刁 姝，孫 超，孫曉梅，張守攻

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

基于毛細(xì)管電泳的日本落葉松MSAP反應(yīng)體系的建立

刁 姝，孫 超，孫曉梅，張守攻*

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

[目的]建立基于毛細(xì)管電泳的日本落葉松最佳MSAP反應(yīng)體系，獲得條帶清晰，信號強(qiáng)度均一的DNA甲基化圖譜，為今后開展日本落葉松表觀遺傳變異研究奠定基礎(chǔ)。[方法]以日本落葉松未成熟木質(zhì)部為試材，設(shè)置不同梯度的DNA模板用量以及選擇擴(kuò)增體系中引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度和exTaq DNA聚合酶濃度，確定各組分不同用量對毛細(xì)管電泳效果的影響，從而確立最適的MSAP反應(yīng)體系。[結(jié)果]結(jié)果表明模板DNA以及exTaq DNA聚合酶濃度對毛細(xì)管電泳結(jié)果影響不明顯，而高的引物濃度會引起條帶的減少。Mg2+及dNTP濃度是影響毛細(xì)管電泳結(jié)果最為關(guān)鍵的因素，濃度過低或過高會導(dǎo)致毛細(xì)管電泳圖譜條帶明顯減少，雜峰顯著增多。[結(jié)論] 最終確立的反應(yīng)體系為：DNA 模板100 ng，引物0.75 pmol·μL-1，Mg2+2 mmol·L-1，dNTP 0.375 mmol·L-1和exTaq DNA聚合酶 0.05 U·μL-1。

DNA甲基化；甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)；毛細(xì)管電泳；體系建立；日本落葉松

DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基基團(tuán)共價結(jié)合到胞嘧啶5’碳位上的過程[1]。 DNA甲基化是目前研究最為深入的表觀遺傳修飾。DNA甲基化既發(fā)生于對稱的CG，CHG序列上，也發(fā)生于非對稱的CHH(H=A，C或T)序列上[2]。DNA甲基化參與調(diào)控植物體多種生長發(fā)育過程及表型可塑性，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)花發(fā)育過程[3]、水稻(Oryzasativa)種子發(fā)育過程[4]及紅樹植物拉關(guān)木(Lagunculariaracemosa)對不同環(huán)境的適應(yīng)性[5]等。

目前應(yīng)用最為廣泛的全基因組水平DNA甲基化檢測方法主要分為兩類，一類依托于高通量測序技術(shù)，包括全基因組亞硫酸鹽測序法(Whole genome bisulfite sequencing，WGBs)、簡化代表性亞硫酸鹽測序法(Reduced reperesentation bisulfite sequencing，RRBS)和DNA甲基化免疫共沉淀測序法(Methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-seq)等[6]，可在全基因組水平獲得DNA甲基化信息，但價格昂貴且需要物種的全基因組序列；另一類是基于限制性內(nèi)切酶的甲基化敏感擴(kuò)增多樣性(methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP)檢測技術(shù)。MSAP技術(shù)是在AFLP技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，將AFLP中的內(nèi)切酶MseI替換成同裂酶HpaII及MspI[7]，通過比較兩種同裂酶分別與EcoR I組合獲得電泳條帶的差異確定CCGG位點(diǎn)甲基化情況。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、成本低，無需已知參考基因組序列，缺點(diǎn)是只能獲得全基因組部分DNA甲基化信息。

