廖夏旖，潘 航，Narayan Paudyal，李國煒，劉亞杰，方維煥，李肖梁

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 浙江大學(xué)動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，浙江 杭州 310058)

滿膛與凈膛冷鮮雞微生物污染特征分析

廖夏旖，潘 航，Narayan Paudyal，李國煒，劉亞杰，方維煥，李肖梁*

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 浙江大學(xué)動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，浙江 杭州 310058)

探索滿膛與凈膛方式屠宰加工的冷鮮雞中重要微生物污染情況，以期為冷鮮雞的微生物控制技術(shù)開發(fā)提供依據(jù)。研究分別采集屠宰加工后第0～2天的滿膛雞與凈膛雞的開膛處肌肉，采用國標(biāo)法和實時熒光定量檢測法進(jìn)行總菌數(shù)檢測以及大腸菌群、空腸彎曲菌等微生物分類計數(shù)，并使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。研究結(jié)果表明，凈膛雞中菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)和空腸彎曲菌3個指標(biāo)的檢測合格率均低于滿膛雞；凈膛雞的總菌數(shù)和大腸菌群數(shù)顯著高于滿膛雞；不同禽類屠宰場來源的滿膛雞總菌數(shù)和大腸菌群數(shù)差異顯著，而凈膛雞差異不顯著；在第0～2天低溫(4 ℃)儲存貨架期內(nèi)，凈膛雞的微生物污染變化與滿膛雞差異不顯著，但凈膛雞中微生物的增殖速度較滿膛雞緩慢。16S rDNA檢測，凈膛雞和滿膛雞中均存在多種微生物，但在種類上也存在著一定的差異，其中陰溝腸桿菌等7種微生物未在滿膛雞中檢測到。凈膛雞和滿膛雞微生物均存在著超標(biāo)現(xiàn)象；凈膛雞中的二次污染較為嚴(yán)重；在貨架期保鮮方面，凈膛雞具有優(yōu)勢。結(jié)果為冷鮮雞的微生物控制技術(shù)開發(fā)以及凈膛工藝的優(yōu)化提供依據(jù)。

滿膛雞； 凈膛雞； 凈膛工藝； 二次污染

從“戰(zhàn)勝”禽流感等禽類疾病傳播、促進(jìn)養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的長遠(yuǎn)計，加強(qiáng)家禽流通市場的管理，對活禽進(jìn)行“集中屠宰、冷鏈供應(yīng)、冰鮮上市”將是必然趨勢。浙江、廣東、上海等多個省份共關(guān)閉2 000余個活禽市場。根據(jù)《浙江省人民政府辦公廳關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)人感染H7N9禽流感防控工作的通知》要求，自2014年7月1日起浙江省縣市區(qū)主城區(qū)永久性關(guān)閉活禽交易市場。這意味著，冷鮮雞將成為雞肉的主要供應(yīng)方式。消費習(xí)慣和模式的轉(zhuǎn)變，對上市冷鮮禽的安全提出了更高的要求。

據(jù)國家衛(wèi)計委關(guān)于2015年全國食物中毒事件情況的通報顯示，微生物性食物中毒事件報告的中毒人數(shù)最多，共計3 181人，占總中毒人數(shù)的53.7%，可見食源性致病微生物是導(dǎo)致食品安全問題的最主要危險因素之一。而雞肉是人們膳食中蛋白質(zhì)的重要來源，有統(tǒng)計顯示，禽肉在肉類消費結(jié)構(gòu)中的比重自1982年起持續(xù)攀升，至2012年我國的禽肉產(chǎn)量達(dá)1 823萬t[1]。研究表明[2-4]，我國肉雞市場均有不同程度及不同種類的微生物污染，存在很大的安全隱患。滿膛和凈膛冷鮮雞是目前市場上供應(yīng)冷鮮雞的兩種重要的產(chǎn)品，盡管滿膛冷鮮雞供應(yīng)已被命令禁止，但由于我國傳統(tǒng)的消費習(xí)慣使然，市民更傾向于選擇價格較低、胴體完整的滿膛雞[5]。凈膛雞與滿膛雞的微生物污染情況、貨架期對其微生物分布特征的影響等研究甚少。

