戴超輝，吳嘉韻，孫 麗，吳圣龍,2，包文斌,2*

（1. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省種豬繁育和健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

大腸桿菌刺激豬腸上皮細(xì)胞后Nramp1基因的表達(dá)變化分析

戴超輝1，吳嘉韻1，孫 麗1，吳圣龍1,2，包文斌1,2*

（1. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省種豬繁育和健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

豬天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白基因1（Naturalresistance-associated Marophage Protein 1， Nramp1）作為影響抗病力的重要候選基因之一，在機(jī)體的免疫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。為了在細(xì)胞水平上探討Nramp1基因與引起仔豬腹瀉的致病性大腸桿菌的關(guān)系及其在大腸桿菌感染過程中發(fā)揮的免疫調(diào)控作用，本研究利用F18ab、F18ac和K88ac等3種致病性大腸桿菌刺激體外培養(yǎng)的豬腸上皮細(xì)胞IPEC-J2，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3種菌體刺激IPEC-J2后Nramp1基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明：F18ab、F18ac和K88ac 3種大腸桿菌刺激IPEC-J2后，Nramp1基因的表達(dá)均發(fā)生極顯著（P＜0.01）上調(diào)，差異倍數(shù)分別為10、8、11倍，且F18ab和K88ac 2種菌體刺激后Nramp1基因的表達(dá)上調(diào)程度均極顯著高于F18ac。本研究結(jié)果提示，Nramp1基因的表達(dá)與大腸桿菌的侵染有很大的相關(guān)性，其在大腸桿菌侵襲豬腸道中發(fā)揮了重要的免疫調(diào)控作用。本研究在細(xì)胞水平分析探討了Nramp1基因的表達(dá)與3種致病性大腸桿菌侵襲的關(guān)系，為Nramp1基因在大腸桿菌侵染機(jī)體的過程中發(fā)揮的免疫調(diào)控作用研究提供了參考依據(jù)。

豬；大腸桿菌；Nramp1基因；抗病育種

天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白基因1（Naturalresistance-associated Marophage Protein 1, Nramp1）是天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白家族成員之一，不但能影響動(dòng)物的自身免疫，還與沙門氏菌及多種胞內(nèi)病原微生物的抵抗作用有關(guān)[1-2]。豬的Nramp1基因位于15號(hào)染色體q23-26，其基因組全長約15 kb，共有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子[3]。在目前抗病育種研究中與畜禽疾病相關(guān)的少數(shù)幾個(gè)候選基因中，抗性相關(guān)巨噬蛋白基因Nramp1是與免疫相關(guān)的重要候選基因[4]。大量研究表明豬Nramp1基因的多態(tài)性與免疫功能以及仔豬腹瀉具有顯著的關(guān)聯(lián)[4-7]，加之Nramp1基因保守的序列結(jié)構(gòu)及其對(duì)疾病的抗性的非病原特異性[1,8]，研究探討Nramp1基因與大腸桿菌性仔豬腹瀉抗病力的關(guān)系具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coil, ETEC）是引起初生仔豬和斷奶仔豬腹瀉和水腫病最常見和最重要的病原菌，大腸桿菌性仔豬腹瀉仍然是引起仔豬高發(fā)病率和死亡率最主要的原因之一。先前的研究主要從DNA和mRNA的層面探討Nramp1基因是否對(duì)豬免疫調(diào)控尤其是仔豬腹瀉病發(fā)揮了重要的作用，但是仍需要進(jìn)一步在細(xì)胞水平分析和驗(yàn)證Nramp1基因與產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗性的關(guān)系，因此，本試驗(yàn)利用3種主要致病性產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（F18ab、F18ac和K88ac）刺激體外培養(yǎng)的豬腸上皮細(xì)胞IPEC-J2，模擬大腸桿菌侵襲仔豬腸道的攻毒環(huán)境，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3種菌體刺激IPEC-J2后Nramp1基因的表達(dá)變化情況，分析Nramp1基因的表達(dá)與F18大腸桿菌侵染的關(guān)系，為下一步探討Nramp1基因在機(jī)體抵抗大腸桿菌刺激過程中發(fā)揮的作用提供更加直接的參考與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 豬腸上皮細(xì)胞系（IPEC-J2）由美國賓夕法尼亞大學(xué)惠贈(zèng)；大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院朱國強(qiáng)教授惠贈(zèng)；完全培養(yǎng)液DMEM-F12培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco（美國）；PBS磷酸緩沖液（干粉）購自北京賽因坦科技有限公司（中國，北京）；Trizol裂解液購自Invitrogen（美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司（中國，南京）。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成 Nramp1基因引物設(shè)計(jì)參照GenBank數(shù)據(jù)庫中Nramp1基因序列（NC_010457.4），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，為避免基因組DNA污染，引物跨外顯子設(shè)計(jì)；以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息如表1所示。

