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 材料

Thermoascus crustaceus JCM12803購自日本微生物保藏中心；畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115和質粒pPIC9為本實驗室保存；大腸桿菌（Escherichia coli）Trans1-T1和質粒pEASY-T3購自Transgen公司。

產酶培養(yǎng)基：15 g/L 豆粕，15 g/L 麥麩，15 g/L 玉米芯以及5 g/L的NaCl，1 g/L KH2PO4，5 g/L（NH4）2SO4，0.5 g/L MgSO4.7H2O，0.01 g/L FeSO4.7H2O，以及0.2 g/L CaCl2挑取1環(huán)絲狀真菌接種于產酶培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2-3 d。

對硝基苯酚-α-D-半乳糖苷（4-nitrophenyl α-D-galactopyranoside，pNPG）、蜜二糖、棉子糖、水蘇糖購買自Sigma公司；質粒小提中量試劑盒購買自北京天根生化科技有限公司；SV Total RNA Isolation kit購買自Promega公司；DNA膠回收試劑盒購買自OMEGA公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super MIX和FastPfu DNA聚合酶購買自北京全式金生物技術有限公司；Taq酶和限制性內切酶購買自TaKaRa公司；T4DNA連接酶購買自New England Biolabs公司。

1.2 方法

1.2.1 半乳糖苷酶基因tcgal27A的克隆 提取T. crustaceus JCM12803的 總RNA， 反 轉 成cDNA，以cDNA為 模 板 設 計 引 物12803GH27-1-F和12803GH27-1-R進行PCR擴增，得到T. crustaceus JCM12803來源的半乳糖苷酶cDNA序列。用軟件預測信號肽序列，根據(jù)預測結果，設計去除信號肽序列并帶有酶切位點的引物TCGal27A-F/TCGal27A-R引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

表1 本文中所用引物

1.2.2 真核表達載體pPIC9/tcgal27A的構建 利用含有酶切位點的引物TCGal27A-F/TCGal27A-R，以pEASY-T3/tcgal27A質粒為模板，進行PCR擴增。擴增的條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2 min，擴增35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增后產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收后進行雙酶切（SnaBⅠ/NotⅠ），目的片段連接pPIC9轉化入TransI-T1中并進行陽性克隆的篩選。

1.2.3 重組酶TCGal27A在畢赤酵母中的表達與純化 將含有TCGal27A的pPIC9的質粒進行線性化（DraⅠ）并電轉入GS115感受態(tài)細胞中，進行陽性克隆子的篩選，陽性克隆子活性的檢測方法參照［15］。將酶活高的菌株進行搖瓶培養(yǎng)，從MD平板上挑取酶活較高的轉化子接種于400 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃、260 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 d后更換培養(yǎng)基為200 mL含有0.5%甲醇的BMMY 液體培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)2 d，為補償甲醇的損失，每隔12 h補加一次甲醇溶液，使甲醇濃度維持在0.5%左右，12 000 r/min離心10 min收集酶液，首先用10 kD的膜包除掉小分子的雜質初步濃縮粗酶液，其次，用7 kD透析袋進行脫鹽處理。將收集的鹽濃度低的酶液加入平衡好的HiTrap Q XL陰離子柱，用0.1 mol濃度的NaCl進行梯度洗脫，流速為2.0 mL/min，且分步收集洗脫下來的酶液。并對各個管中洗脫液的半乳糖苷酶活性進行測定。收集對應管中的酶液，并進行濃縮。將收集的酶液進行N-糖基化的脫糖基處理，重組酶經Endo H在37℃下處理2 h后進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.4 酶活力測定 依據(jù)底物的不同α-半乳糖苷酶的酶活力測定方法有如下3種，見表2。

