鐘傳青，宗工理，張超，付加芳，姜天翼，曹廣祥*

1. 山東建筑大學市政與環(huán)境工程學院，山東 濟南 250101；2. 山東省醫(yī)學科學院山東省醫(yī)藥生物技術研究中心，山東 濟南 250062

畜禽養(yǎng)殖場附近污水中多粘菌素E耐藥性腸桿菌的分離分析及內(nèi)源質(zhì)粒檢測

鐘傳青1，宗工理2，張超1，付加芳2，姜天翼1，曹廣祥2*

1. 山東建筑大學市政與環(huán)境工程學院，山東 濟南 250101；2. 山東省醫(yī)學科學院山東省醫(yī)藥生物技術研究中心，山東 濟南 250062

畜禽養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素引起了廣泛的微生物耐藥性問題，研究抗生素耐藥菌株可以了解環(huán)境中細菌的耐藥性情況和抗性基因的傳播機制。采集畜禽養(yǎng)殖場周邊的污水，分析了污水中多粘菌素E耐藥性細菌和耐藥性腸桿菌的豐度；同時以一株具有較高多粘菌素E耐藥水平的腸桿菌R11為例，首先進行16S rDNA測序和抗生素耐藥譜分析，然后通過質(zhì)粒提取、酶切電泳以及脈沖場凝膠電泳（PFGE），分析其內(nèi)源性質(zhì)粒等情況。結果表明：在畜禽養(yǎng)殖場周邊污水環(huán)境中，多粘菌素E耐藥性細菌占細菌總數(shù)的0.14%~0.35%，多粘菌素E耐藥性腸桿菌占腸桿菌總數(shù)的1.50%~7.40%，而腸桿菌占細菌總數(shù)的1.13%~2.45%，說明腸桿菌可能是攜帶多粘菌素E抗性基因的主要細菌種類，同時也是養(yǎng)殖業(yè)污水中細菌的主要組成部分。16S rDNA序列分析確定R11是一株Enterobacter cloacae，抗生素耐藥譜分析R11具有多重耐藥性，除對林可霉素敏感外，阿米卡星、四環(huán)素和環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度（MICs）為10 μg?mL-1，阿莫西林的MICs為25 μg?mL-1，磺胺甲惡唑的MICs為32 μg?mL-1，氨芐西林的MICs為40 μg?mL-1，鏈霉素的MICs為90 μg?mL-1，而多粘菌素E的MICs最高，達到96 μg?mL-1。質(zhì)粒提取酶切和PFGE分離鑒定結果顯示，R11菌株可能有多個內(nèi)源性質(zhì)粒。綜上所述，R11菌株具有較高水平的多粘菌素E耐藥性，并且具有多重耐藥性和多個內(nèi)源性質(zhì)粒，對于研究多粘菌素E耐藥性機制具有一定的參考價值。

畜禽養(yǎng)殖場；腸桿菌；多粘菌素E；多重耐藥性；質(zhì)粒

微生物的抗生素耐藥性已成為影響病原菌治療效果的重要問題，嚴重危及公眾健康?？股啬退幮晕⑸锲毡榇嬖谟诜侨祟惢顒拥淖匀画h(huán)境中，具有古老的起源（李顯志，2013），但是人類活動特別是抗生素濫用極大地加速了抗生素耐藥性的進化與傳播（Singer et al.，2016）。調(diào)查顯示，2013年中國抗生素總使用量約為16.2×107kg，而畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗生素使用量占到總量的50%以上（Zhang et al.，2015）。許多研究證實不論是在醫(yī)院、動物養(yǎng)殖場、土壤，還是在人體、食品、工業(yè)品，甚至早產(chǎn)兒體內(nèi)都可以分離出耐藥性微生物（Giannino et al.，2009；Spellberg et al.，2011；陶宏兵等，2015），說明抗生素耐藥性已經(jīng)發(fā)展成為無法忽視和回避的問題。

腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細菌是一類與人類關系密切的細菌，在動植物、土壤和水體中廣泛存在。研究表明，腸桿菌科細菌在抗生素耐藥性的轉移和傳播中起著重要的媒介作用（Iredell et al.，2016），位于基因組的抗生素耐藥性基因可以通過溶原性噬菌體、轉座子和整合子進行轉移（Stokes et al.，2011），而位于內(nèi)生質(zhì)粒的耐藥性基因可能通過轉化作用進行水平轉移（Yanat et al.，2017）。與此同時，許多腸桿菌科的細菌還是條件致病菌，這類醫(yī)源性耐藥菌加大了臨床治療的難度（Perez et al.，2013）。本研究分析了山東省濟南市畜禽養(yǎng)殖場周邊環(huán)境中耐藥性細菌的分布，從中分離出一株具有較高水平多粘菌素E耐藥性和多重耐藥性的腸桿菌科細菌，并研究了該菌株的生物學特征，以期為深入研究腸桿菌科細菌的多粘菌素E耐藥機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

樣品1、樣品2、樣品3分別來源于濟南市賈莊生豬和云川蛋雞養(yǎng)殖場的排污溝水。利用無菌吸管采集100 mL水樣放入無菌三角瓶，用帶濾膜的封口膜密封，貯存于4 ℃環(huán)境中。

1.2 培養(yǎng)基

微生物的分離和計數(shù)采用LB培養(yǎng)基和mTEC培養(yǎng)基（Brenner et al.，1993），不加或加入8 μg?mL-1多粘菌素E。mTEC培養(yǎng)基成分為1 L培養(yǎng)基含：蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，乳糖10 g，氯化鈉7.5 g，磷酸氫二加3.3 g，磷酸二氫鉀1 g，十二烷基硫酸鈉0.2 g，去氧膽酸鈉0.1 g，X-Gluc 0.15 g。

1.3 耐藥性細菌的計數(shù)與分離篩選

采用稀釋平板涂布法計算樣品中細菌、腸桿菌科細菌和耐藥性細菌的數(shù)量。樣品用無菌水依次梯度稀釋，涂布到加入8 μg?mL-1多粘菌素E或不加入抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，計數(shù)細菌菌落的數(shù)量。腸桿菌數(shù)量的檢測采用mTEC固體培養(yǎng)基，將上述稀釋樣品涂布到入8 μg?mL-1多粘菌素E或不加入抗生素的mTEC固體培養(yǎng)基平板上，置于44.5 ℃培養(yǎng)箱中2 h殺死部分不耐高溫的非腸桿菌細菌，然后轉入37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，計數(shù)藍色菌落的數(shù)量。上述每個樣品做3個重復，用空白培養(yǎng)基作為對照。同時挑取單菌落到含8 μg?mL-1多粘菌素E的固體平板上，多次劃線傳代分離單菌落，將分離到的菌株進行命名，選取R11菌株進行后續(xù)研究。

1.4 R11菌株的16S rDNA鑒定

用LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)R11菌株，按照QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Germany）說明書提取基因組總DNA。采用通用引物27F 5′-GAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′和1492R 5′-AGAAAGGAGG TGATCCAGCC-3′進行PCR擴增，DNA測序后利用BLAST（NCBI）數(shù)據(jù)庫進行16S rDNA序列的比對。

1.5 R11菌株的抗生素耐藥性研究

本研究選擇畜禽養(yǎng)殖場使用率較高的氨芐西林（ampicillin）、阿莫西林（amoxicillin）、鏈霉素（streptomycin）、阿米卡星（amikacin）、四環(huán)素（tetracyclines）、林可霉素（lincomycin）、磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）和多粘菌素E（polymyxin E）等作為研究對象，分別配制上述各種抗生素母液并稀釋成工作濃度，然后根據(jù)文獻方法（Nordmann et al.，2016）測定R11菌株對上述各種抗生素的最小抑菌濃度（MICs）。

