冷洪銳，孔繁菲，馬曉欣

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng)110004）

miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義

冷洪銳，孔繁菲，馬曉欣

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng)110004）

目的探討子宮內(nèi)膜癌中miR-135a-5p的表達(dá)及意義。方法收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科2016年手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌組織55例以及對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本30例，運(yùn)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌組織以及正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及意義。結(jié)果子宮內(nèi)膜癌組織中miR-135a-5p的表達(dá)水平低于正常子宮內(nèi)膜組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.021）；miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與腫瘤的分化程度有關(guān)（P=0.008）；結(jié)論miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌中低表達(dá)并且與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

miR-135a-5p；子宮內(nèi)膜癌；表達(dá)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)高發(fā)惡性腫瘤之一。占女性惡性腫瘤的第4位［1］。近年發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。因此新的腫瘤標(biāo)記物對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的診斷及治療有重要意義。研究［2-3］表明，miRNAs參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的行為。其中，miR-135a-5p已被證實(shí)與膽囊癌［4］、腎透明細(xì)胞癌［5］、肝癌［6］等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而其在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未報(bào)導(dǎo)。本研究采用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，探討其在子宮內(nèi)膜癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本55例及對(duì)照組正常內(nèi)膜組織標(biāo)本30例。高/中分化癌48例、低分化癌7例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤(rùn)者3例，無(wú)轉(zhuǎn)移者52例。按2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)分期：Ⅰ期47例，Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期8例。子宮內(nèi)膜癌患年齡＞60歲20例，≤60歲35例。肌層浸潤(rùn)≥1/2肌層18例，＜1/2肌層37例；Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌（雌激素受體依賴型）51例，Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌（非雌激素受體依賴型）4例。55例子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本中，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)任何放化療或分子靶向治療。對(duì)照組組織標(biāo)本均取自因子宮內(nèi)膜息肉行宮腔鏡手術(shù)的子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，經(jīng)病理證實(shí)無(wú)子宮內(nèi)膜病變。

研究均征得患者及家屬同意，簽署知情同意書(shū)。手術(shù)切除的標(biāo)本立即放入液氮中保存，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存以供實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器

Trizol，Mir-X?miRNA First-Strand Synthesis和SYBR?Premix Ex Taq?ⅠⅡ均購(gòu)自TaKaRa公司。miR-135a-5p引物生工公司設(shè)計(jì)并合成，以U6為內(nèi)參，引物序列為U6上游序列：5’-GGAACGATACA GAGAAGATTAGC-3’；下游序列：5’-TGGAACG CTTCACGAATTTGCG-3’；miR-135a-5p：5’-GCCTA TGGCTTTTTATTCCTATGT-3’。

1.3 實(shí)時(shí)PCR

1.3.1 提取總RNA：取60 mg冰凍的子宮內(nèi)膜癌組織加1 mL rizol，嚴(yán)格按RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)提取組織中的總RNA。利用分光光度計(jì)測(cè)量提取的RNA吸光值，計(jì)算濃度，所有標(biāo)本總RNA吸光度的比值（A260/A280）均為1.8～2.1，表明RNA純度好。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄總RNA：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板分別對(duì)miR-135a-5p基因進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。實(shí)時(shí)PCR按照SYBR Green說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系。mRQ Buffer（2×）5 μL，RNA樣本（0.25～8 μg）3.75 μL，mRQ酶1.25 μL；反應(yīng)條件為37℃1 h，85℃5 min。

1.3.3 miR-135a-5p的實(shí)時(shí)PCR：PCR反應(yīng)體系（20 μL）為SYBR PremixExTaqⅡ（2×）10μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL；反應(yīng)條件為95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，每個(gè)反應(yīng)均設(shè)置復(fù)孔，求平均Ct值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。得到miR-135a-5p基因以及內(nèi)參基因U6的相對(duì)表達(dá)量，采用2-△△CT進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以x±s表示，子宮內(nèi)膜癌組織及正常內(nèi)膜組織中miR-135a-5p的表達(dá)量采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法分析，miR-135a-5p與臨床病理資料之間的關(guān)系采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-135a-5p在不同類型子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌組織中及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量分別為7.640±15.524和31.678±56.654，miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-135a-5p在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況Fig.1 The expression of miR-135a-5p in different endometrial tissue types

2.2 miR-135a-5p的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

將子宮內(nèi)膜癌組織中miR-135a-5p的表達(dá)水平與臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織中miR-135a-5p的表達(dá)與腫瘤的分化程度顯著相關(guān)（P＜0.05），且分化程度越高的子宮內(nèi)膜癌組織中miR-135a-5p的表達(dá)水平越高；但是子宮內(nèi)膜癌組織中miR-135a-5p的表達(dá)與患者臨床分期、病理類型、性別、年齡、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是一個(gè)發(fā)病過(guò)程復(fù)雜，伴隨著遺傳和表觀遺傳的改變［7］。雖然期別較早的患者5年生存率逐漸升高，但分化程度差，侵襲性高的子宮內(nèi)膜癌，預(yù)后不良，占到內(nèi)膜癌死亡率的40%。基因芯片的研究已經(jīng)確定了一些miRNAs調(diào)控了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，為進(jìn)一步了解子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

表1 子宮內(nèi)膜癌中miR-135a-5p的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（Tab.1 Correlation between miR-135a-5p expression and clinicopathological characteristics of endometrial carcinoma（x±s）

表1 子宮內(nèi)膜癌中miR-135a-5p的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（Tab.1 Correlation between miR-135a-5p expression and clinicopathological characteristics of endometrial carcinoma（x±s）

ER，estrogen receptor；PR，progestogen receptor.