一個酶活單位（U）定義：在最適反應條件下，每分鐘分解pNPG生成1 μmol的pNP所需要的酶量。

表2 α-半乳糖苷酶的酶活力測定方法

1.2.5 蛋白質含量的測定 在干凈的酶標條中加入20 μL適當稀釋的待測樣品，然后加入200 μL考馬斯亮藍G-250試劑，混勻37℃顯色10 min后，測定595 nm波長處吸光值（OD595）。根據(jù)測得的吸光值和標準曲線，計算出待測樣品的蛋白質含量（mg/mL）。

1.2.6 重組酶TCGal27A酶學性質的研究

1.2.6.1 α-半乳糖苷酶最適pH和最適溫度的測定 α-半乳糖苷酶的最適pH值是在以下pH條件下（2.0-10.0）進行測定的。所用緩沖液為：pH 2.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH 3.0-8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 8.0-9.0的Tris-HCl緩沖液，以及pH 9.0-10.0的Gly-NaOH緩沖液。并用對應pH的緩沖液將酶液稀釋適當?shù)谋稊?shù)，65℃下準確保溫5 min，以測定其酶活力。根據(jù)測定結果繪制最適pH曲線。α-半乳糖苷酶的最適溫度是用最適pH 4.5的0.2 mol/L的McIlvaine緩沖液及不同溫度（40-80℃）下進行準確保溫5 min測定其酶活力，根據(jù)測定結果繪制最適溫度曲線。

1.2.6.2 α-半乳糖苷酶pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性的測定 將酶液在不同pH的緩沖液（2.0-8.0）下于37℃下處理1 h，在重組酶TCGal27A的最適反應條件（65℃、pH 4.5）下測定其殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力作為對照（100%）計算，繪制重組酶TCGal27A的pH穩(wěn)定曲線。將稀釋一定倍數(shù)的α-半乳糖苷酶在50℃、60℃和70℃下分別保溫處理2、5、10、20、30、60 min后，測定其殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力作為對照（100%）計算，繪制重組酶TCGal27A的熱穩(wěn)定曲線。

1.2.6.3 金屬離子和相關化學試劑對酶活的影響 在α-半乳糖苷酶酶促反應體系中加入各種不同的金屬離子及化學試劑（Na+，K+，Ca2+，Ni2+，Cu2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，F(xiàn)e3+，Cr3+，β-巰基乙醇，EDTA和SDS），分別使這些離子和化學試劑的終濃度達至5 mmol/L。在該酶的最適反應條件（65℃、pH 4.5）下測定生成的總還原糖的量，計算酶活力，以未用以上試劑處理的酶液作為對照。

1.2.6.4 α-半乳糖苷酶比活力的測定 比活力單位的定義為：每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。通過pNPG法測TCGal27A酶液的酶活力單位，再通過考馬斯亮藍法測定蛋白含量，由此計算得到TCGal27A的比活力。

1.2.6.5 α-半乳糖苷酶酶促反應初速度Vmax和Km的測定 在最適條件下以不同濃度的pNPG（0.2、0.25、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL）為底物，加入純化后適當稀釋的重組酶進行反應，反應結束后加入1.5 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應，測定吸光度值OD405，以1/［s］為橫坐標，1/v為縱坐標繪制曲線，得出該酶在以pNPG為底物時的Km和Vmax值。

1.2.6.6 α-半乳糖苷酶底物特異性的測定 pNP糖苷類底物的酶活力測定方法參照 1.2.4；棉子糖和水蘇糖酶活力測定采用DNS法（Miller，1959），參照 1.2.4；蜜二糖底物酶活力測定采用GOD-POD 法，參照 1.2.4；LBG、魔芋粉和瓜爾豆膠酶活力測定：900 μL的0.5%底物，加入100 μL稀釋適當倍數(shù)的酶液進行反應，在最適條件下水浴10 min，最后加入1.5 mL DNS進行終止反應，煮沸5 min，冷卻，測定OD540下的吸光值。