本研究旨在探明凈膛與未凈膛冷鮮雞經(jīng)屠宰加工工序以及貨架期的微生物污染情況，以期為冷鮮雞的屠宰場加工工藝的優(yōu)化以及微生物控制技術(shù)開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

平板計數(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)、煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)、布氏肉湯、改良skirrow培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基均購自北京路橋生物有限公司，無菌PBS緩沖液(pH值7.2 10 μmol·L-1)、瓊脂糖凝膠、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購自北京天根生物工程公司，16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測序由博尚公司完成，Vazyme AceQTM Qpcr Probe Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。16S rDNA的PCR擴(kuò)增采用通用引物，針對C.jejuni中單拷貝基因mapA設(shè)計一對引物和一條探針，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 靶基因名稱及引物序列

目的基因引物名稱引物序列產(chǎn)物大小/bp16SrDNA16S?F5′?ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC?3′150016S?R5′?GGACGGTAACTAGTTTAGTATT?3′mapART?F5′?TGTCAAGCACAACTATTCCTC?3′126RT?R5′?TAAAAGAAGGGCAAAAGGT?3′TaqmanFAM?ACCGCATTAAAATTCACATCGACA?TAMRA

1.2 材料與儀器

手術(shù)刀、鑷子、超凈工作臺、一次性無菌平皿、無菌袋、電子秤、均質(zhì)器、恒溫培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測儀、搖床、高溫高壓滅菌鍋、烘箱、漩渦振蕩器、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、沸水浴鍋、PCR儀、電泳儀、熒光定量PCR儀(Bio-RAD)、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、厭氧培養(yǎng)罐、超純水系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與分組

選取杭州市3個禽類定點屠宰場，分別購買同一屠宰場、同一生產(chǎn)批次的10只凈膛雞和10只滿膛雞。冷鮮雞購買后均單獨置于無菌袋中送至實驗室。取回后，每個屠宰場立即分別取5只凈膛雞和5只滿膛雞進(jìn)行樣品預(yù)處理，其余樣品于4 ℃保存48 h后進(jìn)行模擬貨架期微生物生長、失活情況分析。

1.3.2 樣品預(yù)處理

超凈臺內(nèi)用無菌剪分別剪取開膛處的肉樣，放在無菌平板內(nèi)準(zhǔn)確稱量10 g(雞胸肉5 g，最后一排肋骨下兩側(cè)5 g)，剪碎肉樣放入盛有90 mL PBS緩沖液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打2 min，制成1∶10的樣品勻液。每只雞作為1個樣本。

1.3.3 總菌數(shù)檢測

菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2010測定[6]。取1∶10的樣品勻液1 mL作10倍連續(xù)稀釋至10-5，不同稀釋度的樣品勻液于平板計數(shù)瓊脂上進(jìn)行涂板計數(shù)，每個稀釋度做4個平行，每個平行取10 μL涂板。37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，選取菌落數(shù)為15～150的無蔓延菌落生長的平板進(jìn)行總菌落計數(shù)。

1.3.4 細(xì)菌種類檢測

隨機(jī)挑選37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h后的凈膛雞和滿膛雞樣品對應(yīng)平板各2個，每板挑取3個大小不一的菌落，接種于1 mL BHI中，37 ℃于120 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，水煮法提取DNA，16S rDNA PCR擴(kuò)增后，送測序公司對產(chǎn)物雙向測序。16S rDNA擴(kuò)增反應(yīng)條件95 ℃ 5 min，1 cycle；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35 cycles；72 ℃延伸10 min。

1.3.5 大腸菌群計數(shù)

大腸菌群數(shù)按照GB 4789.3—2010測定[7]。取上述合適稀釋度的樣品勻液于VRBA平板上涂板計數(shù)，每個稀釋度4個平行，每個平行10 μL，37 ℃恒溫18 h。選取菌落在15～150的無蔓延菌落生長的平板計數(shù)，并挑選10個典型及可疑菌落于裝有倒立杜氏試管的BGLB肉湯中37 ℃恒溫24 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。平板計數(shù)結(jié)果乘以BGLB肉湯陽性管比例即實際大腸菌群菌落數(shù)。

1.3.6 空腸彎曲菌計數(shù)

