劉 爽，張如民，王曉東，張興進(jìn)，張 浩，宮楓舉，邵 鈺，邵衛(wèi)星，，孫學(xué)強(qiáng)，

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；3. 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450121）

以4單位病毒為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒的最低檢出量

劉 爽1，張如民3，王曉東2，張興進(jìn)2，張 浩2，宮楓舉2，邵 鈺2，邵衛(wèi)星1，2，孫學(xué)強(qiáng)1，2

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；3. 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450121）

本實(shí)驗(yàn)首次以4單位病毒為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定量新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒的最低檢出量，用新城疫病毒LaSota株接種SPF雞胚，制備尿囊液，經(jīng)血凝試驗(yàn)測定滴度為27；將尿囊液倍比稀釋后，提取各稀釋度樣品核酸，用新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果多數(shù)樣品均可檢出特定長度的核酸。用該尿囊液制備4單位病毒為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，倍比稀釋后，提取各稀釋度病毒核酸，對新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒的最低檢出量進(jìn)行定量，結(jié)果表明該試劑盒的最低檢出量為4單位病毒的1:32倍。該方法對于新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒等分子生物學(xué)診斷試劑的研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)量控制和比對具有參考意義。

新城疫病毒；RT-PCR；4單位病毒；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；最低檢出量

新城疫（Newcastle Disease，ND）俗稱亞洲雞瘟、偽雞瘟等，是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的，主要侵害雞等250多種禽類的一種急性、高度接觸性烈性傳染病[1]。ND是世界衛(wèi)生組織（OIE）須通報動物疫病，是我國一類動物疫病，也是《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃》確定的優(yōu)先防治病種之一[2]。ND的初步診斷須根據(jù)現(xiàn)場的主要臨床癥狀和剖檢病理變化做出，然后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測確定為疑似，最后由國家參考實(shí)驗(yàn)室通過病毒分離和鑒定進(jìn)行確診[3]。因此，新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒的最低檢出量對于確定臨床疑似樣品至關(guān)重要。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種基于模板體外擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，至今已發(fā)展到第3代[4]。最初PCR技術(shù)主要在科研領(lǐng)域應(yīng)用，因其特異性強(qiáng)、靈敏度高，以及檢測速度快、高通量等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、獸醫(yī)診斷、水產(chǎn)以及微生物檢測等許多領(lǐng)域。目前關(guān)于NDV的RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測方法的研究報道較多[5-6]，但大多數(shù)研究集中于單一或者多重RT-PCR引物和探針的設(shè)計、PCR體系的配制和優(yōu)化[7-8]，以及臨床樣品的檢測分析和鑒別診斷[9]，也有部分研究對其建立方法的特異性和敏感性進(jìn)行了初步驗(yàn)證。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對于獸醫(yī)診斷制品的生產(chǎn)和質(zhì)量管理意義較大。農(nóng)業(yè)部《獸醫(yī)診斷制品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》對已有國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的采購、自制以及儲存使用等做出了明確要求。同時，該規(guī)范還要求自制無國家標(biāo)準(zhǔn)的工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的，應(yīng)當(dāng)建立制備技術(shù)規(guī)范，必須制定工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及制備、鑒別、檢驗(yàn)等操作規(guī)程[10]。國家和?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)）動物疫病預(yù)防控制中心每年都進(jìn)行獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對，也不同程度開展各種獸醫(yī)診斷制品的比對和篩選工作，從而選出能夠滿足國家動物疫病監(jiān)測工作需要的獸醫(yī)診斷制品[11]。因此，最理想的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)當(dāng)來源穩(wěn)定、制備工藝簡單、質(zhì)量可控、定量準(zhǔn)確。

本試驗(yàn)根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)內(nèi)容，通過NDV血凝試驗(yàn)，制備4單位病毒為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然后對4單位病毒進(jìn)行倍比稀釋，提取病毒核酸。利用相對定量的病毒核酸，對檢測試劑（盒）的最低檢出量進(jìn)行定量。該方法對于新城疫病毒 RT-PCR檢測試劑盒等分子生物學(xué)診斷試劑的研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)量控制和比對具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

NDV LaSota株，本實(shí)驗(yàn)室保存；SPF種蛋，購自山東無特定病原雞實(shí)驗(yàn)種雞場；含病毒核酸提取試劑的新城疫病毒 RT-PCR檢測試劑盒，青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心研制。