2 結果

2.1 α-半乳糖苷酶基因tcgal27A的克隆

T. crustaceus JCM12803由上海銳翌生物科技有限公司進行全基因組測序。通過測序的結果設計引物，提取T. crustaceus JCM12803的總RNA進行RTPCR，通過特異性引物獲得該基因的cDNA，cDNA連接T3載體后測序。測序正確后進行質粒提取，用含有酶切位點的特異性引物進行PCR，進行雙酶切（SnaBⅠ/NotⅠ），目的片段連接pPIC9轉化入TransI-T1中并進行陽性克隆的篩選。

2.2 基因序列分析

來源于T. crustaceus JCM12803的α-半乳糖苷酶基因tcgal27A全長為1，918 bp，含有4個內含子。cDNA全長1，419 bp，編碼472個氨基酸和一個終止密碼子。用軟件SignalP預測的tcgal27A N端含有24個氨基酸為其可能的信號肽。Vector分析tcgal27A不含有SnaBⅠ，NotⅠ和DraⅠ等三個酶切位點，tcgal27A所編碼的成熟蛋白等電點為4.8，理論分子量為49.4 kD。BlastP分析結果顯示tcgal27A推導的氨基酸序列與Rasamsonia emersonii CBS 393.64來源的27家族半乳糖苷酶最相似，相似度為74%。

2.3 真核表達載體pPIC9/tcgal27A的構建

用分別含有SnaBⅠ和NotⅠ的引物擴增得到不含信號肽的α-半乳糖苷酶cDNA序列（tcgal27A），以正確的閱讀方式克隆到表達載體pPIC9上，獲得重組表達質粒（pPIC9/ tcgal27A）。

圖1 重組酶TCGal27A的SDS-PAGE分析

2.4 重組酶TCGal27A的表達純化與SDS-PAGE分析

重組表達載體pPIC9/tcgal27A經過小管誘導培養(yǎng)，篩選出高酶活的菌株，并在搖床水平上甲醇誘導48 h。通過酶活力測定和SDS-PAGE初步確定了TCGal27A在畢赤酵母中成功表達。將搖瓶表達的TCGal27A粗酶液用10 kD膜包濃縮，7 kD的透析袋透析脫鹽后，通過HiTrap Q XL陰離子凝膠層析進一步純化，收集洗脫峰并進一步濃縮，得到酶活力為24.9 U/ml比活力336.5 U/mg的α-半乳糖苷酶。純化后的TCGal27A經過SDS-PAGE鑒定為電泳純的單一條帶，分子質量大約為48.1 kD（第2泳道），第1泳道為endo-H處理后的，可以看出明顯的糖基化修飾。

2.5 重組酶TCGal27A酶學性質測定

2.5.1 pH和溫度對TCGal27A的影響 TCGal27A的最適作用 pH、pH 穩(wěn)定性、最適作用溫度及熱穩(wěn)定性實驗結果見圖2。

圖2 TCGal27A的酶學性質

由圖可知TCGal27A α-半乳糖苷酶的最適作用pH為4.5，在pH 3.5-5.0保持62.4%以上的相對酶活性，37℃下pH 3.0-7.0處理1 h后，TCGal27A能保持62.0%以上的酶活力；最適溫度為65℃，在55-65℃范圍內保持72.4%以上的相對酶活性，50℃處理1 h之后TCGal27A的酶活力還能保持86.0%。

2.5.2 不同金屬離子及部分化學試劑對TCGal27A的影響 金屬離子及不同化學試劑對α-半乳糖苷酶活性的影響結果見表4 。

Fe3+對酶有一定的抑制作用；其他金屬離子對酶活力沒有明顯的促進與抑制作用。SDS作為一種蛋白變性劑，對酶活力的有一定抑制作用，5 mmol的EDTA對酶活力的影響不大，相比于未處理的原酶液，酶活力有96.4%。

2.5.3 α-半乳糖苷酶TCGal27A動力學常數(shù)的測定 按照雙倒數(shù)作圖法繪制曲線，分別求得α-半乳糖苷酶對pNPG的Km及Vmax值。根據(jù)所繪制的曲線，計算得到TCGal27A對pNPG底物的Km及Vmax值分別為1.6 mol/mL、536.8 μmoL/（min·mg）。

