劉 佳，徐繼嗣，羅秋玲，陳修來，劉立明

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇無錫214122；2.張家港市華天制藥有限公司，江蘇張家港215633)

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谷氨酸氧化酶高產(chǎn)菌株的篩選鑒定及催化生產(chǎn)α-酮戊二酸

劉 佳1，徐繼嗣2，羅秋玲1，陳修來1，劉立明1

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇無錫214122；2.張家港市華天制藥有限公司，江蘇張家港215633)

采用簡易的偶聯(lián)終點(diǎn)顯色反應(yīng)(Trinder顯色反應(yīng))，從土壤中分離出高產(chǎn)谷氨酸氧化酶(LGOX)的菌株不透明紅球菌RhodococcusopacusFMME1-41，并對此菌株的產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：該菌株所產(chǎn)LGOX主要分泌在發(fā)酵液中，對L-谷氨酸具有較強(qiáng)的底物專一性，最適pH 6.5，最適溫度為35 ℃，Mn2+是該酶的激活劑。通過發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，培養(yǎng)30 h時LGOX活力達(dá)到6.4 U/mL。利用該酶轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸，在最佳轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化20 h，α-酮戊二酸產(chǎn)量達(dá)到91.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為91.8%，α-KG生產(chǎn)強(qiáng)度為4.56 g/(L·h)。

L-谷氨酸氧化酶；不透明紅球菌；α-酮戊二酸；酶法轉(zhuǎn)化

α-酮戊二酸(α-KG) 是三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝中重要的二元羧酸，能為人體和動物提供營養(yǎng)，具有特殊的生理功能，在醫(yī)藥、食品、精細(xì)化工等領(lǐng)域[1-2]被廣泛應(yīng)用。通過菌株篩選、過程優(yōu)化和代謝工程改造，發(fā)酵法生產(chǎn)α-KG已經(jīng)有了很大進(jìn)展。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α-KG的菌種包括[3]：熒光假單胞菌(Pesudomonasfluorescens)、沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacterparaffineus) 和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)等細(xì)菌以及光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)、解脂亞洛酵母(Yarrowialipolytica)等真菌。光滑球擬酵母利用葡萄糖發(fā)酵64 h時可積累43.7 g/L α-KG[4]；以廉價甘油為碳源Y.lipolytica發(fā)酵117 h積累186 g/L α-KG[5]，由于該法存在發(fā)酵周期長、雜酸副產(chǎn)物過多、下游產(chǎn)品分離純化困難等諸多的生產(chǎn)瓶頸問題，尚未實(shí)現(xiàn)α-KG發(fā)酵的工業(yè)化。

近年來，國內(nèi)L-谷氨酸鈉存在產(chǎn)能過剩現(xiàn)象，亟待尋找解決方法。根據(jù)L-谷氨酸與α-KG結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可將L-谷氨酸中氨基氧化為酮基生成α-KG，實(shí)現(xiàn)L-谷氨酸的高值化和α-KG的清潔和可持續(xù)生產(chǎn)。目前，用于生產(chǎn)α-KG的酶制劑主要包括L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,LAAO,EC1.4.3.2)和L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase,LGOX,EC1.4.3.11)兩種。兩者均能催化氧化L-谷氨酸生成α-KG，同時生成NH3和H2O2[6]。LAAO都以非共價結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶，除了來自海單胞菌(Marinomonasmediterranea) 的賴氨酸氧化酶[7]外，大多數(shù)LAAO具有廣泛的底物譜[8]。LGOX在轉(zhuǎn)化過程中不需要外源添加輔因子，對L-谷氨酸有很強(qiáng)的底物專一性。LOGX本身也是一種具有應(yīng)用價值的工具酶，應(yīng)用于制備疾病診斷試劑盒和生物傳感器中的酶膜[9-10]。LGOX主要存在于鏈霉菌屬中，1983年，Kamei等[11]首次在淺紫鏈霉菌(Streptomycesviolascens)中發(fā)現(xiàn)了能專一性氧化L-谷氨酸的LGOX，但酶活低導(dǎo)致其實(shí)用價值不高。同年Kusakabe等[12]在Streptomycessp.X-119-6中發(fā)現(xiàn)了底物專一性更高且耐熱的LGOX。隨后，Bohmer等[13]從內(nèi)涂鏈霉菌中分離純化出對L-谷氨酸完全特異的由2個亞基構(gòu)成的LGOX，并對該酶的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，該酶穩(wěn)定性好，實(shí)用性較強(qiáng)，只有Ag+和Hg2+能夠抑制其活性。之后Arima等[14]對Streptomycessp.X-119-6中的LGOX晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，通過與LAAO蛋白序列和晶體結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，蛋白活性部位在蛋白中心、底物和產(chǎn)物進(jìn)出通道較窄以及活性部位殘基不同造成底物專一性強(qiáng)。目前，盡管已有多株產(chǎn)LGOX的微生物菌株，但其產(chǎn)酶能力都很低，不具備工業(yè)應(yīng)用潛質(zhì)。