1.2 方法

1.2.1 NDV尿囊液的制備。取-80 ℃保存的種毒，用生理鹽水進(jìn)行5 000倍稀釋，按0.2 mL/枚接種于12枚9日齡SPF雞胚，37 ℃孵育72 h，置4 ℃過夜后收取尿囊液，混勻后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血凝滴度（HA）的測定。參照《新城疫診斷技術(shù)》（GB?T 16550—2008）附錄B，配制1%的雞紅細(xì)胞懸液，主要步驟：采集3只SPF公雞抗凝血3 mL，加入20 mL磷酸鹽緩沖液，混勻后1 500 r/min離心，棄上清和白細(xì)胞層；重復(fù)洗滌離心3次，最后吸取壓積紅細(xì)胞，按體積比加入磷酸鹽緩沖液，配制成1%的雞紅細(xì)胞懸液，4 ℃保存?zhèn)溆?。?20 ℃保存的NDV尿囊液5 mL，連續(xù)倍比稀釋至210，分別依次編號為0～10；然后參照《新城疫診斷技術(shù)》（GB?T 16550—2008）測定11個樣品的血凝滴度（HA），重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 4單位病毒的配制。取-20 ℃保存的血凝滴度為27的NDV尿囊液1 mL，按照《新城疫診斷技術(shù)》（GB?T 16550—2008），用磷酸鹽緩沖液稀釋配制4單位病毒；取4單位病毒5 mL，用磷酸鹽緩沖液倍比稀釋至28，編號為F0～F8。

1.2.4 病毒核酸的提取。取11個編號為0～10樣品和9個編號為F0～F8樣品各200 μL，參照試劑盒說明書提取NDV核酸，最后用60 μL 無RNA酶雙蒸水洗脫，獲得的核酸樣品為前稀釋核酸樣品，編號為R0～R10和RF0～RF8。取R0樣品30 μL，用30 μL無RNA酶雙蒸水倍比稀釋至210，獲得的核酸樣品為后稀釋核酸樣品，編號依次為R1'～R10'。

1.2.5 RT-PCR擴(kuò)增和電泳。取各核酸樣品3 μL，參照說明書配制總體積為25 μL的RT-PCR反應(yīng)體系，同時設(shè)空白對照。PCR反應(yīng)程序：（1）42 ℃35 min；（2）95 ℃ 3 min；（3）94 ℃ 30 s，55 ℃30 s；72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；（4）72 ℃ 7 min；（5）降溫至16 ℃保存。配制2%瓊脂糖凝膠，將RTPCR產(chǎn)物加入上樣緩沖液混合后，上樣5 μL，110 V電泳40 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 NDV尿囊液制備和血凝單位測定

將NDV LaSota株種毒接種SPF胚后，剔除48 h內(nèi)死亡的雞胚，48 h至收獲時死亡1枚，共收取尿囊液約80 mL。血凝試驗(yàn)時以紅細(xì)胞完全凝集的最大稀釋倍數(shù)為病毒血凝滴度，11個尿囊液樣品的血凝滴度呈現(xiàn)倍比梯度，編號7～10樣品血凝滴度為1:20（表1）。

表1尿囊液的稀釋倍數(shù)、血凝滴度及稀釋后提取核酸的RT-PCR結(jié)果

2.2 RT-PCR和電泳

參照新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒說明書，配制25 μL反應(yīng)體系，對樣品R0～R10和R1'～ R10'進(jìn)行35個循環(huán)擴(kuò)增后，將其產(chǎn)物加入載樣緩沖液，各取5 μL，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，40 min后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。在空白對照成立的前提下，前稀釋核酸樣品中的R0～R7均出現(xiàn)清晰的長度為535 bp的特異性擴(kuò)增條帶，判為陽性，而且隨著樣品中核酸模板濃度的降低，PCR產(chǎn)物的豐度依次降低，R8、R9和R10在相同位置也出現(xiàn)模糊條帶，判為陽性（圖1和表1）；后稀釋核酸樣品R0'～R8'均出現(xiàn)清晰的長度為535 bp擴(kuò)增條帶，判為陽性，而且PCR產(chǎn)物的豐度同樣出現(xiàn)遞降，R9'和R10'在同樣位置未出現(xiàn)特定長度條帶，判為陰性（圖1、圖2）。