1.3 大腸桿菌侵染IPEC-J2細(xì)胞 將IPEC-J2細(xì)胞以1×106/孔的密度接種到12孔板中，用含10%胎牛血清FBS的DMEM-F12完全培養(yǎng)液在37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至密度達(dá)到90%左右；分別接種大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac 至LB培養(yǎng)液中，在恒溫?fù)u床中37℃，200 r/min搖菌12 h，然后4000 r/min離心10 min收集菌體，PBS緩沖液重懸洗滌并離心，重復(fù)3次。用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)菌稀釋至1.0×109CFU/mL，向12孔培養(yǎng)板中加入1.0 mL細(xì)菌懸液，每種菌體刺激處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置未經(jīng)細(xì)菌刺激的對(duì)照孔，于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱孵育4 h后收集細(xì)胞用于提取總RNA。

表1 Real-time PCR引物

1.4 細(xì)胞總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用Trizol法提取各孔板細(xì)胞總RNA，提取步驟嚴(yán)格按照Trizol Reagent說明書操作，并以1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整程度，使用ND-1000核酸/蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定濃度及純度，-70℃保存?zhèn)溆?。以RNA為模板進(jìn)行cDNA合成：10 μL的反應(yīng)體系中含5×qRT SuperMix II 2 μL，總RNA 500 ng，RNase free ddH2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件為25℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA 2.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2× SYBR Premix ExTapTMII 10 μL，50× ROX Reference Dye II 0.4 μL，RNase free ddH2O補(bǔ)足至總體積20 μL，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；為了分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，在PCR擴(kuò)增結(jié)束后采集多個(gè)信息點(diǎn)，進(jìn)行熔解曲線的分析，具體程序?yàn)?5℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 相對(duì)定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法[9]進(jìn)行分析處理，并利用SPSS17.0軟件一般線性模型（General linear model, GLM）的Univariate統(tǒng)計(jì)方法分析不同菌體刺激的差異顯著性，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

圖1 總RNA提取1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA的純度與完整性檢測(cè) 如圖1所示，28S、18S、5S共3條帶，無DNA污染條帶及明顯降解，NanoDrop ND-1000核酸/蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度，樣本的A260/A280為1.8～1.9，說明RNA提取的完整性和純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線與熔解曲線 由圖2-A和圖2-B可知，Nramp1基因成功實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，且qPCR產(chǎn)物只有1個(gè)特異峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物生成。

2. 3 Nramp1基因在大腸桿菌刺激IPEC-J2后的表達(dá)變化水平 以未經(jīng)細(xì)菌刺激的對(duì)照組細(xì)胞中Nramp1基因的平均表達(dá)水平為參照1，對(duì)3種大腸桿菌刺激處理的細(xì)胞中Nramp1基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行均一化處理。由圖3可知，3種大腸桿菌刺激IPEC-J2后，Nramp1基因表達(dá)水平均發(fā)生極顯著上調(diào)（P ＜0.01），差異倍數(shù)分別為10、8、11倍；并且不同細(xì)菌刺激后Nramp1基因表達(dá)水平上調(diào)的程度存在差異，F(xiàn)18ab和K88ac2種菌體刺激后Nramp1基因表達(dá)水平上調(diào)的程度要極顯著高于F18ac菌體刺激后的表達(dá)水平。

圖2Nramp1基因qPCR產(chǎn)物在不同組織中的擴(kuò)增曲線(A)和熔解曲線(B)