本研究通過自主篩選獲得1株高產(chǎn)LGOX的不透明紅球菌RhodococcusopacusFMME1-41，對LGOX酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上利用發(fā)酵粗酶液轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-KG，為酶法轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG提供新的菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

味精廠廢水廢物排放處的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨5，味精10。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉1，大豆蛋白胨0.3，葡萄糖5，味精2.5，NaCl 5，KH2PO43。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5，胰蛋白胨2，(NH4)2SO42，葡萄糖25，K2HPO40.5，KH2PO40.8，MgSO40.5，MnSO40.1，味精2.5。

以上培養(yǎng)都在115 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

菌株經(jīng)斜面活化后接種于裝液量25 mL的250 mL三角瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)18 h，然后按照8%的接種量接種至裝液量50 mL的250 mL三角瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)30～35 h。

1.2.2 產(chǎn)酶菌株的篩選

1)菌株的初步分離純化。從味精廠廢水廢物排放的土壤中多地點(diǎn)取樣，放置于無菌袋中。稱取樣品1 g碾碎，溶解于含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的10 mL無菌培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，梯度稀釋涂布于固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

2)產(chǎn)酶菌株初篩。將培養(yǎng)的單菌落點(diǎn)種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，于30 ℃下培養(yǎng)36 h。根據(jù)Trinder反應(yīng)[15]，將反應(yīng)液均勻噴灑至平板表面，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置觀察，出現(xiàn)紫紅色的菌落即為LGOX生產(chǎn)菌株。挑取變色圈直徑大、顏色深、顯色快的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

3)產(chǎn)酶菌株復(fù)篩。將初篩菌株在裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng)，在30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)36 h時間后，離心取上清液按照酶活測定方法于96孔板做顯色反應(yīng)，測定其LGOX酶活力，酶活最高菌種即為目的菌株。

1.2.3 酶活檢測方法

LGOX酶活性測定通過Trinder反應(yīng)(4-氨基安替比林體系) 測定[15-16]。1 U LGOX酶活定義：在37 ℃條件下每分鐘反應(yīng)生成1 μmol H2O2所需的酶量。

過氧化氫酶活測定參照文獻(xiàn)[17]，1 U過氧化氫酶活定義：在37 ℃條件下每分鐘分解1 μmol H2O2所需酶量為1個酶活單位。

1.2.4 菌種鑒定方法

1)菌落形態(tài)與生理生化實(shí)驗。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》對篩選菌株進(jìn)行菌落形態(tài)和生理生化鑒定。

2)16S rDNA序列分子生物學(xué)鑒定。16S rDNA序列測定和分析參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行，按照細(xì)菌基因組提取方法提取篩選菌株基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物(16S rDNA-F:5′-AGAGTTTGAI,CCTGGCTCAG-3′、16S rDNA-R:5′-TACGGCIACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增16S rDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測的陽性擴(kuò)增片段送至生工生物工程(上海)有限公司測序。將所得序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST分析比對。

1.2.5 LGOX的細(xì)胞定位與酶學(xué)性質(zhì)

使用分子量2.0×104超濾膜對發(fā)酵上清液進(jìn)行濃縮，使用脫鹽柱脫鹽后，凍干即得到粗酶粉。LGOX的進(jìn)一步純化與酶學(xué)性質(zhì)測定參照文獻(xiàn)[16,19]中相關(guān)方法進(jìn)行。

1.2.6 轉(zhuǎn)化條件

轉(zhuǎn)化體系中添加一定體積的上清液，一定濃度L-谷氨酸鈉、H2O2酶和金屬離子，調(diào)節(jié)pH為6.5，于裝液量50 mL的500 mL三角瓶中，在35 ℃、200 r/min條件下轉(zhuǎn)化20 h。

