劉 超 ， 侯 磊 ， 韋 莉 ， 王 菁 ， 全 榮 ， 朱珊珊 ，李子璇 ， 齊賓賓 ， 王利佳 ， 姜海軍 ， 王 丹 ， 劉 爵

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科技學(xué)院 ， 北京昌平102206 ； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京海淀100097)

禽腺病毒4型鞭毛重組蛋白的原核表達(dá)及其免疫效果研究

劉 超1，2， 侯 磊2， 韋 莉2， 王 菁2， 全 榮2， 朱珊珊2，李子璇2， 齊賓賓2， 王利佳1，2， 姜海軍2， 王 丹2， 劉 爵2

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科技學(xué)院 ， 北京昌平102206 ； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京海淀100097)

為研究禽腺病毒4型重組鞭毛-fiber2蛋白免疫保護性，將鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白基因與禽腺病毒4型的fiber2基因融合，再將融合基因和單獨的fiber2基因分別克隆到原核表達(dá)載體pET-28a，后將構(gòu)建的pET-28a-flagellin-fiber2和pET-28a-fiber2重組載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE和Western Blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，再將表達(dá)產(chǎn)物純化后免疫21日齡SPF雞；結(jié)果表明，重組菌在37 ℃培養(yǎng)條件下1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h可表達(dá)最多的可溶性重組蛋白，Western Blot分析表明，所表達(dá)的重組蛋白均能與禽腺病毒血清4型感染陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明所表達(dá)蛋白具有良好反應(yīng)原性，動物試驗表明，表達(dá)的兩種目的蛋白能為雞提供一定保護力，且低劑量的重組鞭毛-fiber2蛋白產(chǎn)生較好的免疫保護效果。

禽腺病毒4型 ； 鞭毛基因 ； fiber2基因 ； 原核表達(dá) ； 免疫保護

腺病毒(Adenovirus，AdV)是家禽和野禽常見的傳染性病原。近幾年，由Ⅰ亞群禽腺病毒感染引起雞的包涵體肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)、心包積水綜合征(Hydropericardium syndrome，HPS)等臨床病例逐漸增多并已遍及全世界。中國相繼診斷和報道了大量IBH或HPS病例，其中以禽腺病毒4型感染居多；感染雞可在沒有呈現(xiàn)臨床癥狀的情況下突然死亡，死亡率高達(dá)80%[1]，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。

禽腺病毒4型(Fowladenovirusserotype4，F(xiàn)AdV-4)屬于腺病毒科禽腺病毒屬成員，是無囊膜雙股DNA病毒，現(xiàn)已證實禽腺病毒有5個種(A-E)和12個血清型(1a-8a和8b-11b)[3-4]。FAdV-4衣殼由hexon、fiber和penton 3個主要結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中fiber和hexon是決定腺病毒衣殼蛋白抗原性的關(guān)鍵[5]，在哺乳動物對腺病毒的體液免疫應(yīng)答中，fiber和hexon蛋白產(chǎn)生較多的特異性中和抗體[6-8]。研究報道FAdV-4 fiber-2蛋白具有良好的免疫原性，對雞的包涵體肝炎-心包積水綜合征具有很好的免疫保護作用[9]。鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白(flagellin)可刺激機體產(chǎn)生炎性因子，在連接天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中起重要作用[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，flagellin蛋白與豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的融合重組蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生很好的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[11-12]。本研究擬將flagellin基因與FAdV-4 fiber2基因進(jìn)行融合并對其表達(dá)的重組蛋白純化，隨后將重組蛋白flagellin-fiber2免疫無特定病原體(SPF)雞，進(jìn)行免疫保護性研究，為開發(fā)基因工程疫苗提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、免疫血清及質(zhì)粒 禽腺病毒血清4型(FAdV-4)HN2015毒株及其免疫雞獲得的陽性血清，原核表達(dá)載體pET-28a，大腸桿菌TOP10、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所高新技術(shù)研究室保存。