圖3 F18ab、F18ac和K88ac菌體刺激細(xì)胞后Nramp1基因的表達(dá)水平

3 討 論

本研究通過3種致病性大腸桿菌刺激體外培養(yǎng)的豬腸上皮細(xì)胞IPEC-J2，在細(xì)胞水平上分析探討Nramp1基因的表達(dá)與大腸桿菌侵襲機(jī)體的關(guān)系。結(jié)果顯示，經(jīng)大腸桿菌刺激后的細(xì)胞中Nramp1基因的表達(dá)極顯著高于未經(jīng)大腸桿菌刺激的對(duì)照組細(xì)胞，提示Nramp1基因的表達(dá)與大腸桿菌的侵襲有非常密切的關(guān)系，其在大腸桿菌侵襲仔豬腸道中發(fā)揮了重要的免疫調(diào)控作用；并且F18ab和K88ac 2種菌體刺激引起Nramp1基因表達(dá)上調(diào)的程度均極顯著高于F18ac，這從一定程度上說明了不同種類的大腸桿菌對(duì)機(jī)體的侵襲能力可能存在差異，F(xiàn)18ab和K88ac這2種大腸桿菌對(duì)機(jī)體的侵襲能力要強(qiáng)于F18ac。關(guān)于Nramp1基因的作用機(jī)理，前期已有研究表明，Nramp1蛋白通過轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)菌自身合成防御酶系所必需的金屬離子如Mn2+或 Fe2+等使細(xì)菌無法合成防御酶系而無法生存，從而使動(dòng)物抵抗病原菌侵染[10]。另外，Nramp1轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)離子時(shí)，可通過一系列反應(yīng)產(chǎn)生大量殺滅微生物的活性離子，激活巨噬細(xì)胞在自身免疫疾病和多種傳染性疾病等方面的“多向性效應(yīng)”[11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Nramp1基因在NO生成和促炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[12]。前人的研究結(jié)合本試驗(yàn)初步表明，當(dāng)大腸桿菌侵襲機(jī)體并進(jìn)入機(jī)體后，Nramp1蛋白一方面可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)大腸桿菌自身合成防御酶系所必需的二價(jià)金屬離子來殺滅大腸桿菌，另一方面可能通過激活機(jī)體炎癥信號(hào)通路，增強(qiáng)非特異性免疫效應(yīng)，使機(jī)體抵抗大腸桿菌的侵染從而提高機(jī)體的抗病力。

關(guān)于Nramp1基因與仔豬腹瀉的關(guān)系，目前在DNA和mRNA層面已有相關(guān)研究報(bào)道[4-8]，但是還沒有相關(guān)研究從細(xì)胞水平分析探討Nramp1基因和仔豬腹瀉的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制，本試驗(yàn)創(chuàng)新性地以體外培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞為模型，利用大腸桿菌進(jìn)行活菌侵染試驗(yàn)，模擬體內(nèi)大腸桿菌侵襲腸道組織的攻毒環(huán)境，通過刺激前后細(xì)胞中Nramp1基因的表達(dá)變化來分析探討其在大腸桿菌刺激過程中發(fā)揮的免疫調(diào)控作用，并在細(xì)胞水平證實(shí)Nramp1基因在大腸桿菌刺激過程中確實(shí)發(fā)揮了重要的免疫調(diào)控作用，對(duì)深入研究Nramp1基因與仔豬腹瀉的關(guān)系提供了一定的借鑒和參考。但考慮到離體培養(yǎng)的豬腸上皮細(xì)胞系和機(jī)體腸道組織有所區(qū)別，并不能完全模擬體內(nèi)大腸桿菌侵襲腸道組織的攻毒環(huán)境，所以本研究只能初步說明Nramp1基因的表達(dá)和大腸桿菌的抗性具有密切關(guān)系。為了克服這個(gè)局限性，進(jìn)一步研究Nramp1基因在大腸桿菌刺激過程中的免疫調(diào)控機(jī)制，下一步將利用RNAi及基因敲除結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型制備等手段，在動(dòng)物模型上進(jìn)行大腸桿菌體外攻毒試驗(yàn)，并在群體水平中進(jìn)行系統(tǒng)分析驗(yàn)證，以期為Nramp1基因的功能研究以及有效分子遺傳標(biāo)記的篩選和確定提供指導(dǎo)和依據(jù)。

[1] Blackwell J M. Structure and function of the natural resistance associated macrophage protein(Nramp1), a candidate protein for infections and autoimmune disease susceptibility[J]. Mol Med Today, 1996, 2(5): 205-211.

[2] Tanaka G, Shojima J, Matsushita I, et al. Pulmonary Mycobacterium avium complex infection: Association with Nramp1 ploymorphisms[J]. Eur Respir J, 2007, 30(1): 90-96.