1.6 R11菌株的質(zhì)粒分析

采用堿裂解法提取R11菌株的質(zhì)粒（薩姆布魯克等，2001），利用限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切后進行常規(guī)的瓊脂糖電泳分離，檢測R11菌株是否含有內(nèi)源性質(zhì)粒。同時將培養(yǎng)好的R11菌體包埋到瓊脂糖凝膠中，SDS破壁后用蛋白酶K去除菌體蛋白，然后將含DNA的瓊脂糖塊置于脈沖場凝膠電泳（PFGE）分離膠中，采用PFGE電泳儀（CHEF Mapper，Bio-rad）進行檢測，設置分離片段大小為10~600 kb，檢測條件采用默認參數(shù)，檢測R11菌株中內(nèi)源性質(zhì)粒。試驗采用不含內(nèi)源性質(zhì)粒的Escherichia.coli DH5a菌株作為對照。

2 結果與討論

2.1 畜禽養(yǎng)殖場污水中耐藥性細菌的分析

平板菌落計數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)污水樣品中細菌數(shù)量分別達到2.2×106、8.1×106和4.8×105cfu?mL-1，多粘菌素E耐藥性細菌數(shù)量分別為3.1×102、2.9×103和1.4×102cfu?mL-1（表1），結果顯示耐藥性細菌占總細菌數(shù)的0.14%~0.35%，表明養(yǎng)殖場周圍污水中存在大量的多粘菌素E耐藥性細菌。樣品中腸桿菌數(shù)量分析顯示，腸桿菌占細菌總數(shù)的1.13%~2.45%，說明腸桿菌是污水中一類主要的細菌群體。與此同時，多粘菌素E耐藥性腸桿菌數(shù)量占腸桿菌總數(shù)的1.50%~7.40%，明顯高于耐藥性細菌占細菌總數(shù)的比例，說明腸桿菌在細菌耐藥性中占據(jù)重要的地位，可能是攜帶抗生素耐藥性基因的主要細菌種類。研究表明，醫(yī)源性耐藥菌中腸桿菌占一定比例（Potter et al.，2016），由于腸桿菌是條件致病菌，在養(yǎng)殖場排放污水中檢出的大量耐藥性腸桿菌可能威脅人類健康。

表1 耐藥性細菌和腸桿菌數(shù)量與比例分析Table 1 Analysis on quantity and proportion of antibiotic-tolerant bacteria and Enterobacteria cfu?mL-1

2.2 R11菌株的分離與16S rDNA鑒定

從上述含抗生素固體平板上挑取菌落，多次劃線傳代、分離單菌落并編號，最后得到一株具有穩(wěn)定的多粘菌素E抗性菌株，命名為R11菌株。R11菌株在LB固體培養(yǎng)基呈濕潤、微微凸起、乳白色、邊緣光滑的圓形菌落，可以在28~44.5 ℃范圍內(nèi)生長，說明R11可能屬于腸桿菌科細菌。

R11菌株的16S rDNA鑒定以基因組總DNA為模板，通過PCR擴增得到16S rDNA片段，構建到中間載體后進行DNA測序。利用NCBI Blast程序對測序結果進行比對，結果顯示R11菌株的16S rDNA序列與Enterobacter cloacae DSM 16690的相似度達到99%，結合R11菌株的表型特征，認為R11菌株可能是Enterobacter cloacae。

2.3 R11菌株的抗生素耐藥性分析

研究進一步測定了R11的抗生素耐藥性抗性譜和MICs，R11菌株的耐藥譜和最小抑菌濃度見表2。結果顯示，R11菌株具有多重耐藥性，除氯霉素外，其對其他供試的抗生素都有明顯耐藥性，說明R11菌株可能擁有多種抗生素耐藥基因。此外，R11菌株具有較高水平的多粘菌素E耐藥性。多粘菌素E曾經(jīng)被認為是臨床上治療抗生素耐藥性病原菌感染的最后一條防線（Falagas et al.，2005），但是由于多粘菌素被大量應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，在世界各地的不同環(huán)境甚至在病人感染部位中都已經(jīng)分離出多粘菌素的耐藥菌，引起公眾的擔憂（Vanduin et al.，2015；Rapoport et al.，2016）。分析顯示，R11菌株多粘菌素E的MICs達到96 μg?mL-1，在從中國不同環(huán)境中分離到的耐藥菌株中屬于較高的水平（Liu et al.，2016），對于研究多粘菌素耐藥機制具有一定的參考價值。