日本落葉松(Larixkaempferi)是我國重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)樹種，具有生長速度快、抗病性強(qiáng)和適應(yīng)性廣的特點(diǎn)[8]，開展日本落葉松DNA甲基化研究有助于在表觀遺傳水平解析其表型變異。由于參考基因組序列未知，李愛應(yīng)用基于傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳的MSAP技術(shù)在日本落葉松中檢測了1447個5’-CCGG 位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)日本落葉松雜種優(yōu)勢可能與DNA甲基化模式的大量調(diào)整密切相關(guān)[9]，但聚丙烯酰胺凝膠電泳耗時長，擴(kuò)增條帶難以確認(rèn)，靈敏性差，不利于大樣本的表觀遺傳變異研究?；诿?xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)的MSAP技術(shù)可以克服上述缺陷，但對反應(yīng)體系要求比較高。本研究擬通過分析DNA模板用量及選擇性擴(kuò)增體系中主要成分濃度對毛細(xì)管電泳結(jié)果的影響，確立最佳反應(yīng)體系，獲得條帶清晰、信號強(qiáng)度均一的DNA甲基化圖譜，為今后開展日本落葉松表觀遺傳變異研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 DNA 提取、酶切、連接以及預(yù)擴(kuò)增

試驗(yàn)材料為16年生日本落葉松1.3米胸徑處未成熟木質(zhì)部(圖1)，采集于湖北省建始縣長嶺崗林場日本落葉松原生種源試驗(yàn)林，該試驗(yàn)林包括草津、淺間、富士、伊那、日光以及松本六個種源。隨機(jī)選取草津種源中的一株作為本研究的試驗(yàn)材料。采用DNeasy Plant Mini 試劑盒(Qiagen，德國) 提取總DNA，使用NanoDrop8000分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度與質(zhì)量。DNA質(zhì)量應(yīng)滿足：1)1.8

圖1 試驗(yàn)樣品采集示意圖Fig.1 The presentation of test sample collecting

用10 U同裂酶MspI和HpaII分別與10 UEcoR I(NEB，美國)組合酶切基因組DNA，37°C 酶切12 h。EcoR I/HpaII組合的酶切產(chǎn)物80°C失活20 min，EcoR I/MspI酶切產(chǎn)物65°C失活20 min。通過T4 DNA連接酶連上接頭，連接體系為：2 μL 10×T4 DNA 連接酶Buffer, 10 μL酶切產(chǎn)物, 1μL T4 DNA 酶(400U·μL-1), 1 μLEcoR I 接頭(5 pmol·μL-1), 1 μLHpaII/MspI接頭(50 pmol·μL-1)，5 μL H2O。16°C 連接16 h，65°C失活20 min(表1)。

預(yù)擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：exTaq10×buffer 2 μL，exTaq DNA聚合酶(U·μL-1) 0.2 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1) 1.6 μL，EcoR I+0預(yù)擴(kuò)增引物0.5 μL，HpaII/MspI+0預(yù)擴(kuò)增引物0.5 μL(表1)，連接產(chǎn)物4 μL，滅菌水11.2 μL，總體積為20 μL。

1.2 選擇性擴(kuò)增體系的優(yōu)化

稀釋20倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用于選擇性擴(kuò)增。選用E3-HM25為選擇性擴(kuò)增引物組合，優(yōu)化DNA模板用量以及引物、Mg2+、dNTP和exTaq DNA聚合酶的濃度，設(shè)置梯度為：1)DNA模板100 ng，200 ng，300 ng以及400 ng； 2)引物0.25 pmol·μL-1，0.5 pmol·μL-1，0.75 pmol·μL-1，1 pmol·μL-1；3)Mg2+1 mmol·L-1，1.5 mmol·L-1，2 mmol·L-1，2.5 mmol·L-1；4)dNTP 0.1 mmol·L-1，0.2 mmol·L-1，0.3 mmol·L-1，0.4 mmol·L-1；5)exTaq DNA聚合酶0.05 U·μL-1，0.125 U·μL-1，0.375 U·μL-1，0.5 U·μL-1。利用E3-HM13、E3-HM33以及E8-HM12三對引物來驗(yàn)證優(yōu)化選擇性擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性。

預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增程序均采用呂金輝的方法[10]。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物使用儀器ABI3730進(jìn)行檢測(由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成)，毛細(xì)管電泳圖譜應(yīng)用GenemarkerV2.2.0軟件獲得。