1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶SacⅠ、Hind Ⅲ、NotⅠ、T4 DNA連接酶，購自NEB公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit、Ni-NTA Fast Start試劑盒，購自QIAGEN公司；抗His標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記的鼠抗雞IgG和瓊脂糖，購自Sigma公司；異丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素(Kan+)，購自Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠電泳染色劑Goldview，購自北京中生瑞泰科技有限公司；增強型HRP底物顯色試劑盒，購自Thermo公司；MONTANIDE ISA 201 VG佐劑，購自SEPPIC公司。

1.3 fiber2和flagellin-fiber2基因引物的設(shè)計 根據(jù)實驗室測得FAdV-4 HN2015毒株的基因序列，設(shè)計fiber2基因上下游引物fiber2-F和fiber2-R，并分別在上下游引物中插入SacⅠ和Hind Ⅲ酶切位點，引物序列為：fiber2-F：5′-AATGAGCTCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGA-3′(下劃線部分為SacⅠ酶切位點)，fiber2-R：5′-TAAGCTTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3′(下劃線部分為HindⅢ酶切位點)。根據(jù)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的flagellin-fiber2重組基因序列設(shè)計重組基因flagellin-fiber2上下游引物flagellin-fiber2-F、flagellin-fiber2-R，并插入SacⅠ和NotⅠ酶切位點，引物序列為：flagellin-fiber2-F：5′-GAGCTCGCGATGGCACAAGTAATCAACACT-3′(下劃線部分為SacⅠ酶切位點)，flagellin-fiber2-R：5′-ATATATGCGGCCGCTATATATCGGGAGGGAGGCCGCTGGACA-3′(下劃線部分為NotⅠ酶切位點)。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 目的基因的PCR擴增 以FAdV-4 HN2015毒株中提取的病毒DNA和合成flagellin-fiber2基因為模版，按高保真PCR體系擴增fiber2和flagellin-fiber2基因，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 pET-28a-fiber2，pET-28a-flagellin-fiber2重組表達(dá)載體構(gòu)建 將PCR擴增產(chǎn)物回收，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ+Hind Ⅲ分別同時酶切fiber2基因和pET-28a載體，用SacⅠ+NotⅠ酶切flagellin-fiber2基因和pET-28a載體。酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，隨后用T4 DNA連接酶將酶切產(chǎn)物于16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，選取PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測序。將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。測序由睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.6 fiber2和flagellin-fiber2蛋白表達(dá)及條件優(yōu)化 挑取含陽性重組表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(Kan+，50 mg/L)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1∶100擴大培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.4-0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，240 r/min(37 ℃)振蕩培養(yǎng)4、5、6、7 h，取5 mL不同時間誘導(dǎo)表達(dá)菌液，于6 000 r/min(4 ℃)離心15 min后收集細(xì)菌沉淀，沉淀加入SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，檢測不同時間蛋白表達(dá)情況。

1.7 重組蛋白的Western Blot鑒定 將收集的細(xì)菌沉淀超聲裂解后離心，取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白是否為可溶性表達(dá)。另取一塊蛋白膠，加入上清進(jìn)行SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，5%脫脂奶封閉NC膜2 h，PBST洗膜3次，10 min/次，加FAdV-4免疫陽性血清孵育2 h；洗膜后加HRP標(biāo)記的鼠抗雞IgG二抗孵育2 h；洗膜后加增強型HRP底物顯色液避光反應(yīng)5 min后成像，檢測是否為目的蛋白。

1.8 重組蛋白的純化 將收集的細(xì)菌沉淀加入裂解液超聲30 min，每次超聲5 s間隔10 s，10 000 r/min離心15 min后，取上清加到平衡好的鎳柱中，按照Ni-NTA Fast Start蛋白純化試劑盒說明書進(jìn)行目的蛋白純化。

