王 灝，李金平，侯廣宇，王素春，彭 程，莊青葉，劉 朔，于建敏，王楷宬，邱 源，費(fèi)榮梅，陳繼明，蔣文明

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

2017年2月我國(guó)東部四省份家禽H7N9流感橫斷面調(diào)查

王 灝1，2，李金平2，侯廣宇2，王素春2，彭 程2，莊青葉2，劉 朔2，于建敏2，王楷宬2，邱 源2，費(fèi)榮梅1，陳繼明2，蔣文明2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

為了解現(xiàn)階段我國(guó)家禽中H7N9病毒感染狀況，2017年2月在我國(guó)東部4個(gè)省份的123個(gè)場(chǎng)點(diǎn)進(jìn)行了H7N9流感流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示：H7N9病毒的樣品總陽(yáng)性率為2.48%，其中活禽市場(chǎng)的陽(yáng)性率與往年監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)相比出現(xiàn)上升；陽(yáng)性場(chǎng)點(diǎn)范圍較大，涵蓋了養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)等多個(gè)區(qū)域；鴨類樣品中的H7N9病毒陽(yáng)性率高于往年，為1.89%。HA序列分析結(jié)果顯示，此次調(diào)查中檢出的H7N9病毒均為低致病性病毒。這些數(shù)據(jù)為今后全面了解我國(guó)家禽中的H7N9病毒感染現(xiàn)狀和制定有關(guān)防控措施提供了技術(shù)支持。

家禽；流感病毒；H7N9；流行病學(xué)；橫斷面調(diào)查

禽類流行性感冒是由禽流感病毒（Avian inf l uenza virus，AIV）感染禽類及其他易感動(dòng)物引起的一種高致病性、高接觸性人獸共患傳染病。AIV屬于正黏病毒科，分A、B、C、D 4個(gè)型。其中：A型流感病毒多感染禽類，也可感染豬、馬、海豹和鯨等哺乳動(dòng)物及人類；B型和C型流感病毒分別見(jiàn)于海豹和豬的感染；D型流感病毒主要感染牛[1]。根據(jù)表面血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）不同，AIV可分為16種HA亞型和9種NA亞型[2]，其中H3、H5、H7、H9亞型可感染人。H7N9亞型流感病毒（以下簡(jiǎn)稱 H7N9病毒）是一種新型流感病毒，于2013年3月底在上海和安徽兩地被首次發(fā)現(xiàn)[3]。

H7N9病毒自首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在全國(guó)范圍內(nèi)的家禽中快速擴(kuò)散。對(duì)華東地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，其陽(yáng)性率呈逐年上升趨勢(shì)[4]，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)影響較大。為評(píng)估目前家禽中H7N9病毒的分布及感染情況，2017年2月在我國(guó)東部4個(gè)省份的活禽批發(fā)市場(chǎng)、活禽零售市場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、養(yǎng)禽場(chǎng)、散養(yǎng)戶，隨機(jī)選擇了123個(gè)場(chǎng)點(diǎn)，進(jìn)行病原學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材

QIAamp Viral RNA Mini Kit，購(gòu)自Qiagen公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit，購(gòu)自Vazyme公司；植絨拭子，購(gòu)自深圳麥瑞科林科技有限公司；SPF雞胚，購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司；H7抗原，購(gòu)自哈維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.2 樣品采集

2017年2月，對(duì)4個(gè)省份的123個(gè)場(chǎng)點(diǎn)（其中69個(gè)活禽市場(chǎng)），采集病原學(xué)樣品進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)歷年的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，在每個(gè)省份選取2個(gè)重點(diǎn)縣，采集活雞咽/肛拭子作為代表性樣品進(jìn)行檢測(cè)。由于此次調(diào)查為臨時(shí)添加的調(diào)查，并且增加了除常規(guī)市場(chǎng)以外的其他場(chǎng)點(diǎn)樣品采集計(jì)劃，因此各地采樣份額均采取隨機(jī)分配方式，其中雞樣品3 461份、鴨樣品212份、鵝樣品5份、鴿樣品13份、運(yùn)輸工具樣品5份、環(huán)境樣品90份，總計(jì)3 786份（表1）。

1.3 病毒分離

采集家禽的咽喉、泄殖腔雙拭子置于加抗生素（慶大霉素、左旋氧氟沙星、阿奇霉素）的PBS-甘油采樣液中（pH7.2～7.6），10 000 r/min離心10 min，取上清接種10～11日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，37 ℃孵化96 h。每隔24 h照胚1次，用1%的雞紅細(xì)胞，測(cè)定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)。

