王海剛, 謝紅梅, 韓 雪, 張立獻(xiàn), 趙文增

(華北石油管理局總醫(yī)院 普外二科, 河北 任丘, 062552)

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uH2B在原發(fā)性結(jié)腸腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

王海剛, 謝紅梅, 韓 雪, 張立獻(xiàn), 趙文增

(華北石油管理局總醫(yī)院 普外二科, 河北 任丘, 062552)

目的 探討原發(fā)性結(jié)腸腺癌組織中組蛋白H2B單素泛化(uH2B)的表達(dá)水平及與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法 選取2013年1月—2016年1月本院胃腸外科手術(shù)切除的83例結(jié)腸腺癌組織標(biāo)本、癌旁組織，既往收集的20例正常結(jié)腸組織，采用免疫組化染色觀察各組組織標(biāo)本中uH2B蛋白的表達(dá)程度，并分析與原發(fā)性結(jié)腸腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 結(jié)腸癌組織標(biāo)本中uH2B蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率46.99%, 低于癌旁組織的83.13%、正常結(jié)腸黏膜組織的90.00%, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 癌旁組織和正常結(jié)腸黏膜組織中uH2B蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 結(jié)腸癌組織標(biāo)本中uH2B蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05), 與患者的年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤最大徑的關(guān)系不顯著(P>0.05)。結(jié)論 結(jié)腸癌組織標(biāo)本中uH2B蛋白表達(dá)率降低，并且與患者的腫瘤的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。

原發(fā)性結(jié)腸腺癌; 組蛋白H2B單素泛化; 臨床病理參數(shù)

結(jié)腸癌是臨床上較為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，相關(guān)研究證實(shí)結(jié)腸腺癌的發(fā)病率占到了各種結(jié)腸癌病理類型的35%以上，且近年來(lái)具有明顯的上升趨勢(shì)[1]。各種因素均可以促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，基因突變、癌基因相關(guān)蛋白的表達(dá)翻譯等，是調(diào)控和促進(jìn)結(jié)腸癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的核心因素[2-3]。近年來(lái)研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域中對(duì)于相關(guān)癌基因組蛋白的表達(dá)修飾，可以顯著影響到消化系統(tǒng)上皮細(xì)胞來(lái)源惡性腫瘤的發(fā)生。組蛋白H2B(uH2B)的單素泛化的表達(dá)調(diào)控，可以通過(guò)影響下游基因轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究通過(guò) 選取2013年1月-2016年1月本院胃腸外科手術(shù)切除的83例結(jié)腸腺癌組織標(biāo)本，探討了uH2B在結(jié)腸癌、癌旁組織及正常組織中的表達(dá)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月—2016年1月本院胃腸外科手術(shù)切除的83例結(jié)腸腺癌組織標(biāo)本、癌旁組織，既往收集的20例正常結(jié)腸組織進(jìn)行研究。原發(fā)性結(jié)腸腺癌83例，男48例，女35例; 年齡41～79歲，平均年齡(63.1±9.4)歲; 腫瘤分化程度：高分化24例，中分化22例，低分化37例; 浸潤(rùn)深度：肌層42例，漿膜層41例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。正常結(jié)腸組織20例，男12例，女8例; 年齡36～79歲，平均年齡(61.7±13.6)歲。2組的年齡、性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均在本院接受手術(shù)治療，術(shù)后病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性結(jié)腸腺癌; 術(shù)前未接受放化療、免疫治療; 正常腸黏膜組織來(lái)源于外傷手術(shù)術(shù)后標(biāo)本; 入選對(duì)象的各項(xiàng)基礎(chǔ)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者; 伴有其他部位惡性腫瘤疾病的患者; 臨床資料不完整、未經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的患者。

