武宇輝, 齊 穎, 馬偉科, 李雨錚, 楊衛(wèi)國, 李成榮

(廣東省深圳市兒童醫(yī)院 PICU, 廣東 深圳, 518038)

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膿毒癥患兒CD14+單核細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)及其臨床意義

武宇輝, 齊 穎, 馬偉科, 李雨錚, 楊衛(wèi)國, 李成榮

(廣東省深圳市兒童醫(yī)院 PICU, 廣東 深圳, 518038)

目的 觀察兒童膿毒癥患者CD14+單核細(xì)胞(MC)中miR-146a的表達(dá)水平。方法 選取 40例膿毒癥患兒。選擇15例手術(shù)后全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)患兒和15例健康兒童作為對照組。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測CD14+MC中miR-146a水平和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)胞介素10(IL-10)的表達(dá)水平。流式細(xì)胞儀檢測CD14+MC HLA-DR水平。測定外周血超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、降鈣素原(PCT)水平。結(jié)果 膿毒癥患兒CD14+MC的HLA-DR水平均>30%。膿毒癥患兒CD14+MC的miR-146a表達(dá)水平較SIRS組和健康對照組顯著升高(P<0.05), 在恢復(fù)期其水平顯著下調(diào)(P<0.05)。膿毒癥患兒CD14+MC的TNF-α、IL-10水平均較健康對照組顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 膿毒癥患兒CD14+MC中miR-146a表達(dá)上調(diào)。

兒童; 微小RNA-146a; 膿毒癥; CD14+單核細(xì)胞

膿毒癥是指由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。如果早期持續(xù)的SIRS未能得到有效控制，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，是PICU危重患兒的主要死亡原因之一[1]。微小RNA(miRNA)是一種非編碼RNA, 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。既往研究[2]表明，某些miRNA在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。為進(jìn)一步探討miRNA在膿毒癥患兒中的臨床意義，作者檢測了膿毒癥患兒外周血CD14+MC中miR-146a及其相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年9月—2016年3月在本院PICU住院的40例膿毒癥患兒，男23例，女17例，平均年齡2.13±0.94歲，7例死亡。所有患兒均符合2012版膿毒癥國際指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。膿毒癥患兒中腹腔感染16例，肺部感染13例，顱內(nèi)感染3例，皮膚軟組織感染5例，泌尿系感染3例。31例血培養(yǎng)陽性，7例死亡。選取同期住院的15例外科手術(shù)后患兒作為SIRS組(所有患兒在術(shù)后24 h均發(fā)生SIRS且在接下來的1周內(nèi)沒有發(fā)生膿毒癥)，15例來醫(yī)院體檢的同齡健康兒童作為對照組。各組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過了醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批，所有檢查均得到患兒家屬的知情同意。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 免疫磁珠分離外周血CD14+MC: 膿毒癥組患兒在入住PICU后診斷膿毒癥6 h內(nèi)，無菌采集靜脈血2 mL用乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·Na2)抗凝，通過Dynabeads?CD14(美國, Invitrogen)提取CD14+MC, 加入QIAZOL溶液0.7 mL, 吹打混勻，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆眠M(jìn)行PCR檢測。留取血標(biāo)本常規(guī)送檢血常規(guī)、hs-CRP梁蚉CT。存活的膿毒癥患兒在治療2周后病情恢復(fù)期復(fù)查以上各項(xiàng)目。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD14+MC的HLA-DR表達(dá): 留取外周靜脈血3 mL, 血標(biāo)本收集后均立即送檢。采用全血計(jì)數(shù)法，用FITC-CDl4, APC-HLA-DR(抗體及同型對照所需試劑均購自美國Bioscience公司)行細(xì)胞表面染色，避光孵育30 min, 以FITC-CDl4設(shè)門，流式細(xì)胞儀(美國BD公司，F(xiàn)ACS CantoⅡ)計(jì)數(shù)檢測CD14+MC的HLA-DR表達(dá)，全部數(shù)據(jù)經(jīng)FACS Diva Ver 6.1.3軟件獲取分析。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量(RT)-PCR: CD14+MC總RNA及miRNA提取及定量: 按miRneasy Mini試劑盒(德國QIAGEN公司)說明書步驟，從添加QIAZOL溶液的外周血CD14+MC分離總RNA并進(jìn)行純化。紫外分光光度計(jì)測定260 nm(A260)的吸收值計(jì)算RNA 濃度，保證在0.15～1.0。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-146a: 白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α): ① 逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)及產(chǎn)物鑒定: 羗iR-146a按miScript Ⅱ RT Kit說明，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 測定引物由QIAGEN公司設(shè)計(jì)合成，以Hs-RNU6-2(MS00033740)為內(nèi)參。普通mRNA按試劑盒(美國Thermo公司)說明，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 再進(jìn)行PCR擴(kuò)增35～50個(gè)循環(huán)，取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL, 2%瓊脂糖凝膠中，90V電泳30 min，回收純化，并送交上海Invitrogen公司測序，測序結(jié)果與GeneBank中目的基因mRNA序列完全一致。根據(jù)Gene Bank中基因mRNA序列設(shè)計(jì)目的引物(由上海Invitrogen公司合成)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。② 熒光定量PCR(qRT-PCR): 罷NF-α、IL-10測定采用SYBR Green Kit(德國QIAGEN公司), miR-146a測定采用SYBR Green Kit(德國QIAGEN公司)，每個(gè)反應(yīng)體系均為15 μL, 使用羅氏LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀檢測其表達(dá)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用內(nèi)參進(jìn)行歸一化。具體操作參照說明書。待測因子表達(dá)應(yīng)用Relative Quantification Software Ver1.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以目的基因/GAPDH或U6比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)分析均用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性(F檢驗(yàn))檢驗(yàn)后，符合正態(tài)分布，方差齊性的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單相方差分析(ANOVA), 進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn); 非正態(tài)分布的資料以中位數(shù)(25百分位數(shù), 75百分位數(shù))表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膿毒癥患兒miR-146a及其炎癥因子檢測結(jié)果