2.5.4 α-半乳糖苷酶TCGal27A比活性的測定 取純化后的TCGal27A酶液通過pNPG法測得其酶活力為25.0 U/mL，考馬斯亮藍法測得蛋白含量為52.9 μg/mL，經計算得α-半乳糖苷酶TCGal27A的比活為336.5 U/mg。

2.5.5 α-半乳糖苷酶的底物特異性 該α-半乳糖苷酶可以降解蜜二糖、棉子糖和水蘇糖，也可降解多糖類的角豆膠、魔芋粉、瓜爾豆膠。比活力由高到低依次為，蜜二糖（14.4 U/mg）＞棉子糖（9.1 U/mg）＞角豆膠（3.6 U/mg）＞魔芋粉（1.6 U/mg）＞瓜爾豆膠（1.3 U/mg）＞水蘇糖（0.7 U/mg）

3 討論

目前，工業(yè)上用的α-半乳糖苷酶主要來源于絲狀真菌，如曲霉屬，木霉屬和青霉屬［16］，由于它們多為細胞外表達，且pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好，所以多用于工業(yè)生產［17］。由于野生菌的發(fā)酵表達水平低下，因此為了降低工業(yè)生產成本，目前已構建了許多不同異源宿主的重組菌株，例如，人類的α-半乳糖苷酶已在大腸桿菌和嗜冷假交替單胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）進行了異源表達［18］。盡管真核生物的α-半乳糖苷酶基因可以大腸桿菌中得到復制，但其蛋白質產物往往均是無活性的包涵體。雖然利用嗜冷表達系統(tǒng)中可以產活性蛋白，但是產率低下，而且低溫生產制造過程成本過高。釀酒酵母［19］和巴斯德畢赤酵母［20］等酵母表達系統(tǒng)則具有活性好、表達量高等優(yōu)點，從而有利于真核生物α-半乳糖苷酶的生產。例如，來自Bispora sp. MEY-1、Penicillium sp. F63、Rhizomucor miehei等的α-半乳糖苷酶基因都已在酵母中實現(xiàn)了有效的胞外表達，在甲醇誘導96 h后，利用pNPG法測的酶活分別為1.5 U/mL［21］，111 U/mL和240 U/mL［22］。

在本研究中，首次克隆鑒定了T. crustaceus JCM12803中的α-半乳糖苷酶TCGal27A，并利用畢赤酵母表達系統(tǒng)對其進行了重組表達，TCGal27A具有高比活（336.5 U/mg）。真菌和酵母來源的α-半乳糖苷酶與細菌來源的α-半乳糖苷酶在酶學性質方面相差較大，真菌來源α-半乳糖苷酶的最適pH一般在4.5-5.5，和大多數(shù)真菌來源的α-半乳糖苷酶一樣，TCGal27A的最適作用pH為4.5。不過，相對于其它真菌半乳糖苷酶而言，TCGal27A有著較高的作用溫度和最適反應溫度，最適溫度為65℃，在50℃處理1 h仍保持86.0%以上的酶活。雖然上述來自Bispora sp. MEY-1、Penicillium sp. F63、Rhizomucor miehei的半乳糖苷酶均實現(xiàn)了高效表達，但最適溫度分別為55℃、40℃、55℃，且在65℃僅剩較低的相對酶活。而TCGal27A能在65℃保持336.5 U/mg的比活，說明TCGal27A是一種新的酸性，耐熱的α-半乳糖苷酶。