1.9 重組蛋白對SPF雞的免疫保護試驗 重組蛋白的制備：將fiber2、flagellin-fiber2重組蛋白與佐劑等體積混合，免疫劑量fiber2蛋白50 μg/只，flagellin-fiber2蛋白分別為20 μg/只和50 μg/只。重組蛋白免疫試驗：將32只21日齡SPF雞分成4組，每組8只，分別為陰性對照組、fiber2-50 μg組、flagellin-fiber2-50 μg組、flagellin-fiber2-20 μg組，分別胸肌多點注射免疫蛋白，陰性對照組注射PBS。免疫雞攻毒試驗：免疫后21 d，4組分別肌肉接種FAdV-4毒，102.0EID50/0.2 mL，接種0.4 mL/只。攻毒后，每天監(jiān)測雞的發(fā)病情況，對死亡雞進(jìn)行剖檢觀察病理變化，評價重組蛋白的免疫保護力。

2 結(jié)果

2.1 目的基因PCR擴增 結(jié)果顯示fiber2和flagellin-fiber2基因片段的大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖1、2)。

圖1 fiber2基因PCR鑒定M：2 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：fiber2基因； 2：陰性對照

圖2 flagellin-fiber2基因PCR鑒定M：15 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：陰性對照； 2：flagellin-fiber2基因

2.2 重組質(zhì)粒鑒定 挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性結(jié)果(圖3、4)。

2.3 重組蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件確定 由SDS-PAGE和Western Blot檢測結(jié)果(圖5、6)可知，重組蛋白在37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h時效果最佳，且與預(yù)期目的條帶大小相符。

圖3 質(zhì)粒PCR鑒定M：2 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～4：pET-28a-fiber2

圖4 質(zhì)粒PCR鑒定M：15 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～4：pET-28a-flagellin-fiber2

圖5 pET-28a-fiber2在大腸桿菌中表達(dá)SDS-PAGE(a)和Western Blot(b)鑒定M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1：pET-28a空載體誘導(dǎo)7 h;2～5：分別為37 ℃ pET-28a-fiber2誘導(dǎo)7、6、5、4 h

圖6 pET-28a-flagellin-fiber2在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE(a)和Western Blot(b)鑒定M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1～4：分別為37 ℃ pET-28a-flagellin-fiber2誘導(dǎo)4、5、6、7 h;5：pET-28a空載體誘導(dǎo)7 h

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化 兩種融合表達(dá)蛋白均在上清中表達(dá)，用鎳親和層析柱蛋白純化試劑盒純化目的蛋白(圖7、8)。

圖7 純化fiber2蛋白SDS-PAGE鑒定M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1純化后的fiber2蛋白

圖8 純化flagellin-fiber2蛋白SDS-PAGE鑒定M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化后的flagellin-fiber2蛋白

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot檢測 FAdV-4感染陽性血清與目的蛋白分別在59 kDa和110 kDa處發(fā)生反應(yīng)，與預(yù)期結(jié)果相符(圖9、10)，說明兩重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖9 純化的fiber2蛋白Western Blot鑒定M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化后fiber2蛋白

圖10 純化的flagellin-fiber2蛋白Western Blot鑒定M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化后flagellin-fiber2蛋白

2.6 攻毒保護試驗 陰性對照攻毒組雞死亡率為87.5%(7/8)，flagellin-fiber2-50 μg組為37.5%(3/8)，flagellin-fiber2-20 μg組為25%(2/8)，fiber2-50 μg組為25%(2/8)，免疫組較陰性對照組有明顯的保護作用，且flagellin-fiber2-20 μg組和fiber2-50 μg組免疫效果較好，優(yōu)于flagellin-fiber2-50 μg組(圖11)。對病死雞剖檢可見典型的心包積液和肝臟腫大。

圖11 各實驗組免疫攻毒后雞死亡率

3 結(jié)論與討論

有研究表明，禽腺病毒4型流行普遍，在國內(nèi)流行嚴(yán)重[13]，隨著我國養(yǎng)禽業(yè)迅速發(fā)展，其發(fā)病率、病死率逐年上升，作為一種高傳染性和高死亡率的家禽疾病危害嚴(yán)重[14]。在心包積水綜合征流行嚴(yán)重的國家，研制自家疫苗對本病預(yù)防有一定效果，但存在保護效果不穩(wěn)定和繼發(fā)感染等問題[15]。目前針對FAdV-4引起的禽心包積水-包涵體肝炎綜合征，國內(nèi)尚無商品化疫苗防控感染，又因fiber2基因可誘導(dǎo)產(chǎn)生較多抗體，鞭毛蛋白能夠增強免疫應(yīng)答，基于以上幾點研制針對該病安全高效的亞單位疫苗至關(guān)重要。