表1 接頭以及引物序列

Table 1 The DNA sequence of adaptors and primers

接頭/引物Adaptors/primers序列Sequences熒光修飾Fluorescentmodification接頭AdaptorsEcoRI-adapterFCTCGTAGACTGCGTACC無EcoRI-adapterRAATTGGTACGCAGTCTAC無HpaII/MspI-adapterFGACGATGAGTCTCGAT無HpaII/MspI-adapterRCGATCGAGACTCAT無預(yù)擴(kuò)Pre-amplificationEcoRI+0GACTGCGTACCAATTC無HpaII/MspI+0ATGAGTCTCGATCGG無選擴(kuò)SelectiveamplificationE3-AACGACTGCGTACCAATTCAAC5’-FAME8-ACCGACTGCGTACCAATTCACC5’-FAMH/M13-CAAATGAGTCTCGATCGGCAA無H/M12-CATATGAGTCTCGATCGGCAT無H/M25-AGTATGAGTCTCGATCGGAGT無H/M33-CTTATGAGTCTCGATCGGCTT無

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板用量對毛細(xì)管電泳結(jié)果的影響

模板DNA用量對毛細(xì)管電泳結(jié)果影響不明顯。由圖2可知，四種DNA模板用量(100 ng、200 ng、300 ng以及400 ng)得到毛細(xì)管電泳圖譜在信號強(qiáng)度、信號均一性和雜峰干擾程度等方面沒有顯著差別。為了減少模板DNA的使用量，選擇DNA模板用量為100 ng。

2.2 引物濃度對毛細(xì)管電泳結(jié)果的影響

引物濃度是影響毛細(xì)管電泳結(jié)果的關(guān)鍵因素(圖3)，濃度過高時，片段的數(shù)量明顯減少。引物濃度0.25 pmol·μL-1、0.5 pmol·μL-1和0.75 pmol·μL-1的毛細(xì)管電泳結(jié)果相似，但以0.75 pmol·μL-1時毛細(xì)管電泳的信號強(qiáng)度最高；而當(dāng)引物濃度為1 pmol·μL-1時EcoR I/HpaII酶組合及EcoR I/MspI酶組合毛細(xì)管電泳結(jié)果雖然在200 bp和400 bp的主峰信號強(qiáng)度很強(qiáng)，但在400～600 bp片段的信號強(qiáng)度卻非常弱。因此，最適引物濃度為0.75 pmol·μL-1。

H代表EcoR I/Hpa II酶切組合的毛細(xì)管電泳結(jié)果；M代表EcoR I/Msp I酶切組合的毛細(xì)管電泳結(jié)果(下同)，Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ和Ⅳ分別代表DNA模板量為100 ng、200 ng、300 ng以及400 ng時的毛細(xì)管電泳結(jié)果。H represented the results of capillary electrophoresis by the endonuclease combination of EcoR I and Hpa II and M represented the results of capillary electrophoresis by the endonuclease combination of EcoR I and Msp I, which were the same meanings in the following figures; Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ stood for the results of capillary electrophoresis for 100 ng, 200 ng, 300 ng and 400 ng DNA template. 圖2 不同DNA模板用量的毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig. 2 The results of capillary electrophoresis for different DNA template usage

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別代表引物濃度為0.25 pmol·μL-1， 0.5 pmol·μL-1，0.75 pmol·μL-1，1 pmol·μL-1時的毛細(xì)管電泳結(jié)果。Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ represented the results of capillary electrophoresis for 0.25 pmol·μL-1, 0.5 pmol·μL-1, 0.75 pmol·μL-1,1 pmol·μL-1 primer concentration respectively.圖3 不同引物濃度的毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig. 3 The results of capillary electrophoresis for different primer concentration