1.4 RNA提取

用Qiaxtractor核酸自動(dòng)提取工作站，提取死胚及血凝陽(yáng)性胚尿囊液中的病毒RNA，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 H7和N9基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)表的序列，針對(duì)流感病毒H7基因序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，使其能夠擴(kuò)增HA1、HA2裂解位點(diǎn)區(qū)域（表2）。擴(kuò)增N9的引物時(shí)，參考以前發(fā)表的文獻(xiàn)[5]。

表2擴(kuò)增H7和N9的引物

按照HiScript II One Step RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)，配置44.0 μL RT-PCR 預(yù)混液，包括2×RT-PCR Buffer 25.0 μL、引物各2.0 μL（10 μmol/L）、Enzyme Mix 2.5 μL、ddH2O 12.5 μL，加入6.0 μL RNA模板。RTPCR反應(yīng)條件為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸5 min。利用QIAxcel毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行片段分析，將PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.6 H7亞型抗體檢測(cè)

在96孔血凝板內(nèi)加入PBS，每孔25 μL，標(biāo)記序號(hào)。在第1孔內(nèi)加入25 μL被檢血清，充分混勻后移出25 μL加至第2孔，依次類推，倍比稀釋至第6孔，棄去25 μL，設(shè)第7和第8孔為對(duì)照。在1～6孔內(nèi)各加入25 μL 4單位H7標(biāo)準(zhǔn)抗原，輕叩反應(yīng)板，使反應(yīng)物混合均勻，室溫20～25 ℃下，靜置30 min。之后依次向各孔內(nèi)加入25 μL 1%的雞紅細(xì)胞懸液，室溫（20～25 ℃）靜置45 min后觀察結(jié)果。在紅細(xì)胞對(duì)照出現(xiàn)完全沉淀，病毒對(duì)照出現(xiàn)完全凝集的情況下，將反應(yīng)板作45°傾斜，從反應(yīng)板背側(cè)觀察。將完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度，當(dāng)被檢血清的HI效價(jià)大于或等于4 log2時(shí)，判為抗體陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 H7N9病毒檢測(cè)結(jié)果

從4個(gè)省份123個(gè)場(chǎng)點(diǎn)采集的3 786份樣品中，檢出H7N9病毒94株，樣品總陽(yáng)性率為2.48%。其中，A省樣品陽(yáng)性率為1.83%，B省為5.95%，C省為0.10%，D省為1.65%（表3）。

表3 H7N9病毒病原學(xué)陽(yáng)性樣品分布情況（單位：份）

各場(chǎng)點(diǎn)樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，活禽零售市場(chǎng)的H7N9樣品陽(yáng)性率最高，為4.26%；其次是屠宰場(chǎng)，為3.09%；養(yǎng)殖場(chǎng)中的最低，為0.76%（圖1）。

圖1不同場(chǎng)點(diǎn)樣品陽(yáng)性率

各種類樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示：鴿樣品的H7N9陽(yáng)性率最高，為7.69%；雞、鴨和環(huán)境樣品的H7N9陽(yáng)性率相差不大，分別為2.51%（86/3 461）、1.89%（4/212）和2.16%（3/95）。

分離出的94株H7N9病毒HA基因裂解位點(diǎn)處氨基酸序列均為“-PEIPKGR/GLF-”，符合低致病性禽流感病毒分子特征。

2.2 H7亞型抗體檢測(cè)結(jié)果

在3 033份血清樣品中，檢出HI抗體陽(yáng)性樣品（HI效價(jià)≥4 log2）99份（雞98份、鴨1份），樣品陽(yáng)性率為3.26%，陽(yáng)性樣品分布在A、C省的雞養(yǎng)殖場(chǎng)和B、D省的雞、鴨市場(chǎng)。

A、C、D省43個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的1 445份樣品中，有55份樣品的HI效價(jià)≥4 log2，樣品來(lái)自A、C省的14個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)；B省1個(gè)屠宰場(chǎng)162份樣品的HI效價(jià)≤4 log2；C省10個(gè)散養(yǎng)戶220份樣品的HI效價(jià)≤4 log2。B、D省18個(gè)市場(chǎng)44份樣品的HI效價(jià)≥4 log2（表4）。