Chinico pathological characteristicnExpression level of miR-135a-5pP Age（year）0.707≤60355.112±10.730＞60204.164±7.746 Surgical/pathologic stage 0.137Ⅰ474.744±7.303Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ824.655±33.489 Histological differentiation 0.008 High/moderate485.459±10.560 Poor70.751±0.958 Depth of infiltration 0.559＜1/2374.047±5.425≥1/2186.246±15.239 Lymph node metastasis and vascular invasion 0.681 No524.647±9.830 Yes36.851±7.870 Type of pathology 0.669Ⅰ514.688±9.903Ⅱ4 6.940±7.684 ER 0.669 + 514.688±9.903 -4 6.940±7.684 PR 0.868 + 494.865±10.091 -5 4.303±6.525

microRNAs是一類非編碼小RNA，由17～25個(gè)核苷酸組成。miRNAs綁定位于3’非翻譯區(qū)的特定靶mRNA的部分互補(bǔ)序列，導(dǎo)致mRNA降解和翻譯抑制［8］。miRNAs參與一系列細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡等生物學(xué)過(guò)程。癌基因與抑癌基因的異常表達(dá)與動(dòng)態(tài)平衡丟失通常導(dǎo)致腫瘤的形成和癌癥的發(fā)展［9］。

近年來(lái)的研究［10-15］表明，miRNA在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的不同階段，其表達(dá)譜存在明顯異常，如miR-27，miR-203，miR-205，miR-141和miR-200在子宮內(nèi)膜癌中上調(diào)，而miR-30c，miR-101，miR-449，miR-143和miR-145表達(dá)下調(diào)。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了miRNAs在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的重要性。miR-135a是RNA-135家族的重要成員，基因位于第3號(hào)染色體（p21.1）。miR-135 a在經(jīng)典的霍奇金淋巴瘤和胃癌中起抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用［16-17］，miR-135a在乳腺癌［18］、肝癌［6］中高表達(dá)。ZHOU等［4］研究表明，miR-135a-5p在膽囊癌中明顯抑制在體外和體內(nèi)的癌細(xì)胞增殖。MULLER等［5］研究表明，miR-135a-5p在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，起抑制因子作用。然而miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未報(bào)導(dǎo)。

本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌組織中相對(duì)表達(dá)量低于正常子宮內(nèi)膜組織（P＜0.05），這一結(jié)果提示miR-135a-5p可能作為抑癌基因參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其與組織病理學(xué)分級(jí)有關(guān)，高/中分化的子宮內(nèi)膜癌患者中其表達(dá)量明顯高于低分化（P＜0.05），這也進(jìn)一步提示miR-135a-5p在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展過(guò)程中扮演的很可能是抑癌基因的角色。與上述報(bào)導(dǎo)中提出的miR-135a-5p能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移的觀點(diǎn)一致。

綜上所述，miR-135a-5p與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系，并且其表達(dá)與組織學(xué)分化程度存在相關(guān)性，而探究其具體的作用機(jī)制將成為進(jìn)一步的研究重點(diǎn)，并將為子宮內(nèi)膜癌的早期發(fā)現(xiàn)及有效治療提供新思路。

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（編輯 于溪）

Expression and Significance of miR-135a-5p in Endometrial Carcinoma

LENG Hongrui，KONG Fanfei，MA Xiaoxin

（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the expression and significance of miR-135a-5p in endometrial carcinoma and to correlate expression levels with clinicopathological features.MethodsFifty five endometrial carcinoma samples and thirty normal endometrial tissue samples were surgically obtained，and the expression of miR-135a-5p was quantitated by real-time polymerase chain reaction.The relationship between the expression level of miR-135a-5p and clinicopathological data of individual patients was analyzed.ResultsThe expression of miR-135a-5p was lower in the endometrial carcinoma group than in the normal endometrial group（P=0.021），and correlated significantly with the histologic grade of the endometrial neoplasm（P=0.008）.ConclusionThe expression of miR-135a-5p is lower in endometrial carcinoma than in normal endometrial tissue.In endometrial carcinoma，the miR-135a-5p expression status has a statistically significant relationship with the histological characteristics of the tumor.

miR-135a-5p；endometrial carcinoma；expression

R737.33

A

0258-4646（2017）06-0485-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472438，81272874）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2013225079）

冷洪銳（1987-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

馬曉欣，E-mail：maxiaoxin666@aliyun.com

2017-01-24

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