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別代表Mg2+濃度為1 mmol·L-1，1.5 mmol·L-1，2 mmol·L-1，2.5 mmol·L-1時的毛細(xì)管電泳結(jié)果。Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ represented the results of capillary electrophoresis for 1 mmol·L-1, 1.5 mmol·L-1, 2 mmol·L-1, 2.5 mmol·L-1 Mg2+ concentration respectively.圖4 不同Mg2+ 濃度的毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig.4 The results of capillary electrophoresis for different Mg2+ concentration

2.3 Mg2+濃度對熒光檢測結(jié)果的影響

選擇性擴(kuò)增體系中Mg2+濃度是影響毛細(xì)管電泳結(jié)果的關(guān)鍵因素(圖4)。當(dāng)Mg2+濃度為1 mmol·L-1時，EcoR I/HpaII酶組合及EcoR I/MspI酶組合的毛細(xì)管電泳結(jié)果主要集中在幾個主帶上；而當(dāng)Mg2+濃度為2.5 mmol·L-1時，EcoR I/HpaII酶組合在400 bp的一個主峰信號很強(qiáng)，其余信號相對較弱，EcoR I/MspI酶組合雜峰相對較多；當(dāng)Mg2+濃度為1.5 mmol·L-1或2 mmol·L-1時，均獲得了非常理想的毛細(xì)管電泳結(jié)果，雜峰少，信號響度均一?？梢?，Mg2+濃度在1.5 mmol·L-1和2 mmol·L-1時毛細(xì)管電泳的效果最佳。

2.4 dNTP濃度對毛細(xì)管電泳結(jié)果的影響

選擇性擴(kuò)增體系中dNTP濃度是影響毛細(xì)管電泳結(jié)果的關(guān)鍵因素(圖5)。當(dāng)dNTP濃度為0.1 mmol·L-1時，EcoR I/HpaII酶組合及EcoR I/MspI酶組合的毛細(xì)管電泳結(jié)果均在兩個主峰處表現(xiàn)出很強(qiáng)的信號值，其它信號峰很弱；當(dāng)dNTP濃度為0.2 mmol·L-1時，EcoR I/MspI酶組合仍然表現(xiàn)在兩個主峰處信號很強(qiáng)，其它信號峰很弱；當(dāng)dNTP濃度為0.3 mmol·L-1及0.4 mmol·L-1時毛細(xì)管電泳的效果有了明顯的提升，信號值均一，雜峰較少。可見，選擇性擴(kuò)增體系中的dNTP濃度在0.3 mmol·L-1和0.4 mmol·L-1時具有最佳的毛細(xì)管電泳效果。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別代表dNTP濃度為0.1 mmol·L-1, 0.2 mmol·L-1, 0.3 mmol·L-1 0.4 mmol·L-1時的毛細(xì)管電泳結(jié)果。Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ represented the results of capillary electrophoresis for 0.1 mmol·L-1, 0.2 mmol·L-1, 0.3 mmol·L-1, 0.4 mmol·L-1 dNTP concentration respectively.圖5 不同dNTP濃度的毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig. 5 The results of capillary electrophoresis for different dNTP concentration

2.5 exTaq DNA聚合酶濃度對毛細(xì)管電泳結(jié)果的影響

與普通Taq DNA聚合酶相比，雖然exTaq DNA聚合酶穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性更高，但其成本也相對高很多。四種exTaq DNA聚合酶濃度的毛細(xì)管電泳結(jié)果(圖6)，在信號強(qiáng)度的均一性、雜峰程度上沒有顯著差異。四種exTaq酶濃度獲得的EcoR I/HpaII酶組合的毛細(xì)管電泳的信號強(qiáng)度是一致的，但EcoR I/MspI酶組合的毛細(xì)管電泳的信號強(qiáng)度表現(xiàn)出隨濃度的增加而降低的趨勢。出于成本的考量，最終選定exTaq酶濃度為0.05 U·μL-1。