3 分析與討論

此次調(diào)查均選取近年來(lái)的重點(diǎn)感染地區(qū)采樣，調(diào)查結(jié)果具有一定的流行病學(xué)地域代表性，但由于取樣方法為隨機(jī)取樣，因此不具有單一類型場(chǎng)點(diǎn)和種屬代表性。在采樣場(chǎng)點(diǎn)、種屬類型等的選擇上，由于此次調(diào)查的主要目的是了解4省份的H7N9病毒感染現(xiàn)狀，僅為概括性調(diào)查，因此在場(chǎng)點(diǎn)選擇上，并未針對(duì)某一特殊地域群體或個(gè)體，以及某一特殊種屬禽類進(jìn)行采樣。本檢測(cè)結(jié)果僅對(duì)了解2017年2月份4省份的H7N9病毒總體感染情況提供參考。同時(shí)，此次流行病學(xué)調(diào)查為臨時(shí)性調(diào)查，并非常規(guī)春秋季流行病學(xué)調(diào)查，在時(shí)間上與以往歷史數(shù)據(jù)時(shí)間略有不同，因此在同歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時(shí)得出的結(jié)論具有一定偏差性，但趨勢(shì)上仍具有代表性。此次調(diào)查的采樣地點(diǎn)沒(méi)有覆蓋各省的所有地點(diǎn)，采樣時(shí)也可能存在人為失誤導(dǎo)致的樣品污染，因此本調(diào)查結(jié)果具有一定局限性和偏差性，僅可作為4省份感染情況的定性參考數(shù)據(jù)，不可作為定量分析數(shù)據(jù)。

表4 H7亞型流感抗體統(tǒng)計(jì)結(jié)果（單位：份）

從此次調(diào)查的結(jié)果來(lái)看，4省份的H7N9病毒樣品總陽(yáng)性率為2.48%。由于采樣地點(diǎn)的變動(dòng)和采樣時(shí)間的不固定，不能對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確地縱向比較。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，4個(gè)省份的陽(yáng)性率差異較大，如B省樣品陽(yáng)性率高達(dá)5.95%，而C省僅為0.10%。這可能是因樣品采集的隨機(jī)性及不均衡性導(dǎo)致的，這應(yīng)在今后采樣監(jiān)測(cè)中引起足夠的重視，要通過(guò)加大采樣監(jiān)測(cè)的范圍和力度來(lái)避免。

從感染范圍來(lái)看，H7N9病毒陽(yáng)性場(chǎng)點(diǎn)的范圍較大，幾乎涵蓋了家禽行業(yè)的全部供銷途徑，包括養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)等。其中，活禽零售市場(chǎng)樣品H7N9陽(yáng)性率達(dá)到4.26%，為陽(yáng)性率最高的場(chǎng)點(diǎn)，再次證實(shí)了活禽市場(chǎng)是流感病毒的一個(gè)重要儲(chǔ)存庫(kù)?；钋菔袌?chǎng)為病毒的基因重組和跨種傳播提供了有利條件[5]，是人類感染H5N1、H7N9等流感病毒的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域[6-7]，應(yīng)作為病原監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)對(duì)象[8]。

之前有研究顯示[4]，由于批發(fā)市場(chǎng)的家禽大都來(lái)自規(guī)?；B(yǎng)禽場(chǎng)，因此病毒攜帶量相對(duì)較小。此次調(diào)查結(jié)果顯示，活禽批發(fā)市場(chǎng)陽(yáng)性率僅為1.36%，但活禽零售市場(chǎng)的病毒攜帶量大大增加，活禽零售市場(chǎng)陽(yáng)性率高達(dá)4.26%，提示市場(chǎng)的這種交叉性環(huán)境造成禽類流感感染率的上升。結(jié)合近年數(shù)次H7N9流感流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，可以看出活禽零售市場(chǎng)的病毒感染率呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)（圖2），提示活禽零售市場(chǎng)存在較大的交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)予以重視。

圖2 2013—2017年活禽零售市場(chǎng)H7N9病毒檢出率變化趨勢(shì)

此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)：雞類樣品的陽(yáng)性率為2.51%，保持較高的檢出水平；鴨類樣品的陽(yáng)性率為1.89%，較之前的檢測(cè)結(jié)果明顯提升，提示H7N9病毒的感染范圍在鴨類等水禽中可能正逐步擴(kuò)大。因此，在今后的采樣檢測(cè)中，仍需要以雞作為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象，但要擴(kuò)大監(jiān)測(cè)范圍，涵括多種禽類[9]，這樣才更有利于H7N9病毒感染水平的評(píng)估和防控措施的制定。

此次調(diào)查檢出的94株H7N9病毒HA基因裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列均為“-PEIPKGR/GLF-”，符合低致病性禽流感病毒分子特征，對(duì)家禽危害較小。

此次調(diào)查共檢測(cè)血清樣品3 033份，檢出HI抗體陽(yáng)性（HI效價(jià)≥4 log2）99份，樣品總陽(yáng)性率為3.26%，處于較低抗體水平；從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，HI抗體陽(yáng)性率最高的場(chǎng)所為規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，說(shuō)明規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)有一定程度的病毒感染，這與養(yǎng)殖場(chǎng)H7N9病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致。由于HI試驗(yàn)可能存在干擾和非特異性，因此不能依此判定目前以上地區(qū)H7亞型流感的真實(shí)抗體水平，只可作為參考。