4單位病毒經(jīng)過倍比稀釋后制備的核酸樣品RF0、RF1、RF2的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在電泳后出現(xiàn)清晰的特定長度條帶，RF3、RF4和RF5的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)較弱條帶，其他未見同等大小條帶（圖2）。因此，該新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒的最低檢出量為NDV 4單位病毒1:32倍稀釋。

3 討論

NDV引起的ND已成為世界養(yǎng)禽業(yè)最關(guān)注的疾病之一。雖然NDV只有1個血清型，但不同毒株的毒力差異較大。對臨床初步判斷為“可疑”的病例，需要用RT-PCR方法確定是否為“疑似”，所以新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒的研發(fā)和應(yīng)用對于ND防控工作具有重要意義。

圖1以兩種方法制備的核酸樣品為模板的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 NDV 4單位病毒制備的核酸樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒作為一種特殊的獸用生物制品，其研制和新獸藥證書的申報有其特殊性，敏感性是其研究的關(guān)鍵指標(biāo)之一?！东F醫(yī)診斷制品試驗(yàn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求確定制品的最低檢出量。新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒的檢測靶標(biāo)主要是臨床“可疑”病例的組織或者拭子樣品中的病毒核酸。在靶標(biāo)物質(zhì)的檢測過程中，涉及到樣品核酸的提取、反轉(zhuǎn)錄酶將病毒核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以及Taq酶對核酸樣品中起始cDNA的擴(kuò)增。因此，試劑盒的核酸提取效率、反轉(zhuǎn)錄酶的活性和反轉(zhuǎn)錄效率以及Taq酶的擴(kuò)增效率是影響試劑盒最低檢出量的核心技術(shù)環(huán)節(jié)。理想的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不僅能對上述3個指標(biāo)進(jìn)行評價，而且其制備用的原（材）料應(yīng)有足夠的數(shù)量，其均勻性、純凈性、穩(wěn)定性、特異性、一致性以及特性量值范圍等應(yīng)滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的用途。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備用的候選物可以是天然的，也可以是人工制備的，但對其有效成分必須進(jìn)行量值標(biāo)定。目前關(guān)于NDV RT-PCR或熒光定量RT-PCR檢測方法的研究，大多以含有該方法靶標(biāo)序列的質(zhì)粒等核酸建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，來評價最低檢出量[13]。標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以理解為使用人工制備的核酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其有效成分（DNA或者進(jìn)一步制備的RNA）量值是通過理論計算出來的，而并非實(shí)驗(yàn)標(biāo)定。以質(zhì)粒及其衍生物為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來定量新城疫病毒 RT-PCR檢測試劑盒的最低檢出量，不能完全反映試劑盒的核酸提取效率或反轉(zhuǎn)錄酶的效率。

與質(zhì)粒相比，以天然的NDV作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)更有實(shí)際意義。這是因?yàn)槠渲苽溆玫暮蜻x物來源穩(wěn)定，并且能夠滿足試劑盒3個核心技術(shù)環(huán)節(jié)的定量需要，最關(guān)鍵的是病毒的量值標(biāo)定方法已得到公認(rèn)。NDV的量值標(biāo)定方法有細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）、雞胚半數(shù)感染量（EID50）和血凝滴度（HA）測定等[12]，其中TCID50和EID50受毒株的毒力和活病毒數(shù)量影響較大，而且試驗(yàn)操作繁瑣[13]；HA是基于NDV顆粒表面的血凝素H而建立的一種病毒含量測定方法，其試驗(yàn)操作簡便，判定方法已得到行業(yè)公認(rèn)，而且1%雞紅細(xì)胞和4單位病毒的配制方法已有相應(yīng)的國標(biāo)[3]。因此，以血凝滴度定量制備的4單位病毒為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，更能滿足NDV RT-PCR檢測試劑盒研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)控和比對的需求。

本試驗(yàn)采用NDV LaSota株為主要研究對象，根據(jù)《新城疫診斷技術(shù)》（GB?T 16550—2008），用血凝試驗(yàn)方法來定量病毒含量。試驗(yàn)用的病毒未被滅活，且控制凍融次數(shù)，這避免了不同類型滅活劑、滅活方法以及反復(fù)凍融對病毒血凝滴度和病毒核酸穩(wěn)定性的影響，從而降低了病毒血凝滴度與病毒核酸拷貝數(shù)之間的數(shù)據(jù)偏離。當(dāng)然關(guān)于病毒血凝滴度與病毒核酸拷貝數(shù)之間的準(zhǔn)確量化關(guān)系，還有待于研究。本試驗(yàn)采用了2種方法，即先稀釋病毒再提取核酸和先提取核酸再進(jìn)行稀釋，探索4單位病毒作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不同使用方法的可行性。另外，由于不同毒株血凝素的差異，相同數(shù)量NDV顆粒的血凝滴度也不盡相同，所以本實(shí)驗(yàn)根據(jù)試劑盒的靶標(biāo)序列，選擇NDV LaSota株制備標(biāo)定4單位病毒為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對試劑盒的最低檢出量進(jìn)行定量，從而能夠滿足本試劑盒敏感性研究的需要。

