董春光， 武守艷， 楊麗華， 韓文儒， 趙晶晶， 陳劍波， 韓一超， 王俊東

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 山西太原030032 ； 2.山西省飼料獸藥監(jiān)察所 ， 山西太原030027 ；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山西太谷030801)

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 山西太原030032 ； 2.山西省飼料獸藥監(jiān)察所 ， 山西太原030027 ；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山西太谷030801)

為了建立測(cè)定奶牛血清中代謝產(chǎn)物β-羥丁酸含量的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，為奶牛酮病的早期診斷提供新途徑。將奶牛血清樣品用甲醇除蛋白，上清液經(jīng)氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)M(jìn)行硅烷化衍生后，用GC-MS儀全掃描方式進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果測(cè)定血清中β-羥丁酸的線(xiàn)性范圍為0.05 mmol/L～8 mmol/L，相關(guān)系數(shù)R=0.9995，檢測(cè)限為0.03 mmol/L，定量限為0.05 mmol/L,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=5.79%，樣品加標(biāo)回收率為95.10%～99.91%。表明該方法能簡(jiǎn)便、快速、有效地分離并定量檢測(cè)血清中的β-羥丁酸，可以作為奶牛酮病的早期診斷依據(jù)。

氣相色譜-質(zhì)譜法 ； β-羥丁酸 ； 奶牛酮病

奶牛酮病是泌乳牛常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病。當(dāng)奶牛的采食量不能滿(mǎn)足泌乳所消耗的能量需要時(shí)出現(xiàn)能量負(fù)平衡，從而產(chǎn)生過(guò)多的酮體，超過(guò)了機(jī)體自身組織能夠利用的限度時(shí)，就會(huì)在機(jī)體內(nèi)蓄積，引起酮病。血液生化表現(xiàn)為血、尿、乳中的酮體(β-羥丁酸、丙酮、乙酰乙酸)含量增加。

在我國(guó)高產(chǎn)牛群中，臨床型酮病的發(fā)病率一般占產(chǎn)后母牛的2%～20%，而亞臨床型酮病的發(fā)病率則更高，占產(chǎn)后母牛的10%～30%[1]。酮病的發(fā)生直接導(dǎo)致治療費(fèi)用增加、奶牛產(chǎn)奶量大幅度降低、乳成分改變、繁殖率降低以及淘汰率升高[2]，同時(shí)也能繼發(fā)母牛的營(yíng)養(yǎng)不良和不孕癥，不僅給牧場(chǎng)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，而且病牛的奶被人食用后還可能會(huì)影響人的健康[3]。在生產(chǎn)中，臨床型酮病有比較明顯的癥狀，容易診斷，而對(duì)于亞臨床型酮病，由于沒(méi)有明顯的臨床癥狀，給診斷帶來(lái)很大的困難，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成的損失更大[4]。目前常用的診斷酮病的方法大多還是通過(guò)顯色反應(yīng)定性鑒別的方法，不能準(zhǔn)確、定量地判斷疾病的程度和發(fā)展過(guò)程，因此建立一種能夠盡早地、簡(jiǎn)單快速地進(jìn)行酮體定量檢測(cè)的新方法具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用作為一種高效的分離分析方法，具有靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[5]，近年來(lái)在疾病診斷，尤其是在疾病的早期診斷及進(jìn)一步闡明發(fā)病機(jī)制方面，發(fā)揮出越來(lái)越重要的作用，而目前尚未見(jiàn)到用于檢測(cè)奶牛血清酮體β-羥丁酸含量從而診斷奶牛酮病及其患病程度的報(bào)道。本試驗(yàn)旨在建立氣相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)運(yùn)用于酮病早期診斷的新方法，以期盡早診斷酮病，減少損失。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 6890N-5973I氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)郝黎氏公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)Dikma公司)；β-羥丁酸(純度98%，美國(guó)Alfa Aesar)，甲氧胺鹽酸鹽(純度98%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；N, O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1，美國(guó)Sigma-Aldrich Fluka公司)；吡啶(分析純，北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 對(duì)照溶液的配制 精確稱(chēng)取β-羥丁酸標(biāo)準(zhǔn)品0.104 g于50 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為20 mmol/L的β-羥丁酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。準(zhǔn)確移取一定量的儲(chǔ)備液于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使其逐級(jí)稀釋成8 mmol/L，4 mmol/L，2 mmol/L，0.8 mmol/L，0.2 mmol/L，0.05 mmol/L，0.03 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣本處理 取奶牛血清樣品200 μL，加入甲醇200 μL，旋渦振蕩30 s，10 000 r/min (4 ℃)離心10 min后取上清液于小玻璃瓶中，溫和氮?dú)獯蹈桑驓堅(jiān)屑尤?0 mg/mL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液80 μL，旋渦振蕩30s，37 ℃孵化90 min，再加入120 μL BSTFA+TMCS硅烷化試劑，70 ℃衍生1 h，4 ℃離心后取上清液供氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件 色譜柱：HP-5MS玻璃毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣口溫度：280 ℃；柱溫：80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升溫至300 ℃，保持6 min；傳輸線(xiàn)溫度：250 ℃；離子源(EI)溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；載氣：氦氣(99.99%)，流速：1 mL/min，質(zhì)量掃描范圍：50～600 AMU；溶劑延遲時(shí)間：3.2 min。

