黃橋華 郭曉靜 劉小云

葉下珠抑制人腎癌786-0細(xì)胞增殖作用的研究※

黃橋華 郭曉靜 劉小云

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房，贛州341000）

目的觀察葉下珠提取物對人腎癌786-0細(xì)胞增殖抑制作用并探討葉下珠提取物發(fā)揮該作用的機(jī)制，為葉下珠的臨床應(yīng)用更進(jìn)一步的提供理論依據(jù)。方法用不同濃度的葉下珠（濃度分別為1、10、100、1000 μg/m L）作用于人腎癌786-0細(xì)胞株，采用CCK-8法檢測葉下珠對腎癌786-0細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測葉下珠對腎癌786-0細(xì)胞周期的影響，采用蛋白印跡法檢測葉下珠對Survivin蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果CCK-8法結(jié)果提示，不同濃度的葉下珠均可顯著抑制腎癌786-0細(xì)胞的增殖，且抑制率呈時間、劑量依賴關(guān)系。FCM檢測發(fā)現(xiàn)葉下珠可使腎癌786-0細(xì)胞周期中的G0/G1期比例增加，S期縮短。蛋白印跡法顯示，葉下珠可使腎癌786-0細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平降低。結(jié)論通過建立人腎癌786-0細(xì)胞的體外抗腫瘤實驗?zāi)Ｐ停A(yù)試驗結(jié)果表明葉下珠乙醇提取物對人腎癌786-0細(xì)胞增殖具有抑制作用。

葉下珠；腎細(xì)胞癌；786-0細(xì)胞增殖；抑制作用

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）簡稱腎癌，約占所有惡性腫瘤的2%。腎癌是最為耐藥的惡性腫瘤之一，對化療和放療均不敏感，目前公認(rèn)手術(shù)仍是治療的唯一有效方法，因此進(jìn)一步探索更有效的腎癌治療藥物成為醫(yī)藥學(xué)界的研究熱點之一[1]。中藥或天然藥物毒副作用小、具有悠久的民間應(yīng)用歷史，已成功開發(fā)的藥物有紫杉醇、喜樹堿類等，因此從中草藥中開發(fā)高效、低毒的抗腫瘤藥物具有重要意義。本研究主要觀察葉下珠提取物對人腎癌786-0細(xì)胞增殖抑制作用并探討葉下珠提取物發(fā)揮該作用的機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料用不同濃度的葉下珠（濃度分別為1、10、100、1000 μg/m L）作用于人腎癌786-0細(xì)胞株。

1.2 研究方法采用CCK-8法檢測葉下珠對腎癌786-0細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測葉下珠對腎癌786-0細(xì)胞周期的影響，采用蛋白印跡法檢測葉下珠對Survivin蛋白表達(dá)水平的影響。葉下珠不同溶劑萃取部位經(jīng)培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，于不同時間點用MTT法觀察不同濃度的各提取部位對腎癌786-0細(xì)胞的增殖抑制作用，篩選出具有抗腫瘤活性的有效部位提取物。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同時間、不同濃度行重復(fù)測量方差分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的葉下珠對786-0細(xì)胞增殖的影響CCK-8法結(jié)果提示，不同濃度的葉下珠均可顯著抑制腎癌786-0細(xì)胞的增殖，且抑制率呈時間、劑量依賴關(guān)系。FCM檢測發(fā)現(xiàn)葉下珠可使腎癌786-0細(xì)胞周期中的G0/G1期比例增加，S期縮短。

表1 不同濃度的葉下珠對786-0細(xì)胞增殖的影響

2.2 葉下珠對786-0細(xì)胞周期的影響FCM檢測發(fā)現(xiàn)葉下珠可使腎癌786-0細(xì)胞周期中的G0/G1期比例增加，S期縮短。蛋白印跡法顯示，葉下珠可使腎癌786-0細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平降低。

表2 葉下珠對786-0細(xì)胞周期的影響

3 討論

葉下珠（Phyllamhus urinaria Linn）為大戟科植物葉下珠的帶根全草，葉下珠別名為珍珠草、珠子草、葉下珍珠等十多種名稱[2]。主要分布于長江以南各省區(qū)，傳統(tǒng)功效用于腎炎水腫，泌尿系感染、結(jié)石，腸炎，痢疾，眼角膜炎，黃疸型肝炎等[3]。自從20世紀(jì)90年代，Pettit CR等在研究中發(fā)現(xiàn)有葉下珠分離的一些木脂素對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用后，葉下珠對腫瘤細(xì)胞的抑制作用受到各國學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。近年來國內(nèi)外報道葉下珠能夠抑制肝癌細(xì)胞生長和抗乙肝病毒方面的研究較多，但至今國內(nèi)外尚未見葉下珠對人腎癌的抗腫瘤活性的報道[5]?；谌~下珠用于腎炎水腫，泌尿系感染、結(jié)石等泌尿系統(tǒng)疾病的傳統(tǒng)功效和天然藥物毒副作用小的優(yōu)點，激發(fā)我們對其治療腎癌的思考和探討，本項目擬以人腎癌786-0細(xì)胞作為體外抗腫瘤實驗?zāi)Ｐ停捎肕TT法考察葉下珠提取物對人腎癌786-0細(xì)胞的體外抗腫瘤活性，同時探討其作用機(jī)制，為進(jìn)一步擴(kuò)展葉下珠化學(xué)成分、藥理機(jī)理的研究以及葉下珠新產(chǎn)品開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，在選題上具有創(chuàng)新性，值得深入探討。