表2 R11菌株的多種抗生素MICs分析Table 2 MICs analysis of strain R11 on different antibiotics μg?mL-1

2.4 R11菌株的內(nèi)生質(zhì)粒檢測

微生物的大部分抗生素耐藥性基因位于基因組上，部分位于質(zhì)粒中，并可以通過質(zhì)粒轉移到其他微生物或菌株中。試驗首先用堿裂解法提取R11菌株的質(zhì)粒（圖1），DNA電泳顯示樣品存在多條DNA條帶。為了判斷這些DNA條帶是否是提取過程中裂解形成的染色體斷裂條帶，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I對上述DNA樣品進行酶切處理，然后進行DNA電泳分析。結果顯示，DNA經(jīng)酶切后產(chǎn)生多條特異性條帶，而細菌基因組由于具有多個EcoR I限制性酶切位點，經(jīng)酶切后通常會產(chǎn)生數(shù)百個DNA片段，從而出現(xiàn)彌散型條帶，這說明通過堿裂解法能夠從R11菌株中提取內(nèi)源性質(zhì)粒，而且質(zhì)粒可能不止一個。

圖1 R11菌株中質(zhì)粒的提取和酶切電泳分析Fig. 1 Analysis on extraction and digestion of plasmids in strain R11

為了進一步鑒定R11菌株的質(zhì)粒，試驗將R11菌體和不含質(zhì)粒的E. coli DH5a菌體包埋在瓊脂糖凝膠中，然后利用蛋白酶K降解去除菌體蛋白，最后用PFGE電泳分離瓊脂糖凝膠中的基因組DNA和質(zhì)粒DNA，結果如圖2所示。結果顯示，R11菌株和陰性對照E. coli DH5a菌株都有一條大約600 kb的染色體斷裂條帶；與此同時，R11菌株中有多個比較模糊的特征DNA條帶，如圖2中箭頭所示，而DH5a樣品中沒有特征性DNA條帶，這說明這些特征條帶不是由染色體斷裂產(chǎn)生的。因此，可以肯定R11菌株存在質(zhì)粒DNA。另外，由于質(zhì)?？赡艽嬖诙喾N天然構象，不同構象質(zhì)粒的電泳遷移速率各不相同，無法根據(jù)PFGE結果判斷樣品中質(zhì)粒具體數(shù)量和大?。∕arasini et al.，2014），但是根據(jù)PFGE電泳結果可以確定R11菌株具有多個質(zhì)粒，而且部分質(zhì)粒屬于大質(zhì)粒。多粘菌素耐藥基因最早被發(fā)現(xiàn)于基因組上，但是最新研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒也可能編碼多粘菌素耐藥基因（Fernández et al.，2013；Srinivasan et al.，2014），說明細菌可能有多種對抗多粘菌素的機制。本研究分離的R11菌株擁有多個質(zhì)粒，并且具有較高水平的多粘菌素耐藥性，因此值得進一步研究其多粘菌素的耐藥機制。