Real-time PCR檢測C.jejuni的方法由本實驗室建立，簡述如下。首先制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。將凍存的C.jejuni劃線至skirrow平板，待菌落長出后挑取單菌落于布氏肉湯中微需氧條件下42 ℃培養(yǎng)36 h，6 000 r·min-1離心10 min，棄上清，PBS洗滌一次，重懸沉淀調(diào)整D620至0.15 (菌液濃度約為109mL-1)，10倍梯度稀釋。選取合適濃度的菌液于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基上點板計數(shù)，并與原菌液試劑盒法一起提取DNA，原菌液提取得到的DNA用雙蒸水10倍稀釋8個梯度，采用Vazyme AceQTM qPCR Probe Master Mix試劑盒與已點板計數(shù)的菌液DNA(參照DNA)一同進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，1 cycle；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 15 s，40 cycles。其次進(jìn)行待測樣品熒光定量檢測。取1∶10稀釋的樣品勻液2 mL(可簡短離心以去除較大肉沫)，利用細(xì)菌基因組DNA試劑盒法抽提DNA，并與8個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)空腸彎曲菌DNA同步熒光定量擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)品2個重復(fù)，待測樣3個重復(fù)。計算空腸彎曲菌數(shù)。

1.3.7 模擬貨架期微生物生長/失活情況

分別對4 ℃保存48 h的5只凈膛雞和5只滿膛雞樣品預(yù)處理，檢測總菌數(shù)、大腸菌群數(shù)、空腸彎曲菌數(shù)及細(xì)菌種類，并記錄結(jié)果。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)處理

先對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行格拉布斯(Grubbs)檢驗，剔除異常值，然后采用單因素方差分析檢驗，比較滿膛雞與凈膛雞開膛處肌肉中3種微生物的總體平均數(shù)以及貨架期內(nèi)冷鮮雞肌肉中微生物在4 ℃冷藏保存的生長/失活情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 滿膛雞與凈膛雞合格率

根據(jù)GB 16868—2005鮮、凍禽產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)[8]，鮮雞肉菌落總數(shù)不得超過106g-1，大腸菌群數(shù)不得超過104(100 g)-1，空腸彎曲菌不得檢出。菌落總數(shù)檢測結(jié)果顯示，滿膛雞合格率為6.7%，凈膛雞為0；大腸菌群數(shù)檢測結(jié)果顯示，滿膛雞合格率為66.7%，凈膛雞合格率為26.7%；空腸彎曲菌檢測結(jié)果顯示，滿膛雞合格率為26.7%，凈膛雞合格率為13.3%。凈膛雞針對3個指標(biāo)檢測的合格率均低于滿膛雞。

2.2 滿膛與凈膛雞微生物污染情況比較

滿膛雞與凈膛雞幾種微生物污染情況比較見表2。凈膛雞的總菌數(shù)和大腸菌群數(shù)顯著高于滿膛雞；兩者空腸彎曲菌數(shù)經(jīng)方差分析無顯著差異。

表2 滿膛雞與凈膛雞微生物污染情況 lg g-1

注：同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

2.3 不同屠宰場滿膛雞與凈膛雞微生物污染情況差異比較

來自杭州市不同定點禽類屠宰場的滿膛雞與凈膛雞微生物污染情況見圖l。結(jié)果表明，屠宰場A、B、C三地滿膛雞總菌數(shù)分別為7.29、6.64和7.28 lg g-1，差異顯著；大腸菌群數(shù)分別為5.15、5.13和6.69 lg g-1，差異極顯著。凈膛雞總菌數(shù)分別為7.65、7.24和7.32 lg g-1，差異不顯著；大腸菌群數(shù)依次為5.98、6.48和6.46 lg g-1，差異不顯著。三地滿膛雞和凈膛雞空腸彎曲菌數(shù)差異均不顯著。