2 結(jié)果

2.1 樣品前處理及檢測(cè)條件的優(yōu)化 血清中加入甲醇后產(chǎn)生大量的白色沉淀，經(jīng)過(guò)10 000r/min離心后，可以除去樣品中的沉淀物，上清液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蠹纯赏耆ゼ状迹玫缴倭抗腆w物質(zhì)。再經(jīng)過(guò)衍生化反應(yīng)后得到清亮的液體，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，可得到總離子流圖和質(zhì)譜圖(圖1)。結(jié)果表明，此樣品處理方法既可有效去除雜質(zhì)，又可充分提取目標(biāo)物質(zhì)，適合于氣相色譜-質(zhì)譜分析。對(duì)不同濃度的β-羥丁酸在分流進(jìn)樣和不分流進(jìn)樣模式下的信噪比進(jìn)行比較，當(dāng)濃度低于0.2 mmol/L時(shí)，不分流模式的信噪比比分流模式高，仍可保持較高的敏感性，因此選用不分流進(jìn)樣模式。

2.2 方法的線(xiàn)性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限 將1.2項(xiàng)中逐級(jí)稀釋的7個(gè)濃度的β-羥丁酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別經(jīng)1.3項(xiàng)的方法進(jìn)行處理后，在1.4項(xiàng)的氣相色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 方法的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍

在β-羥丁酸濃度為0.03 mmol/L時(shí)，信噪比S/N=3.7，β-羥丁酸濃度為0.05 mmol/L時(shí)，信噪比S/N=12.7，確定該方法的檢測(cè)限為0.03 mmol/L，定量限為0.05 mmol/L。β-羥丁酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的總離子流圖和質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1a，1b。

2.3 精密度試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(0.8 mmol/L)200 μL按上述相同的樣品處理方法和氣相色譜-質(zhì)譜條件重復(fù)測(cè)定6次(表2)，計(jì)算該方法的精密度。測(cè)得該方法的精密度RSD為5.79%。

表2 精密度試驗(yàn)

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn) 取某一奶牛血清樣品4份，每份200 μL，分別加入0 μL，80 μL，100 μL，120 μL的β-羥丁酸(2 mmol/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述相同的前處理和氣相色譜-質(zhì)譜條件，每個(gè)添加量重復(fù)進(jìn)樣5次，檢驗(yàn)方法的加標(biāo)回收率(結(jié)果見(jiàn)表3)。測(cè)得β-羥丁酸的加標(biāo)回收率為95.10%～99.91%。

表3 不同添加量的加標(biāo)回收率

a

b

3 討論

酮體是β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮的總稱(chēng)。通常情況下，β-羥丁酸的含量占78%、乙酰乙酸和丙酮分別占20%和2%[6]。目前在酮病診斷方法中，多利用特定試劑與乙酰乙酸的顯色反應(yīng)來(lái)達(dá)到檢測(cè)酮體的目的，但是，由于乙酰乙酸在酮體中所占比例較小，且性質(zhì)不穩(wěn)定，容易分解成丙酮和二氧化碳，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較大，因此，本試驗(yàn)以β-羥丁酸作為檢測(cè)對(duì)象，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

氣相色譜-質(zhì)譜法以其自身的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已在疾病診斷、藥物分析、代謝產(chǎn)物的分離分析等微量成分分析各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[5, 7]。由于動(dòng)物血清中含有大量蛋白質(zhì)、脂肪酸及膽固醇等有機(jī)物，而這些物質(zhì)具有一定的粘附性，很容易在色譜柱上吸附，從而影響色譜柱的使用壽命，因此，在運(yùn)用GC-MS進(jìn)行分析之前，為了保護(hù)色譜柱以及減少對(duì)測(cè)定的干擾，需要進(jìn)行除蛋白質(zhì)等前處理步驟。除蛋白質(zhì)是應(yīng)用有機(jī)溶劑沉淀去除血清中所含的大量蛋白質(zhì)成分[8]，目前常用的除蛋白試劑有甲醇、乙腈、甲醇/乙醇等[9]，用甲醇除蛋白操作簡(jiǎn)單且效果顯著[10]，因此，本試驗(yàn)采用了甲醇作為除蛋白試劑。