2.6 選擇性擴(kuò)增體系的確立與驗(yàn)證

綜上所述，本研究初步確立了基于毛細(xì)管電泳的MSAP反應(yīng)體系：DNA模板用量100 ng，引物 0.75 pmol·μL-1，Mg2+1.5～2.0 mmol·L-1，dNTP 0.3～0.4 mmol·L-1，exTaq DNA聚合酶0.05 U·μL-1。為了進(jìn)一步優(yōu)化體系，又在1.5～2 mmol·L-1和dNTP 0.3～0.4 mmol·L-1之間設(shè)置了五個梯度，兩兩組合，檢測了相應(yīng)組合獲得的毛細(xì)管電泳結(jié)果的質(zhì)量。結(jié)果表明，Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTP 0.375 mmol·L-1的組合具有最佳的條帶擴(kuò)增效果(圖7)。選擇三對選擇性擴(kuò)增引物(表1)，對優(yōu)化后選擇性擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。由圖8可知，三對引物均獲得了亮度清晰、信號較強(qiáng)且相對均一、雜峰較少的毛細(xì)管電泳圖譜，表明所建的反應(yīng)體系穩(wěn)定性較高。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別代表exTaq DNA聚合酶濃度為0.05 U·L-1, 0.125 U·L-1, 0.375 U·L-1, 0.5 U·L-1時的毛細(xì)管電泳結(jié)果。Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ represented the results of capillary electrophoresis for 0.05 U·L-1, 0.125 U·L-1, 0.375 U·L-1, 0.5 U·L-1 exTaq DNA polymerase concentration respectively.圖6 不同exTaq DNA聚合酶濃度的毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig. 6 The results of capillary electrophoresis for different exTaq DNA polymerase concentration

圖7 優(yōu)化后的毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig. 7 The results of capillary electrophoresis for optimized systems

EX-HMX-H/M中EX-HMX代表選擇性擴(kuò)增使用的引物組合The ‘EX-HMX’ in the presentation of ‘EX-HMX-H/M’ presented the primer combinations in selective amplification.圖8 優(yōu)化體系穩(wěn)定性驗(yàn)證Fig.8 The verification for the optimized systems

3 討論

開展DNA甲基化研究對于解析表型變異的表觀遺傳機(jī)理具有重要意義[11-13]。MSAP檢測技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的DNA甲基化檢測技術(shù)[14]。相對于高通量的DNA甲基化檢測方法，MSAP檢測技術(shù)具有成本低，操作簡單以及無需已經(jīng)參考基因組的特點(diǎn)?；诿?xì)管電泳的MSAP檢測技術(shù)較傳統(tǒng)基于聚丙烯酰胺凝膠電泳的MSAP檢測技術(shù)而言，省去了大量的制膠、跑板、染色、顯影以及讀帶等繁瑣的過程，極大地縮短了DNA甲基化檢測的時間，顯著地提高了效率，便于開展大樣本的表觀遺傳變異研究，并且能夠更加靈敏地識別濃度很低的擴(kuò)增片段。本研究綜合考慮了影響毛細(xì)管電泳擴(kuò)增效果的多個因素，確立了基于毛細(xì)管電泳的日本落葉松MSAP技術(shù)最佳反應(yīng)體系，為大批量分析日本落葉松DNA甲基化奠定了基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)Mg2+及dNTP濃度是影響毛細(xì)管電泳結(jié)果最為關(guān)鍵的因素，濃度過低或過高均會導(dǎo)致毛細(xì)管電泳圖譜條帶明顯減少，雜峰數(shù)量顯著增多。該結(jié)果與宋春艷[15]、呂金輝[10]基于毛細(xì)管電泳的AFLP條件優(yōu)化結(jié)果一致，同時也與李金龍[16]在北京油雞中報(bào)道一致：Mg2+最佳濃度為1.25 mmol·L-1，濃度過低條帶較少，過高時雜峰比較多；dNTP最佳濃度為 0.15 mmol·L-1，濃度過高使得條帶減少。本研究最佳反應(yīng)體系中Mg2+濃度為2 mmol·L-1，dNTP濃度為0.375 mmol·L-1，這可能是由于物種不同，酶切獲得的片段多少不同造成的。