圖1 滿膛雞(a)、凈膛雞(b)在不同屠宰場中微生物污染情況差異

2.4 滿膛雞與凈膛雞低溫冷藏下微生物污染變化

貨架期對滿膛雞和凈膛雞微生物生長影響見圖2。結(jié)果顯示，4 ℃冷藏48 h后，肉雞的總菌數(shù)與大腸菌群數(shù)均有顯著增長。滿膛雞總菌數(shù)增長0.79 lg g-1，凈膛雞增長0.69 lg g-1；滿膛雞大腸菌群增長0.75 lg g-1，凈膛雞增長0.44 lg g-1。空腸彎曲菌數(shù)均顯著減少，滿膛雞減少0.45 lg g-1，凈膛雞減少0.48 lg g-1。試驗結(jié)果表明，4 ℃冷藏條件下不能有效抑制大部分微生物的增長，而空腸彎曲菌對低溫不耐受，故能被有效抑制并減少。方差分析結(jié)果顯示，滿膛雞與凈膛雞低溫冷藏48 h時的總菌數(shù)、大腸菌群數(shù)和空腸彎曲菌數(shù)的變化差異不顯著，但從變化趨勢來看，凈膛雞相較于滿膛雞，其總菌數(shù)、大腸菌群數(shù)的增長速度較緩慢，空腸彎曲菌的減少速度較快。

圖2 4 ℃貯藏48 h后滿膛雞與凈膛雞微生物污染變化情況

2.5 細(xì)菌種類

凈膛雞、滿膛雞中均攜帶的菌群具有高度種屬多樣性，每個屠宰場凈膛雞、滿膛雞攜帶的菌落有一定的共性，也存在一定的差異。其中滿膛凈膛雞均攜帶的菌群主要包括不動桿菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬，其中氣單胞菌屬為優(yōu)勢菌群；僅在滿膛雞中檢測到的菌群有嗜泉氣單胞菌、溶酪大球菌、霍氏腸桿菌、Comamonasjiangduensis。僅凈膛雞中檢測到的菌群有蜂房哈弗尼菌、Acinetobacterparvus、鮑氏不動桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、阿氏腸桿菌、泡囊假單胞菌。

3 討論

本研究顯示，凈膛雞的總菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及空腸彎曲菌數(shù)的合格率均低于滿膛雞，并且凈膛雞的以上3種微生物的計數(shù)平均值均高于滿膛雞，此外在凈膛雞中檢測到滿膛雞中未檢出的陰溝腸桿菌等7種微生物。這表明屠宰加工后凈膛雞的微生物污染情況比滿膛雞嚴(yán)重，且可能存在二次污染。屠宰加工雖對雞胴體進(jìn)行清洗消毒，但效果不理想，反而加重微生物污染情況，此結(jié)果與夏小龍[9]等與張秀麗[10]等對肉雞屠宰加工過程污染微生物分析結(jié)果相符。

從屠宰加工工序來看，滿膛雞與凈膛雞的區(qū)別在于掏膛操作以及之后的預(yù)冷池消毒。規(guī)范的凈膛工藝能夠有效降低微生物數(shù)量，而國內(nèi)的凈膛工藝尚未優(yōu)化成熟。在理想狀態(tài)下，凈膛操作可有效降低肉雞自體攜帶的各種微生物。Irena等[11]對捷克某一屠宰場檢測結(jié)果顯示，隨著去毛、凈膛、沖洗、冷凍工序進(jìn)行，總菌數(shù)與大腸桿菌數(shù)是逐級減少的。Keener等[12]研究表明，凈膛能減少雞胴體彎曲菌的數(shù)量。但是，去內(nèi)臟過程中腸道易破損，腸道內(nèi)攜帶的很多天然菌落會污染肉雞胴體表面，使去內(nèi)臟后胴體污染菌的種類和數(shù)量增加。同時，凈膛后雖去除了自體微生物，但卻也為加工過程中的細(xì)菌提供了新的表面皮膚供殖源。孫彥雨等[13]對凈膛前后雞胴體微生物進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)去內(nèi)臟后微生物多樣性增加。李虹敏等[14]的研究成果中也有提到，凈膛間工人手的微生物污染程度最高，在凈膛后雞胴體的微生物數(shù)量顯著上升。掏膛造成的污染很大程度上是因為腸道破裂導(dǎo)致自體微生物溢出，繼而污染設(shè)備及工人手，引發(fā)交叉污染。本試驗檢測的空腸彎曲菌作為致病菌，一旦進(jìn)入人的食物鏈很容易導(dǎo)致感染或食物中毒現(xiàn)象的發(fā)生，而其源頭很多時候是家禽屠宰過程中糞便的溢出使加工中的禽肉受到了彎曲菌的污染[15]。因此在屠宰過程中減少腸溶現(xiàn)象對減少肉雞胴體微生物污染及保證雞肉安全具有重要作用。