為此本試驗利用原核表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了pET-28a-fiber2、pET-28a-flagellin-fiber2重組表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，純化出較高濃度重組蛋白。將純化蛋白免疫SPF雞，分別用佐劑+fiber2-50 μg、佐劑+flagellin-fiber2-20 μg、佐劑+flagellin-fiber2-50 μg組免疫后接種FAdV-4，結(jié)果顯示，對試驗雞均有不同程度免疫保護效果，比較不同蛋白劑量免疫對雞的保護效果發(fā)現(xiàn)，flagellin-fiber2融合蛋白免疫組較低免疫劑量時保護效果好，對雞的保護力并沒隨免疫劑量的增大而升高，免疫劑量增加保護力隨之降低，說明表達(dá)的鞭毛蛋白與外源抗原的融合重組蛋白免疫要達(dá)到最好效果的使用劑量可能和外源抗原種類相關(guān)，柳舒航[16]的IBDV VP2蛋白與鞭毛重組蛋白免疫原性研究中，也呈現(xiàn)較低劑量鞭毛融合蛋白免疫效果較高劑量好的趨勢。本試驗中，flagellin-fiber2-20 μg組與fiber2-50 μg組保護率相同，誘導(dǎo)相同程度免疫反應(yīng)時，鞭毛融合蛋白免疫劑量小于單獨外源抗原免疫劑量，與Huleatt J W[17]等人研究結(jié)果一致。此外，鞭毛融合蛋白免疫效果未高于單獨fiber2免疫組，可能是鞭毛蛋白在與fiber2蛋白融合表達(dá)后，未獨立折疊，空間結(jié)構(gòu)受到干擾，使鞭毛蛋白增強免疫的作用受到影響，使保護力未達(dá)到理想結(jié)果，其機制仍需進(jìn)一步研究。同時若將flagellin-fiber2-20 μg/只和fiber2-50 μg/只免疫應(yīng)用于臨床實踐中，flagellin-fiber2-20 μg可明顯較fiber2-50 μg節(jié)約一定成本；因此本研究為亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

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Study on expression of recombinant flagellin-fiber2 protein and its immunoprotective effects

LIU Chao1，2， HOU Lei2， WEI Li2， WANG Jing2， QUAN Rong2， ZHU Shan-shan2，LI Zi-xuan2， QI Bin-bin2， WANG Li-jia1，2， JIANG Hai-jun2， WANG Dan2， LIU Jue2

(1.Animal Science and Techolagy College， Beijing University Of Agriculture， Beijing 102206， China； 2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China)

The study was to investigate the immunoprotective effects in specific pathogen free (SPF) chickens for recombinant flagellin-fiber2-protein of fowl adenovirus (FAdV) serotype 4. A recombinant gene that was designed by fusing a modified version ofSalmonellatyphimuriumflagellin to FAdV-4 fiber2 gene and a fiber2 gene were cloned into the pET-28a vector for expression inEscherichiacoliBL21. The recombinant proteins were analyzed by SDS-PAGE and Western Blot,and then were used to immunize 21 day-old SPF chickens. The recombinant proteins were induced with 1 mmol/L isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) for 6 h at 37 ℃. Western Blot results showed that the proteins had specific reaction against FADV-4 positive serum,implying that these proteins had good reactivity with the positive serum. Animal test results indicated that the two proteins protect SPF birds from challenge. Moreover,the protective effect of low-dose recombinant flagellin-fiber2 protein was better.

Fowl adenovirus serotype 4 ; flagellin-fiber2 ; prokaryotic expression ; protective effect

LIU Jue

2017-02-27

北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金(QNJJ2016)

劉超(1991-)，女，碩士生，研究方向為畜禽疾病診治，E-mail:15210872560@139.com

劉爵，E-mail:liujue@263.net

S852.65

A

0529-6005(2017)05-0015-05