引物濃度也是影響毛細(xì)管電泳結(jié)果的重要因素，當(dāng)引物濃度為1 pmol·μL-1時，毛細(xì)管圖譜的信號會集中在幾個主峰上。呂金輝[10]和李金龍[16]研究發(fā)現(xiàn)引物濃度是影響毛細(xì)管電泳結(jié)果的關(guān)鍵因素，過高會造成非特異性擴(kuò)增，過低會造成片段的缺失。

DNA模板用量和exTaq DNA聚合酶濃度對毛細(xì)管電泳結(jié)果影響較小。為了降低成本，選定DNA模板用量100 ng和exTaq DNA聚合酶濃度0.05 U·μL-1為最佳配置，可獲得較好的條帶擴(kuò)增效果。呂金輝[10]認(rèn)為DNA模板用量會影響基于毛細(xì)管電泳的AFLP結(jié)果。我們推測差異的原因可能在于物種的差異或者是DNA模板用量梯度差異設(shè)置造成的。同時，呂金輝[10]也發(fā)現(xiàn)exTaq DNA聚合酶的使用量不是影響毛細(xì)管電泳結(jié)果的關(guān)鍵因素，這與我們的結(jié)果是一致的。

4 結(jié)論

本文以日本落葉松未成熟木質(zhì)部為試材，探索不同DNA模板用量及選擇擴(kuò)增體系中引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度和exTaq DNA聚合酶濃度等因素對毛細(xì)管電泳效果的影響，從而確立最適的MSAP反應(yīng)體系。結(jié)果表明，DNA模板以及exTaq DNA聚合酶的用量對毛細(xì)管電泳結(jié)果的影響不明顯，過高的引物濃度會減少擴(kuò)增的條帶數(shù)目，過低或過高的Mg2+和dNTP濃度會導(dǎo)致毛細(xì)管電泳圖譜條帶明顯減少，雜峰顯著增多。最終確立了最佳反應(yīng)體系為：DNA 模板100 ng，引物0.75 pmol·μL-1，Mg2+2 mmol·L-1，dNTP 0.375 mmol·L-1和exTaq DNA聚合酶 0.05 U·μL-1。通過三對選擇性擴(kuò)增引物的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)表明，該體系可獲得亮度清晰、信號較強(qiáng)且強(qiáng)度相對均一以及雜峰較少的毛細(xì)管電泳圖譜。本文首次建立了基于毛細(xì)管電泳的日本落葉松最佳MSAP反應(yīng)體系，為今后開展日本落葉松表觀遺傳變異相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

[1] 譚建新, 孫玉潔. 表觀基因組學(xué)研究方法進(jìn)展與評價[J]. 遺傳, 2009, 31(1):3-12.

[2] Cokus SJ, Feng S, Zhang X,etal. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning[J]. Nature, 2008, 452(7184):215-219.

[3] Yang H, Chang F, You C,etal. Whole-genome DNA methylation patterns and complex associations with gene structure and expression during flower development in Arabidopsis[J]. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology, 2015, 81(2):268-281.

[4] Xing MQ, Zhang YJ, Zhou SR,etal. Global Analysis Reveals the Crucial Roles of DNA Methylation during Rice Seed Development[J]. Plant Physiology, 2015, 168(4):1417-1432.

[5] Lira-Medeiros CF, Parisod C, Fernandes RA,etal. Epigenetic variation in mangrove plants occurring in contrasting natural environment[J]. PloS One, 2010, 5(4):e10326.

[6] 沈 圣, 屈彥純, 張 軍. 下一代測序技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的重要應(yīng)用及進(jìn)展[J]. 遺傳, 2014, 36(3):256-275.

[7] Schulz B, Eckstein RL, Durka W. Scoring and analysis of methylation-sensitive amplification polymorphisms for epigenetic population studies[J]. Molecular Ecology Resources, 2013, 13(4):642-653.