葉下珠味微苦、甘，性涼。歸肝、肺二經(jīng)[6]。具有清熱平肝，解毒清腫功效。腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma），簡稱腎癌，是由腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，故又稱腎腺癌，是腎臟最常見的惡性腫瘤（占腎臟惡性腫瘤的85%）[7]。腎細(xì)胞癌早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時腫瘤體積已較大[8]。腰痛、腎區(qū)腫塊和血尿為具有診斷意義的三個典型癥狀，但三者同時出現(xiàn)的比例很小[9]。無痛性血尿是腎癌的主要病變，血尿常為間歇性，早期可僅表現(xiàn)為鏡下血尿[10]。腫瘤可產(chǎn)生異位激素和激素樣物質(zhì)，患者可出現(xiàn)多種副腫瘤綜合征，如紅細(xì)胞增多癥、高鈣血癥、庫欣綜合征和高血壓等。本組資料顯示，通過建立人腎癌786-0細(xì)胞的體外抗腫瘤實驗?zāi)Ｐ?，預(yù)試驗結(jié)果表明葉下珠乙醇提取物對人腎癌786-0細(xì)胞增殖具有抑制作用。

[1]張旖驍，吳斌.miR-497與腎癌預(yù)后的關(guān)系及其對腎癌786-0細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響[J].中國病理生理雜志，2016，32(11)：1979-1983.

[2]劉侃，趙超飛，陳建文，等.硒蛋白PP1(SEPP1)過表達(dá)抑制786-0和769-P人腎癌細(xì)胞增殖并引起G2/M期阻滯[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2016，14 (6)：764-769.

[3]趙建通，張磊，劉文瞻，等.姜黃素與索拉非尼聯(lián)合對人腎癌細(xì)胞株786-0增殖抑制作用的體外研究[J].河北醫(yī)藥，2016，12(4)：495-498.

[4]袁海鑫，辛士永，肖飛，等.沉默PDCD4對786-0細(xì)胞增殖能力的影響[J].吉林醫(yī)學(xué)，2016，25(2)：261-263.

[5]吳瑞環(huán)，張振凌，王瑞生，等.千金子炮制前后對人腎癌786-0細(xì)胞增殖及特異抗原G250基因表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，18(1)：306-309.

[6]Bin Xu，Yunfeng He，Xiaohou Wu，Chunli Luo，Anquan Liu，Jun Zhang.Exploration of the Correlations Between Interferon-γ in Patient Serum and HEPACAM in Bladder Transitional Cell Carcinoma，and the Interferon-γ MechanismInhibitingBIU-87Proliferation[J].TheJournalofUrology.2012,188 (4):1346-1353.

[7]Taira，Naoe，Mimoto，Rei，Kurata，Morito，Yamaguchi，Tomoko，Kitagawa，Masanobu，Miki，Yoshio，Yoshida，Kiyotsugu.DYRK2 priming phosphorylation of c-Jun and c-Myc modulates cell cycle progression in human cancer cells[J].Journal ofClinical Investigation,2012 122(3):859-872.

[8]Huiming Lv，Huiya Zhang，Jiaolei Wu，Yongmei Guan.Effect of plasmidmediated stable interferon-γ expression on proliferation and cell death in the SKOV-3humanovariancancercellline[J].ImmunopharmacologyandImmunotoxicology.2011,33(3):498-503.

[9]Chunhua Xun，Chunli Luo，Xiaohou Wu，Qiaolin Zhang，Ling Yan，Shali Shen.Expression of hepaCAM and Its Effect on Proliferation of Tumor Cells in Renal Cell Carcinoma[J].Urology.2010,75(4):828-834.

[10]Xiao-Ling Guo，Ling Pan，Xue-Jun Zhang，Xiao-Hui Suo，Zhi-Yun Niu，Jing-Yu Zhang，F(xiàn)uxu Wang，Zuo-Ren Dong，Wanming Da，Ruzo Ohno.Expression and mutation analysis of genes that encode the Myc antagonists Mad1，Mxi1 and Rox in acute leukaemia[J].Leukemia&Lymphoma.2009, 48(6):1200-1207.

Inhibitory Effect of Phyllanthus Urinaria on the Proliferation of Human Renal Carcinoma Cell Line 786-0

HUANG Qiaohua,GUO Xiaojing,LIU Xiaoyun
(Pharmacy of Traditional Chinese Medicine,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Jiangxi Province, Ganzhou 341000,China)

Objective To observe the effect of Phyllanthus extract on proliferation of human renal cell carcinoma 786-0 cells,and to investigate the mechanism of the inhibitory effect of Phyllanthus extract,and to provide theoretical basis for further clinical application.Methods Different concentrations of Phyllanthus urinaria(concentrations of 1,10,100,1000 g/m L)in human renal cell carcinoma 786-0 cell line,CCK-8 method was used to detect the effect of Phyllanthus effect on proliferation of renal cell carcinoma 786-0 cells,using flow cytometry(FCM)detection effect of Phyllanthus on renal cell carcinoma 786-0 cell cycle effect of Phyllanthus, detection on the expression of Survivin protein by Western blot.Results The results of CCK-8 showed that different concentrations of Phyllanthus significantly inhibited the proliferation of 786-0 cells,and the inhibition rate was time and dose dependent.FCM detected that Phyllanthus can make renal carcinoma 786-0 cell cycle in G0/phase G1 was increased,and S shortened.Western blot showed the level of p.urinaria,reduces the expression of Survivin protein in renal cell carcinoma 786-0 cells.Conclusion The establishment of experimental model of human renal cell carcinoma 786-0 cells in vitro anti pre test results showed that the ethanol extract of Phyllanthus has inhibitory effect on the proliferation of human renal cell carcinoma 786-0 cells.

Phyllanthus urinaria;renal cell carcinoma;786-0 cell proliferation;inhibition

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.11.064

1672-2779（2017）-11-0145-02

：楊杰本文校對：賴玉中

2017-02-26）

江西省衛(wèi)生計生委科技計劃項目【No.20165365】