豆類餅粕飼料中含有一些單胃動物不能進行消化的α-半乳糖苷的多聚糖和低聚糖的抗營養(yǎng)因子。其中低聚糖主要是游離的水蘇糖、棉子糖等，較高濃度的此類游離水溶性低聚糖會造成食糜度增高，不利于動物的消化和營養(yǎng)物質的吸收。但是如果在飼料中加入α-半乳糖苷酶、蛋白酶和果膠酶就能有效地提高豆粕蛋白能量利用率并且改善消化，酶在加工應用過程中要先經受原料混合、加工高溫制粒后才在動物胃腸道溶解發(fā)生作用，所以酶制劑的溫度和穩(wěn)定性倍受關注［23］。TCGal27A的最適溫度為65℃，在飼料的低溫65℃制粒過程中可以保持良好的酶活力，因此本研究中的耐高溫TCGal27A即可添加到飼料中實現(xiàn)此應用。

表4 不同金屬離子及部分化學試劑對TCGal27A活性的影響

4 結論

本研究成功從嗜熱真菌T. crustaceus JCM12803克隆到一個α-半乳糖苷酶基因，與R. emersonii CBS 393.64來源的α-半乳糖苷酶序列一致性很高，相似性74%，具有一定的新穎性。通過畢赤酵母系統(tǒng)對該酶進行了異源表達，該酶具有良好的酶學性質，TCGal27A具有高比活（336.5 U/mg）及寬泛的底物特異性。TCGal27A最適pH為4.5，在pH為3.5-5.0基本保持62.4%以上的相對酶活性，其最適溫度為65℃，在50℃處理1 h仍保持86.0%以上的酶活。本研究中的耐高溫TCGal27A可添加到飼料中，在消化和提高豆粕蛋白能量利用率方面有良好的潛在應用價值。

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（責任編輯 狄艷紅）

Expression of α-Galactosidases from Thermoascus crustaceus JCM12803 in Pichia pastoris

ZHANG Duo-duo1ZHENG Fei2，3LUO Hui-ying2LI Zhong-yuan1LUO Xue-gang1
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology of the Ministry of Education & Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture，F(xiàn)eed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；3. College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

This work is to clone the α-galactosidase gene from Thermoascus crustaceus JCM12803 and systematically study its enzymatic properties for obtaining high-quality α-galactosidase in industry. The gene sequence of α-galactosidase was cloned from T. crustaceus JCM12803 by RT-PCR and its enzymatic properties were systematically analyzed. As results revealed，the full-length of tcgal27A belonging to glycoside hydrolase 27 was 1 918 bp，contained 4 introns，the cDNA of tcgal27 was 1 419 bp，and encoded 472 amino acids. SignalP analysis indicated 24 residues in the N-terminal of tcgal27 might be signal peptides. Recombinant TCGal27A successfully expressed in Pichia pastoris had a high specific activity（336.5 U/mg），and the broad substrate specificity，i.e.，presenting different degrees of degradation to melibiose（14.4 U/ mg），raffinose（9.1 U/mg），gum tragon（3.6 U/mg），konjaku flour（1.6 U/mg），guar gum（1.3 U/mg），stachyose（0.7 U/mg）. Using pNPG as the substrate，the Km and Vmax of TCGal27A were determined to be 1.6 mol/mL and 536.8 μmoL/（min·mg），respectively. Like most fungal a-galactosidases，TCGal27A had an optimal acidic pH 4.5. Purified recombinant TCGal27A was thermophilic，exhibiting themaximum activity at 65℃，and the enzyme remained 86% of initial activity at 50℃ for 1 h. All above results imply that heat-tolerant protein TCGal27A with excellent enzymatic properties can be additive for feedstuff，and will be solid potential applicable value in digesting and improving the energy utilization ratio of soybean meal protein.

Thermoascus crustaceus JCM12803；α-galactosidase；thermophilic；heterologous expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1083

2017-01-13

國家杰出青年科學基金（31225026）

張多多，女，研究方向：微生物與生化藥學；E-mail：zhangduoduo160@163.com

羅學剛，男，研究方向：益生菌、功能食品及生物技術藥物的研究與開發(fā)；E-mail：luoxuegang@tust.edu.cn