1.2.7 LGOX底物譜測定

酶活檢測的顯色液中的L-谷氨酸鈉用不同氨基酸代替，按照酶活測定的方法測定LGOX針對不同底物的酶活。結(jié)果以L-谷氨酸為底物測定的活性定義為100%，得到不同底物的相對活性。

1.2.8 α-KG和琥珀酸濃度測定方法

α-KG和琥珀酸利用高效液相色譜(HPLC)測定[20]。色譜柱為Aminex HPX-87H，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，溫度為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測器為紫外檢測器。

2 結(jié)果與討論

2.1 平板顯色反應(yīng)篩選LGOX高產(chǎn)菌株

將分離菌株點(diǎn)種于平板中，根據(jù)Trinder反應(yīng)，挑取顯色快、變色圈直徑大的79株菌株。將79株菌株進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩驗證，有3株產(chǎn)酶能力超過1.0 U/mL。進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗，最終確定菌株FMME1-41為最佳產(chǎn)酶菌株，測得LGOX酶活為2.9 U/mL。

2.2 產(chǎn)酶菌株菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)與培養(yǎng)特征

FMME1-41的菌落形態(tài)和電鏡圖片如圖1。由圖1可知：在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上，菌株FMME1-41菌落呈紅色(圖1(a))，圓形不透明，表面光滑，邊緣整齊。顯微鏡下顯示細(xì)胞形態(tài)為球狀和短桿狀，不產(chǎn)芽孢(圖1(b))；革蘭氏染色為陽性(圖1(c))。

圖1 FMME1-41的菌落形態(tài)與電鏡照片F(xiàn)ig.1 The phenotypes and electron microscope images of FMME1-41

2.2.2 生理生化特征鑒定結(jié)果

篩選菌株的生理生化特性，如表1所示。由表1可知：該菌株不能液化明膠，不能水解淀粉，接觸酶試驗陽性、V-P試驗陽性、甲基紅反應(yīng)陰性、能還原硝酸鹽，可以利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖多種碳源生長。

表1 篩選菌株生理生化特征

注：“+”為陽性；“-”為陰性。

2.2.3 16S rDNA鑒定結(jié)果

以基因組DNA為模板，以細(xì)菌鑒定16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶大小為1 000～2 000 bp(圖2)。16S rDNA 測序結(jié)果為1 461 bp，將該序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，得到親緣關(guān)系最近的菌種為Rhodococcusopacus，同源性達(dá)99%，確定篩選菌株為不透明紅球菌，命名為R.opacusFMME1-41。

M為標(biāo)準(zhǔn)DNA；1～2為菌株FMME1-41的PCR結(jié)果圖2 16S rDNA PCR陽性克隆鑒定電泳圖Fig.2 PCR amplification fragment of FMME1-41 16S rDNA

2.3 FMME1-41生產(chǎn)LGOX的發(fā)酵過程與細(xì)胞定位

采用單因素和正交實(shí)驗對發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源和金屬離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5，胰蛋白胨2，(NH4)2SO42，葡萄糖25，K2HPO40.5，KH2PO40.8，MgSO40.5，MnSO40.1。R.opacusFMME1-41發(fā)酵產(chǎn)酶過程曲線如圖3。由圖3可知：LGOX酶活與菌體生長是同步的，隨著菌濃增加酶活不斷增加，發(fā)酵30 h，LGOX酶活達(dá)到6.4 U/mL，酶活比優(yōu)化前提高了1.2倍，此時上清液酶活與菌體酶活的比例為5.8∶ 0.6(29∶ 3)。由此可以看出，90%的LGOX分泌表達(dá)至細(xì)胞外，10%存在于細(xì)胞內(nèi)，該菌生產(chǎn)的LGOX屬于胞外酶。

圖3 R. opacus FMME1-41發(fā)酵生產(chǎn)LGOX 過程變化曲線Fig.3 Growth curves of R.opacus FMME1-41 fermentation for LGOX production

2.4 LGOX的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 LGOX酶液底物譜

將適量粗提酶粉溶于去離子水中，考察LGOX對底物專一性，結(jié)果見表2。由表2可知：該酶對L-谷氨酸催化酶活較高，對L-谷氨酰胺和L-組氨酸相對于L-谷氨酸分別具有7.8%和3.4%的相對酶活，余下氨基酸作為底物時并沒有檢測到酶活。同時，該酶催化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG不需要添加FAD，且對L-谷氨酸具有較強(qiáng)的底物專一性。