氣相色譜檢測(cè)的衍生化方法有硅烷化衍生化、酯化衍生化、?；苌龋康氖菍㈦y揮發(fā)或熱不穩(wěn)定化合物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變成易揮發(fā)和穩(wěn)定的化合物，更利于進(jìn)行CC-MS分析。本試驗(yàn)中利用硅烷化試劑將硅烷基引入到分子中，取代了羧基中的活性氫，從而降低了化合物的極性，形成的衍生物更容易揮發(fā)，同時(shí)穩(wěn)定性也得到了加強(qiáng)。從試驗(yàn)的線(xiàn)性關(guān)系，加標(biāo)回收率等指標(biāo)可以看出，該衍生化方法的衍生效果可以滿(mǎn)足檢測(cè)的要求。

4 結(jié)論

該檢測(cè)方法的分離效果好，靈敏度高，檢測(cè)范圍廣，可以準(zhǔn)確檢測(cè)血清中β-羥丁酸的含量，為早期準(zhǔn)確診斷奶牛酮病提供新的途徑。

[1] 王林, 高慧, 王峰. 奶牛酮病研究進(jìn)展[J]. 飼料研究, 2006(1): 42-44.

[2] Walsh R B, Walton J S, Kelton D F,etal. The effect of subclinical ketosis in early lactation on reproductive performance of postpartum dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2007, 90(6): 2788-2796.

[3] 趙占宇, 吳躍明, 劉建新, 等. 高產(chǎn)奶牛酮病的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)草食動(dòng)物, 2007, 27(5): 58-60.

[4] Herdt T H. Ruminant adaptation to negative energy balance. Influences on the etiology of ketosis and fatty liver[J]. Vet Clin North Am Food Anim Pract, 2000, 16(2): 215-230.

[5] 李娟, 任路靜, 孫冠男, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其在代謝組學(xué)中的應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(4): 434-446.

[6] 賈宗菲, 石建朋, 弓慧敏，等. 不同方法檢測(cè)奶牛亞臨床酮病的比較[J]. 中國(guó)奶牛, 2010(8): 43-45.

[7] 國(guó)金玲, 張朔生. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥品及食品分析中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)藥事, 2016, 30(6): 560-563.

[8] 王斯婷, 李曉娜, 王皎, 等. 代謝組學(xué)及其分析技術(shù)[J]. 藥物分析雜志, 2010(9): 1792-1799.

[9] Bruce S J, Tavazzi I, Parisod V,etal. Investigation of human blood plasma sample preparation for performing metabolomics using ultrahigh performance liquid chromatography/mass spectrometry[J], Anal Chem, 2009, 81(9): 3285-3296.

[10] 曹璐穎, 鄭文杰, 李克. 甲醇沉淀法去除人血清高豐度蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究[J], 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào), 2012, 25(11): 1151-1154.

Determination of β-hydroxybutyrate in cow serum by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

DONG Chun-guang1, WU Shou-yan1, YANG Li-hua1, HAN Wen-ru1, ZHAO Jing-jing2, CHEN Jian-bo1, HAN Yi-chao1, WANG Jun-dong3

(1.Animal Husbandry and Veterinary Institute, Shanxi Academy of Agricultural Science, Taiyuan 030032, China; 2.Shanxi Province Institute of Feed and Veterinary Drug Control, Taiyuan 030027, China; 3.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

To establish the method of gas chromatography-mass spectrometry for measuring β-hydroxybutyrate in cow serum and provide a new way to diagnose dairy ketosis. Methanol was used for precipitating the proteins and supernate was dried by nitrogen. The concentrate was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry after derivatization with slilylreagents. Linear relation of β-hydroxybutyrate detected in cow serum ranged from 0.05mmol/L to 8mmol/L. The correlation coefficient was 0.9995. The detection limit was 0.003mmol/L and the limit of quantitation was 0.05mmol/L. Relative standard deviation was 5.79% and the adding standard recovery was 95.10% to 99.91%. The method can separate and detect β-hydroxybutyrate in dairy serum simply, rapidly and effectively, and it is suitable for early diagnosis of dairy ketosis.

Gas chromatography-mass spectrometry ; β-hydroxybutyrate ; Dairy ketosis

s：HAN Yi-chao ; WANG Jun-dong

2016-04-06

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2012BAD12B06-2)；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所課題(xms201502)

韓一超，E-mail:hyc7092502@126.com；王俊東，E-mail：wangjd53@outlook.com

S854.4

A

0529-6005(2017)05-0101-03