圖2 R11菌株中質(zhì)粒的PFGE電泳分析Fig. 2 PFGE analysis of plasmids in strain R11

3 結論

本研究從濟南市周邊的生豬和蛋雞養(yǎng)殖場附近的污水溝中取樣，研究發(fā)現(xiàn)耐藥腸桿菌占總細菌數(shù)的0.14%~0.35%，占腸桿菌總數(shù)的1.50%~7.40%，說明腸桿菌可能在細菌耐藥性中占據(jù)重要地位，可能是攜帶抗生素耐藥性基因的主要細菌種類。通過分離純化得到一株腸桿菌屬菌株R11，研究表明該菌株具有多重耐藥性，并且具有較高水平的多粘菌素E耐藥性。采用堿裂解法提取質(zhì)粒和PFGE分析，結果顯示R11菌株具有多個質(zhì)粒，可能與該菌株具有多種耐藥性有關，R11菌株的多重耐藥性基因定位在染色體上還是質(zhì)粒上值得進一步研究。

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ZHONG Chuanqing, ZONG Gongli, ZHANG Chao, FU Jiafang, JIANG Tianyi, CAO Guangxiang. 2017.

Isolation and Characterization of the Polymyxin E Resistant Enterobacteria from Sewage Water near Livestock and Poultry Feedlot

ZHONG Chuanqing1, ZONG Gongli2, ZHANG Chao1, FU Jiafang2, JIANG Tianyi1, CAO Guangxiang2*
1. School of Municipal and Environmental Engineering, Shandong Jianzhu University, Jinan 250101, China;
2. Shandong Medicinal Biotechnology Centre, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China

Overuse of antibiotics in livestock and poultry feedlot has caused broad antibiotics resistance of microbes. Research on antibiotics-resistant microbes is helpful to reveal the status of antibiotics resistance and the transmission mechanism of antibiotics-resistant genes in the environment. In this study, samples were collected from sewage water near livestock and poultry feedlot, the abundance of both antibiotics-resistant bacteria and antibiotics-resistant Enterobacteria was analyzed, in the meantime, strain R11 with high polymyxin E resistance was isolated and studied. Firstly, 16S rDNA of strain R11was sequenced and antibiotics-resistance was analyzed, plasmids were extracted and digested with restriction enzyme, and then PFGE was used to detect the endogenous plasmids. Results showed that polymyxin E-resistant bacteria accounted for 0.14%~0.35% of all bacteria and polymyxin E-resistant Enterobacteria accounted for 1.50%~7.40% of all Enterobacteria. In addition, Enterobacteria occupied 1.13%~2.45% of all the bacteria, which showed that Enterobacteria may be the vital bacteria with polymyxin E resistance, and also occupied large amounts of bacteria in sewage water near livestock and poultry feedlot. Strain R11 was identified as Enterobacter cloacae by 16S rDNA sequence analysis. Strain R11 has multi-antibiotics resistance, which was only sensitive to lincomycin. The MICs of amikacin, tetracycline and ciprofloxacin of strain R11 were 10 μg?mL-1, while the MICs of amoxicillin, sulfamethoxazole, ampicillin, streptomycin, polymyxin E was 25 μg?mL-1, 32 μg?mL-1, 40 μg?mL-1, 90 μg?mL-1and 96 μg?mL-1, respectively. In addition, strain R11 carried several endogenous plasmids. All the results showed that strain R11 had a high level of polymyxin E resistance, and it was useful to study the mechanism of polymyxin E resistance in microbes.

swine feedlot; Enterobacteria; polymyxin E; multi-antibiotics resistance; plasmid

10.16258/j.cnki.1674-5906.2017.04.018

X171.5

A

1674-5906（2017）04-0671-05

鐘傳青, 宗工理, 張超, 付加芳, 姜天翼, 曹廣祥. 2017. 畜禽養(yǎng)殖場附近污水中多粘菌素E耐藥性腸桿菌的分離分析及內(nèi)源質(zhì)粒檢測[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 26(4): 671-675.

國家自然科學基金項目（31500094）；山東省自然科學基金項目（ZR2015EM018）；山東省醫(yī)學科學院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程項目（201604）

鐘傳青（1977年生），女，副教授，博士，主要從事環(huán)境微生物研究。E-mail: zhongchq@163.com

*通信作者

2017-03-16