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是獸醫(yī)診斷制品研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)控和比對的必需生物材料。由于檢測方法原理的差異，不同診斷制品對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求也不同，但是大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都需要量值標(biāo)定。本試驗(yàn)采用4單位病毒為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定量新城疫病毒 RT-PCR檢測試劑盒的最低檢出量，對新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒的研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)控進(jìn)行了實(shí)踐性探索，也為多種NDV分子生物學(xué)類檢測試劑盒評價用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，提供了一種新的標(biāo)定方法。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 5版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：555.

[2] 國務(wù)院. 國家中長期動物疫病防治規(guī)劃：國辦發(fā)〔2012〕31號[A]. 北京：國務(wù)院辦公廳，2012-05-20.

[3] 農(nóng)業(yè)部. 新城疫診斷技術(shù)：GB/T 16550-2008 [S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008-12-31.

[4] 金宇良. PCR技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（10）：47-48.

[5] 龔振華，馬育芳，蔣正軍，等. 用RT-PCR檢測新城疫病毒的研究[J]. 中國動物檢疫，1998（2）：5-8.

[6] 宋長緒，劉福安. 用PCR檢測雞新城疫病毒的初步試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，1995（10）：20-20.

[7] 唐小飛，謝芝勛，劉加波，等. 多重RT-PCR快速檢測鑒別新城疫病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2005，35（11）：888-891.

[8] 趙建梅，魏榮，王志亮，等. 一步法多重RT-PCR檢測新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎病毒試驗(yàn)的研究[J]. 中國動物檢疫，2003，20（1）：22-24.

[9] 張鶴曉，高志強(qiáng)，賴平安，等. 新城疫病毒通用型實(shí)時RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2006，26（4）：53-56.

[10] 農(nóng)業(yè)部. 獸醫(yī)診斷制品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范：中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2334號[A]. 北京：農(nóng)業(yè)部，2015-12-09.

[11] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)《2016年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計劃》的通知[A]. 北京：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局，2016-03-30.

[12] 姚火春. 獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 2版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：128.

[13] JANG J，HONG S H，KIM I H. Validation of a real-time RT-PCR method to quantify Newcastle Disease Virus（NDV）titer and comparison with other quantifiable methods [J]. Journal of microbiology and biotechnology，2011，21（1）：100-108.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Using 4-HAU as the Reference to Determine the Limits of Detection of RT-PCR kit for Newcastle Disease Virus

Liu Shuang1，Zhang Rumin3，Wang Xiaodong2，Zhang Xingjin2，Zhang Hao2，Gong Fengju2，Shao Yu2，Shao Weixing1，2，Sun Xueqiang1，2
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Regen Diagnostics Development Center，Qingdao，Shandong 266114；3. Zhengzhou Technical College，Zhengzhou，Henan 450121）

It is the fi rst report to use 4-HAU（hemagglutining unit）of Newcastle Disease virus（NDV）as reference material to determine the limits of detection（LOD）of RT-PCR kits for NDV. The SPF embryos were inoculated with the NDV LaSota strain. The allantoic fl uid containing NDV was collected and the HA titer was determined as 27. The fl uid was 2-fold diluted and the RNA was extracted. Using NDV RT-PCR detection kit，specif i c band with expected length could be amplif i ed from most of the RNA samples. The allantoic fl uid was diluted to contain 4-HAU virus and was set as the reference. After series of 2-fold dilution，RNA was extracted and used to determine the LOD of the RTPCR kit. The results showed that the LOD of the RT-PCR kits for NDV was 1:32 dilution of the reference material. The method could provide references for research，development，production，quality control and comparison of molecular biological diagnostics，such as NDV RT-PCR kit.

NDV；RT-PCR；4-HAU；reference material；limits of detection

S852.65

：B

：1005-944X（2017）06-0094-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.027

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）