[8] Lai M, Sun X, Chen D,etal. Age-related trends in genetic parameters for Larix kaempferi and their implications for early selection[J]. BMC Genetics, 2014, 15 Suppl 1:S10.

[9] Li A, Song W-Q, Chen C-B,etal. DNA methylation status is associated with the formation of heterosis in Larix kaempferi intraspecific hybrids[J]. Molecular Breeding, 2013, 31(2):463-475.

[10] 呂金輝, 胡建軍, 盧孟柱. 基于毛細(xì)管電泳的柳樹 AFLP 分子標(biāo)記研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(1):51-57.

[11] Ci D, Song Y, Du Q,etal. Variation in genomic methylation in natural populations of Populus simonii is associated with leaf shape and photosynthetic traits[J]. Journal of Experimental Botany, 2016, 67(3):723-737.

[12] Latzel V, Allan E, Bortolini Silveira A,etal. Epigenetic diversity increases the productivity and stability of plant populations[J]. Nature Communications, 2013, 4:2875.

[13] Medrano M, Herrera CM, Bazaga P. Epigenetic variation predicts regional and local intraspecific functional diversity in a perennial herb[J]. Molecular Ecology, 2014, 23(20):4926-4938.

[14] Alonso C, Pérez R, Bazaga P,etal. MSAP markers and global cytosine methylation in plants: a literature survey and comparative analysis for a wild growing species[J]. Molecular Ecology Resources, 2016, 16(1):80-90.

[15] 宋春艷, 楚 鷹, 陳明杰, 等. 基于 CEQ 遺傳分析儀的 AFLP 條件的優(yōu)化試驗(yàn)[J]. 食用菌, 2006, 28(3):14-15.

[16] 李金龍, 唐韶青, 鄒智元, 等. 北京油雞 MSAP 毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù)的建立[J]. 遺傳, 2014, 36(5):495-502.

(責(zé)任編輯：張 研)

Establishment ofLarixkaempferiMSAP System Based on Capillary Electrophoresis

DIAO Shu, SUN Chao, SUN Xiao-mei, ZHANG Shou-gong

(Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Beijing 100091, China)

[Objective]This study aims at constructing the excellent reaction system of MSAP technology and obtaining DNA methylation maps with clear bands and uniform signal intensity, so as to provide references for the study on genetic variation ofLarixkaempferiin the future.[Method] Taking immature xylem as experimental materials, the impact of five factors (dosage of DNA template, concentration of primers, Mg2+, dNTP and exTaq DNA polymerase) on the result of capillary electrophoresis was investigated. [Result] It was found that different concentrations of DNA template and the exTaq DNA polymerase did not affect the result of capillary electrophoresis. However, high concentration of primers would lead to sparse fragments in MSAP profile. Mg2+concentration and dNTP concentration were the most important factors which determined the result of capillary electrophoresis. When the concentration of Mg2+/dNTP was unsuitable, the amount of band would significantly decrease, and the amount of impurity peak would significantly increase. [Conclusion] The MASP system determined for capillary electrophoresis inL.kaempferiis: DNA template dosage 100 ng, primers 0.75 pmol·μL-1, Mg2+2 mmol·L-1, dNTP 0.375 mmol·L-1and exTaq DNA polymerase 0.05 U·μL-1. It can be widely used in detecting DNA methylation.

DNA methylation; methylation sensitive amplification polymorphism (MSAP); capillary electrophoresis; system establishment;Larixkaempferi

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.03.001

2016-09-21

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目(20150414)。

刁姝(1987—)，女，博士生，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種。E-mail:diaoshu0802@163.com

* 責(zé)任作者：張守攻(1957—)，研究員，研究方向?yàn)獒樔~樹遺傳改良。Tel:010-62889685;E-mail:larch_rif@163.com

S791.223

A

1001-1498(2017)03-0361-07