1.2 免疫組化方法

采用石蠟切片，切片厚度3 μm, 3% H2O2室溫孵育5 min, 采用去離子水水沖洗3次，每次3 min, 采用濃度為10% 牛奶蛋白(1 g蛋白加入100 mL純水)封閉，室溫孵育5 min, 加入uH2B蛋白抗體(鼠來(lái)源，南京碧云天生物科技有限公司), 37 ℃ 孵育2 h, PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min, 滴加HRP標(biāo)記的二抗(兔來(lái)源，購(gòu)自羅氏檢測(cè)公司), 37 ℃ 孵育30 min, PBS 沖洗3次，每次5 min, 加入 NBT/BCIP色劑顯色5 min, 復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。OLIPICS電子顯微鏡購(gòu)自上海精密儀器有限公司，配套試劑購(gòu)自南京泰康生物科技有限公司。

1.3 免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化陽(yáng)性結(jié)果判定: uH2B蛋白的陽(yáng)性著色表達(dá)于細(xì)胞膜，呈黃色、棕黃色、褐色顆粒表達(dá)，根據(jù)著色強(qiáng)度: 0分為無(wú)色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例<10%為1分、陽(yáng)性細(xì)胞所占比例11%～50%為2分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例>75%為4分，兩種積分相乘總分<3分為陰性、≥3分為陽(yáng)性。(-)為總分<3分，陰性表達(dá); (+)為3～5分，弱陽(yáng)性表達(dá); (2+)為6-9分，中陽(yáng)性表達(dá); (3+)為>9分，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 10.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述; 計(jì)數(shù)資料采用百分率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述, 2組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3類組織標(biāo)本的uH2B蛋白的陽(yáng)性率比較

結(jié)腸癌組織標(biāo)本中uH2B蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率46.99%, 低于癌旁組織的83.13%、正常結(jié)腸黏膜組織的90.00%, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 癌旁組織和正常結(jié)腸黏膜組織中uH2B蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)表1、圖1。

表1 3類組織標(biāo)本的uH2B蛋白的陽(yáng)性率比較

2.2 結(jié)腸癌組織標(biāo)本中的uH2B蛋白的陽(yáng)性率 與患者病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)腸癌組織標(biāo)本中uH2B蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P<0.05), 與患者的年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤最大徑的關(guān)系不顯著(P>0.05), 見(jiàn)表2。

3 討 論

飲食習(xí)慣的改變、過(guò)度飲酒及遺傳易感等因素均可以促進(jìn)結(jié)腸腺癌的發(fā)生發(fā)展，特別是在年齡大于45歲的老年吸煙男性人群中，結(jié)腸腺癌的發(fā)病率可達(dá)0.005%以上，且近年來(lái)具有明顯上升趨勢(shì)[6-7]。結(jié)腸癌患者容易早期發(fā)生淋巴結(jié)及血行轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后較差, 5年生存率不足35%, 中位生存時(shí)間不足32個(gè)月[8], 而通過(guò)對(duì)于結(jié)腸腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中相關(guān)遺傳學(xué)生物機(jī)制的研究，可以為結(jié)腸癌的免疫靶向治療或者綜合性的生物學(xué)治療提供新的靶點(diǎn)或者思路。

A為正常結(jié)腸黏膜組織;B為癌旁組織;C為原發(fā)性結(jié)腸腺癌組織圖1 免疫組化染色病理圖(200倍)