[3] Sun H S,Wang L, Rothschild M F, et al. Mapping of the natural resistance-associated macrophage protein 1 (NRAMP1) gene to pig chromosome 15[J]. Anim Genet, 1998 , 29(2): 138-140.

[4] 吳宏梅, 王立賢, 程篤學(xué), 等. 豬Nramp1基因多態(tài)性與免疫功能的相關(guān)性[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(1): 215-220.

[5] 顧永娟. 豬NRAMP1基因與仔豬腹瀉及其生產(chǎn)性狀關(guān)系的研究[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[6] 劉艷冬, 許厚強(qiáng), 稽辛勤, 等. 香豬Nramp1基因多態(tài)性與仔豬腹瀉的研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(4): 125-127.

[7] 趙生國, 蔡原, 滾雙寶, 等. 豬天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白基因(Nramp1)多態(tài)性及其與仔腹瀉相關(guān)性分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 21(11): 1351-1357.

[8] Govoni G, Gros P. Macrophage NRAMP1 and its role in resistance to microbial infections[J].Inflamm Res, 1998, 47(7): 277-284.

[9] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2? ΔΔCT method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[10] Supek F, Supekova L, Nelson H, et al. A yeast manganese transporter related to the acrophage protein involved inconferring resistance to mycobacteria[J]. P Nati Acad Sci, 1996, 93(10): 5105-5110.

[11] Cellier M F, Courville P, Campion C. Nramp1 phagocyte intracellular metal withdrawal defense[J]. Microbes Infect, 2007, 9(14-15): 1662-1670.

[12] Fritsche G, Nairz M, Werner ER, et al. Nramp1-functionality increases iNOS expression via repression of IL-10 formation[J]. Eur J Immunol, 2008, 38(11): 3060-3067.

Analysis of the Expression Changes of Nramp1 Gene in Pig Intestines Epithelial Cells Stimulated by Escherichia coli

DAI Chao-hui1, WU Jia-yun1, SUN Li1, WU Sheng-long1,2, BAO Wen-bin1,2*
(1.Key Laboratory for Animal Genetics, Breeding, Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province, College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Jiangsu Yangzhou 225009, China; 2. Jiangsu Engineering Research Center for Reproduction and Healthy Breeding of Boar, Jiangsu Yangzhou 225009, China)

Natural-resistance-associated marophage protein 1 (Nramp1), as one of important candidate genes affecting disease resistance,plays an important regulating role in body's immune process. To investigate the relationship between the Nramp1 gene and the invasion of pathogenic Escherichia coli (EPEC) which can cause piglet diarrhea at a cellular level and the immune regulation mechanism of Nramp1 gene in the process of Escherichia coli infection, small intestinal epithelial cells (IPEC-J2) cultured in vitro were stimulated by three kinds of pathogenic E. coli F18ab, F18ac and K88ac in this study. And real-time fluorescent quantitative PCR was used in this study to detect the expression changes of Nramp1 gene in cells stimulated by three kinds of bacteria. The results showed that there were extremely significant up-regulation of the expression of Nramp1 gene in cells stimulated by three kinds of bacteria, whose fold change reached, 10, 8 and 11 respectively(P＜0.01) . At the same time, the up-regulation degree of the expression of Nramp1 gene in cells stimulated by F18ab and K88ac were significantly higher than F18ac. The results suggested that the expression of Nramp1 gene have great relevance with E. coli infection and it played an important immune regulating role in E. coli invading pig’s intestinal tract. This study investigated the relationship between the expression of Nramp1 gene and the invasion of three kinds of pathogenic E. coli at a cellular level, which provided the reference and basis for researching the immune regulation mechanism of Nramp1 gene in the process of E. coli infection.

Pig; Escherichia coli; Nramp1 gene; Resistance breeding

S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-040

2016-09-18；

2016-10-15

江蘇省科技支撐計(jì)劃（BE2015329）；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目（SXGC[2015]326、SXGC[2016]097)）

戴超輝（1993-），女，湖南新化人，碩士生，專業(yè)方向?yàn)樨i抗病育種，E-mail: chdai1993@163.com

* 通訊作者：包文斌（1974-），男，博士，研究員，研究方向?yàn)樨i抗病育種，E-mail: wbbao@yzu.edu.cn