所有膿毒癥組患者HLA-DR均>30%。膿毒癥患者miR-146a表達(dá)水平較SIRS和健康對照組水平均升高，且在恢復(fù)期水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。膿毒癥組患兒TNF-α表達(dá)水平雖較健康對照組顯著升高(P<0.05), 但在膿毒癥和SIRS之間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2 超敏CRP和PCT檢測結(jié)果

膿毒癥患兒hs-CRP和PCT分別為57.70(39.83, 82.30) mg/L和6.05(1.19, 24.78) ng/mL, 較SIRS組39.30(29.00, 48.20) mg/L和1.10

表1 miR-146a及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平

與膿毒癥組比較, *P<0.05; 與SIRS組比較, #P<0.05; 與健康對照組比較, △P<0.05。

(0.51, 1.94) ng/mL及健康對照組0.08(0.06, 0.20) mg/L和0.09(0.06, 0.12) ng/mL均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

膿毒癥是兒童重癥監(jiān)護(hù)病房常見的危重癥，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[3]。膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中促炎/抗炎反應(yīng)同時(shí)存在，機(jī)體處于一種復(fù)雜的免疫紊亂和動(dòng)態(tài)失衡中[4-5]。本研究中膿毒癥患者單核/巨噬細(xì)胞中IL-10、TNF-α均升高，支持了這一觀點(diǎn)。

miRNA是一類長約21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，目前發(fā)現(xiàn)與人類密切相關(guān)的miRNA近千種，與生理狀態(tài)的改變以及疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miRNA參與調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞和介質(zhì)的表達(dá)，其中miR-146a不但在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病及特異性濕疹等多種與自身免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，也參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展[6-7]。IRAK-1和TRAF-6已被證實(shí)是miR-146a的直接靶分子[8-9]。miR-146a作為一個(gè)負(fù)調(diào)控分子，主要依靠互補(bǔ)結(jié)合于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(TRAF-6)和白介素1受體相關(guān)激酶-1(IRAK-1)的3′7UTR區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TRAF-6和IRAK-1的水平，負(fù)向調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的活性，對免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，減輕炎癥因子的釋放。