表2 uH2B蛋白的陽(yáng)性率與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

表觀遺傳學(xué)的改變對(duì)于惡性腫瘤的發(fā)生具有重要的調(diào)控作用，組蛋白的乙酰化、硫酸化、磷酸化及甲基化等修飾方式，可以通過(guò)誘導(dǎo)下游癌基因轉(zhuǎn)錄起始因子的活性，促進(jìn)結(jié)腸上皮黏膜細(xì)胞周期的異?；罨?，導(dǎo)致癌細(xì)胞的過(guò)度增殖[9]。然而迄今為止對(duì)于組蛋白u(yù)H2B蛋白的單素泛化研究較少。uH2B蛋白可以在H2A、H2B、H3、H4的氨基末端區(qū)域的某些專一位置形成N6-乙酰賴氨酸，通過(guò)H1位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄共同抑制復(fù)合物的形成，參與轉(zhuǎn)錄阻遏和抑癌基因的沉默等過(guò)程[10-11]。已有的研究[12]探討了uH2B蛋白的單素泛化改變與肝癌及食管癌發(fā)生的關(guān)系，認(rèn)為uH2B蛋白的單素泛化可以提高消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生概率，并促進(jìn)病情的臨床進(jìn)展。本研究的創(chuàng)新性在于探討了uH2B蛋白在結(jié)腸腺癌組織中表達(dá)的同時(shí)，分析了其與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸腺癌及癌旁組織中uH2B蛋白均呈現(xiàn)出了明顯的低表達(dá)態(tài)勢(shì)，其表達(dá)濃度明顯低于正常對(duì)照組織，特別是結(jié)腸腺癌組織中的uH2B蛋白的表達(dá)濃度更低，低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些均提示了uH2B蛋白參與到了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。uH2B蛋白的單素泛化改變，可以在影響組蛋白四級(jí)空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，促進(jìn)癌基因轉(zhuǎn)錄和反應(yīng)，從而導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。Coskun D等[13-14]通過(guò)免疫組化分析了72例結(jié)腸癌樣本量的臨床資料，發(fā)現(xiàn)uH2B在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度僅僅為15%，明顯低于癌旁組織，這與本研究結(jié)論較為一致。免疫組化染色分析可以發(fā)現(xiàn), uH2B蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞核周邊，提示其可能通過(guò)影響到細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄或者細(xì)胞膜上第二信使的合成等途徑影響到結(jié)腸癌的發(fā)生，但相關(guān)具體機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探討。對(duì)于uH2B蛋白與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系研究可以發(fā)現(xiàn), uH2B蛋白與結(jié)腸腺癌的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯的相關(guān)性，表明uH2B蛋白可能影響到了結(jié)腸癌的細(xì)胞分化及淋巴結(jié)侵襲等病理過(guò)程, uH2B蛋白表觀遺傳性水平的修飾，對(duì)于癌細(xì)胞分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的影響考慮主要與組蛋白的修飾有關(guān)，但需要注意的是，本研究并未發(fā)現(xiàn)uH2B蛋白與結(jié)腸癌組織浸潤(rùn)深度的關(guān)系，這與Kim D等[15]的結(jié)論并不完全一致，考慮到樣本量的不足、臨床資料的收集偏移等，均可能影響到了結(jié)論的差別。

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Expression of uH2B in primary adenocarcinoma of the colon and its relationship with clinicopathological parameters

WANG Haigang, XIE Hongmei, HAN Xue, ZHANG Lixian, ZHAO Wenzeng

(SecondDepartmentofGeneralSurgery,GeneralHospitalofNorthChinaPetroleumAdministration,Renqiu,Hebei, 062552)

Objective To study of primary colorectal adenocarcinoma histone H2B single prime generalization (uH2B) and its relationship with clinicopathological parameters.Methods Colonic cancer tissue samples and para-carcinoma tissue of gastrointestinal surgery resection of 83 cases were selected from January 2013 to January 2016 in our hospital, and normal colon tissue of 20 cases was collected, and uH2B protein expression level in tissue samples was observed using immunohistochemical staining, and its relationship with clinical pathological parameters of patients with primary colonic carcinoma was analyzed.Results The positive expression rate of uH2B protein in colon cancer tissues was 46.99%, which was lower than 83.13% of adjacent tissues and 90.00% in normal colon mucosa, the differences were statistically significant (P<0.05); But there was no significant difference in the positive expression of uH2B protein in adjacent tissues and normal colonic mucosa (P>0.05); The positive expression rate of tumor uH2B protein in colon cancer tissues in the TNM stage was correlation with degree of differentiation and lymph node metastasis (P<0.05), and it had no significant relationship with the patient′s age, gender, tumor invasion depth, tumor size (P>0.05).Conclusion The decreased expression rate of uH2B protein in colon carcinoma tissue is correlated with the TNM stage, differentiation degree and lymph node metastasis of the patients.

primary adenocarcinoma of the colon; generalization of histone H2B; clinical pathological parameters

2016-12-22

中國(guó)石油華北油田礦區(qū)臨床醫(yī)學(xué)研究項(xiàng)目(2011-HB-G27-3)

R 735.3

A

1672-2353(2017)09-099-04

10.7619/jcmp.201709025