預(yù)冷過程對消除胴體微生物污染起著重要的作用，閔紅等研究表明[16]，在預(yù)冷水中可檢出大量微生物污染，這樣非但對禽類胴體沒起到消毒作用反而具有一定的污染。理想情況下，通過水的沖洗作用能沖洗掉胴體表面粘附的大部分細(xì)菌，并且4 ℃以下的水溫和水中一定濃度的消毒劑能抑制絕大多數(shù)嗜溫細(xì)菌的生長繁殖[14]，但由于嗜冷腐敗菌經(jīng)常定居在預(yù)冷水槽中及冷卻用冰上，預(yù)冷過程也會導(dǎo)致交叉污染的發(fā)生[17-18]。預(yù)冷池中雖然加入了一定濃度的消毒劑，但仍樊靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)在加工過程中某些工序會產(chǎn)生交叉污染，后期的預(yù)冷過程會導(dǎo)致嗜冷菌的污染。預(yù)冷過程作為屠宰加工工序的關(guān)鍵減菌節(jié)點，應(yīng)選擇合適的減菌劑類別及濃度，合理控制預(yù)冷水的置換時間，定期清洗預(yù)冷池，以避免預(yù)冷池對禽肉胴體造成的二次污染。

在本次試驗中不同屠宰場之間的滿膛雞總菌數(shù)與大腸菌群數(shù)差異顯著，而凈膛雞不顯著，這說明掏膛和預(yù)冷對于改變凈膛雞的微生物數(shù)量是有效的。分析差異原因，不同屠宰場的肉雞來源不同，養(yǎng)殖環(huán)境與方式也不相同，故肉雞體內(nèi)的菌落種類與數(shù)量也不相同；屠宰加工僅對滿膛雞肉的皮膚進(jìn)行沖洗消毒等操作，對改變其體內(nèi)的微生物污染情況影響不大。因此滿膛雞的總菌數(shù)與大腸菌群數(shù)在不同屠宰場之間有顯著的差異。而凈膛雞由于掏膛操作，去除了內(nèi)臟，因此排除了來自不同屠宰場的肉雞之間的差異；同時肉雞的體內(nèi)環(huán)境暴露在外，經(jīng)過相似的屠宰加工環(huán)節(jié)，胴體的菌群生長狀況趨于相同。因此凈膛雞的總菌數(shù)與大腸菌群數(shù)在不同屠宰場之間無顯著差異。這些現(xiàn)象表明，凈膛操作對于改變雞胴體的微生物數(shù)量是必要的。

在48 h低溫儲存的貨架期內(nèi)，凈膛雞保鮮效果與滿膛雞未產(chǎn)生顯著差異，但表現(xiàn)出總菌數(shù)、大腸菌群數(shù)的增長相對緩慢的趨勢，這說明隨著貨架期的延長，凈膛雞的微生物數(shù)量控制相對滿膛雞具有優(yōu)勢。生鮮雞肉的化學(xué)與物理減菌保鮮技術(shù)研究目前較為活躍[20]，在屠宰加工階段有效控制微生物數(shù)量，肉雞的貨架期就能得以延長。

在當(dāng)前各地紛紛出臺關(guān)閉活禽市場的政策下，凈膛雞的屠宰包裝和冰鮮上市是產(chǎn)品發(fā)展的必然結(jié)果。而凈膛雞微生物污染的現(xiàn)狀表明，當(dāng)前屠宰過程的污染情況仍然非常嚴(yán)峻，冷鮮雞的微生物控制技術(shù)亟待開發(fā)與優(yōu)化。

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(責(zé)任編輯：萬 晶)

2017-01-21

浙江省科技廳重大科技專項重大農(nóng)業(yè)項目(2014C02001)

廖夏旖(1994—)，女，碩士研究生，研究方向為食品微生物學(xué)，E-mail：xyliao@zju.edu.cn。

李肖梁，研究員，E-mail：xlli@zju.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170545

TS251.1

A

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文獻(xiàn)著錄格式：廖夏旖，潘航，Narayan Paudyal，等. 滿膛與凈膛冷鮮雞微生物污染特征分析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(5)：864-869.