此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)H7N9病毒陽(yáng)性率較高，說(shuō)明在禽流感的防控方面仍面臨巨大挑戰(zhàn)。建議加大對(duì)活禽交易市場(chǎng)H7N9病毒的監(jiān)測(cè)力度，定期開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查，鼓勵(lì)發(fā)展冰鮮禽銷售，以此替代活禽交易，從而最大程度地減少交叉感染，不為流感病毒提供動(dòng)物間傳播和變異的環(huán)境。在無(wú)法做到統(tǒng)一管理、減少活禽交易的地區(qū)，應(yīng)大力加強(qiáng)家禽業(yè)各環(huán)節(jié)的衛(wèi)生防疫管理，制定合理的管理方法和防疫制度，盡量減少活禽之間以及活禽與人之間的接觸機(jī)會(huì)。此外，應(yīng)當(dāng)加大對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的監(jiān)測(cè)力度，隨時(shí)關(guān)注病毒的變異情況，防止疫情大規(guī)模暴發(fā)。

[1]ZOWALATY M E，BUSTIN S A，HUSSEINY M I，et al. Avian influenza：virology，diagnosis and surveillance[J]. Future Microbiology，2017，8（9）：1209-1227.

[2] OLSEN B，MUNSTER V J，WALLENSTEN A，et al. Global patterns of inf l uenza A virus in wild birds [J]. Science，2006，312：384-388.

[3] 陳雅，朱進(jìn)，馮振卿. 新型人感染H7N9型禽流感病毒研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2016，29（7）：759-763.

[4] 蔣文明，王艷，李金平，等. 2014—2016年華東地區(qū)某市活禽市場(chǎng)禽流感流行病學(xué)調(diào)查與分析[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2017，34（1）：14-18.

[5] 蔣文明，李金平，于美芳，等. 雙重RT-PCR快速檢測(cè)H7N9流感病毒方法的建立[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2015，32（5）：65-68.

[6] SHORTRIDGE K F. Pandemic influenza：A zoonosis[J]. Semin Respir Infect，1992（7）：11-25.

[7] LIU M，HE S Q，WALKER D，et al. The influenza virus gene pool in a poultry market in south central China[J]. Virology，2003，305：267-275.

[8] SHORTRIDGE K F，GAO P，GUAN Y，et al. Interspecies transmission of inf l uenza viruses：H5N1 virus and a Hong Kong SAR perspective[J]. Vet Microbiol，2000，74：141-147.

[9] AI J，HUANG Y，XU K，et al. Case-control study of risk factors for human infection with inf l uenza A（H7N9）virus in Jiangsu Province，China，2013[J]. Euro Surveill，2013，18 （26）：1-6.

[10] 王偉. 禽流感的流行趨勢(shì)與防控[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2016（11）：96-96.

[11] 汪招雄，歐陽(yáng)金旭，楊玉瑩，等. 規(guī)?；半u場(chǎng)H9N2亞型禽流感疫苗免疫效果調(diào)查[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2016，24（1）：15-21.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Cross-sectional Investigation of H7N9 inf l uenza in Domestic Poultry in Four Provinces of Eastern China in February 2017

Wang Hao1，2，Li Jinping2，Hou Guangyu2，Wang Suchun2，Peng Cheng2，Zhuang Qingye2，Liu Shuo2，Yu Jianmin2，Wang Kaicheng2，Qiu Yuan2，F(xiàn)ei Rongmei1，Chen Jiming2，Jiang Wenming2
（1. College of Veterinary Medicine，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095；2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

In order to recognize the situation of H7N9 virus infection in domestic poultry in China at the present stage，epidemiological investigation of H7N9 from 123 points in 4 provinces in eastern China was carried out in February 2017. The results showed that the total positive rate of H7N9 virus was 2.48%，in which the positive rate of live poultry markets increased compared with the monitoring data in previous years. The positive fi eld range of H7N9 virus expanded，covering farms，slaughterhouses and markets. And the positive rate of H7N9 was 1.89% in duck samples，which was higher than in previous years. The results of HA sequence analysis showed that the H7N9 viruses detected in this survey were all low pathogenic viruses. These data could develop a comprehensive understanding of the pollute status of avian inf l uenza virus in China and provide technical support for the prevention and control of avian inf l uenza.

domestic poultry；inf l uenza virus；H7N9；epidemiology；cross-sectional investigation

S852.65

：A

：1005-944X（2017）06-0018-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.005

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）

蔣文明