單核巨噬細(xì)胞是膿毒癥發(fā)病機(jī)制中宿主防御各種微生物入侵的核心因素[10-11]。單核細(xì)胞CD14是一種細(xì)菌細(xì)胞壁碎片識(shí)別受體，是成熟單核細(xì)胞的標(biāo)志，在對細(xì)菌病原體的免疫反應(yīng)中起到重要作用。既往多個(gè)研究[12-14]顯示，CD14+單核細(xì)胞HLA-DR水平是判斷膿毒癥患者免疫狀態(tài)的檢測指標(biāo)。HLA-DR<30%提示患者存在免疫抑制狀態(tài)。為了更好的反映miR-146a的水平，本組患者入選時(shí)排除了免疫抑制的患者，所有患兒入院時(shí)HLA-DR均>30%，提示本組入選的膿毒癥患者急性期處于促炎反應(yīng)占優(yōu)勢的狀態(tài)。對照組患兒HLA-DR水平與既往研究相仿[15]，同時(shí)研究結(jié)果顯示此時(shí)患者血液中存在高表達(dá)水平的促炎癥因子和抗炎因子，外周血CD14+單核細(xì)胞中miR-l46a同樣處于高表達(dá)狀態(tài)?；颊叩某鬋RP和PCT也明顯升高，隨著治療的進(jìn)行，膿毒癥恢復(fù)期患者miR-l46a的表達(dá)水平較治療前下調(diào)，提示機(jī)體促炎和抗炎過程重新達(dá)到平衡，使免疫內(nèi)穩(wěn)狀態(tài)得到一定的恢復(fù)。目前也有學(xué)者[16]發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行血液濾過后患者miR-146a的表達(dá)水平降低，患者的達(dá)到免疫平衡的病程縮短，恢復(fù)更快。本組膿毒癥患者miR-146a的表達(dá)水平較SIRS患者和健康對照組水平升高，與既往研究結(jié)果一致[17]。提示測定膿毒癥患者外周血miR-146a的表達(dá)也可以作為判斷患者的感染炎癥指標(biāo)之一，有助于膿毒癥的早期診斷和治療。

總之，膿毒癥患者外周血CD14+MC中miR-146a表達(dá)升高，有助于膿毒癥的早期診斷和病情評估，也為膿毒癥的基因靶向治療提供了新的研究方向。

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Expression and clinical significance of miRNA-146a in CD14+MC of children with sepsis

WU Yuhui, QI Ying, MA Weike, LI Yuzheng, YANG Weiguo, LI Chengrong

(PICU,ShenzhenChildren′sHospital,Shenzhen,Guangdong, 518038)

Objective To investigate the expression of miR-146a in CD14+monocytes (MC) of children with sepsis. Methods Forty children with sepsis in PICU were enrolled in the study. Fifteen children with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) after surgical treatment and fifteen healthy children were selected as control group. Expressions of miR-146a and TNF-α, IL-10 of CD14+MC were detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). HLA-DR levels of CD14+MC were detected by flow cytometry. Levels of high-sensitivity C-reactive protein (CRP) and procalcitonin (PCT) were detected. Results The HLA-DR levels of CD14+MC in all the children with sepsis were over 30%. The miR-146a level of CD14+MC were significantly higher in sepsis group than SIRS group and healthy controls (P<0.05), and the level decreased when sepsis children were recovered (P<0.05). The TNF-α, IL-10 level of CD14+MC in children with sepsis was significantly higher than healthy controls (P<0.05). Conclusion The expressions of CD14+MC miR-146a in children with sepsis are significantly up-regulated.

children; miR-146a; sepsis; CD14+monocytes

2016-12-24

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20140416141331523)

李成榮, E-mail: 418027143@qq.com。

R 631

A

1672-2353(2017)09-119-04

10.7619/jcmp.201709031