表2 LGOX底物譜檢測

2.4.2 LGOX的最適pH

考察不同pH對LGOX活性的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：R.opacusFMME1-41生產(chǎn)的LGOX在pH 6.0～7.0時，可以維持86%以上的酶活，而pH為6.5時相對酶活最高。由此，可以推斷LGOX的最適pH為6.5。

圖4 不同pH對LGOX酶活的影響Fig.4 Effects of different pH on LGOX production

2.4.3 LGOX最適溫度與溫度穩(wěn)定性

考察溫度對LGOX活性的影響及LGOX的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖5和圖6。由圖5和圖6可知：該酶最適溫度為35 ℃，在30～40 ℃可以維持80%以上的酶活，具有較寬的溫度穩(wěn)定性。將粗酶液在4 ℃保溫在0～12 h時，酶活沒有顯著變化，繼續(xù)放置7 d后酶活損失13%，30 d后酶活損失40%；在35和50 ℃條件下放置20 h，酶活分別損失15%和78%。綜上可知，LGOX在低溫和最適溫度下較穩(wěn)定。

圖5 不同溫度對LGOX酶活的影響Fig.5 Effects of different temperatures on LGOX production

圖6 不同溫度下LGOX的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of LGOX under different temperature

2.5 LGOX轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG

2.5.1 H2O2酶加量對LGOX轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG的影響

LGOX在催化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG的反應(yīng)中，會生成H2O2，H2O2會抑制LGOX的酶活，并且可以將酮戊二酸氧化生成琥珀酸。R.opacusFMME1-41發(fā)酵液中含有分泌表達(dá)的H2O2酶，但是酶活偏低(8.2～11.0 U/mL)，因此轉(zhuǎn)化體系中需要額外添加H2O2酶。在L-谷氨酸投料50 g/L、LGOX酶活3.0 U/mL條件下，考察H2O2酶加量對LGOX轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知：不添加H2O2酶時，琥珀酸積累13.2 g/L，α-KG產(chǎn)量為20.4 g/L；α-KG產(chǎn)量隨著H2O2酶加量增加而增加。當(dāng)添加H2O2酶是LGOX酶活120倍時，H2O2被及時分解，此時轉(zhuǎn)化液中幾乎檢測不到琥珀酸，α-KG產(chǎn)量達(dá)39.8 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為80.1%。

圖7 不同H2O2酶加量對LGOX轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-KG的影響Fig.7 Effects of catalase concentration on the production of α-KG production by LGOX transformation

2.5.2 金屬離子對LGOX轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG的影響

考察不同金屬離子對LGOX生產(chǎn)α-KG的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知：Zn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+和Ag+對LGOX酶具有抑制作用；K+、Mg2+對轉(zhuǎn)化幾乎沒有影響；Mn2+對轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用，在加入Mn2+條件下，α-KG產(chǎn)量比不添加Mn2+提高了9.5%。在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化時也發(fā)現(xiàn)添加Mn2+可以提高發(fā)酵液中LGOX酶活，與Niu等[21]報道Mn2+對LGOX具有激活作用一致。進(jìn)一步考察轉(zhuǎn)化體系中添加不同濃度Mn2+對生產(chǎn)α-KG的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加3 mmol/L的MnCl2時，轉(zhuǎn)化20 h，α-KG產(chǎn)量最高為45.8 g/L，此時L-谷氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為92.2%，比不添加Mn2+時產(chǎn)量提高了15.0%。

圖8 不同金屬離子和Mn2+濃度對LGOX 生產(chǎn)α-KG的影響Fig.8 Effects of different ions (a) and different concentration of Mn2+ (b) on α-KG production by LGOX transformation

2.5.3 L-谷氨酸濃度對LGOX轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-KG的影響

在轉(zhuǎn)化體系中添加3 U/mL LGOX、360 U/mL H2O2酶、3 mmol/L MnCl2，控制pH 6.5，反應(yīng)溫度35 ℃，考察不同底物濃度的L-谷氨酸對轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-KG的影響，結(jié)果見圖9。由圖9可知：當(dāng)L-谷氨酸質(zhì)量濃度為50～100 g/L時，α-KG濃度與谷氨酸濃度正相關(guān)，谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率基本維持不變；當(dāng)谷氨酸質(zhì)量濃度高于100 g/L時，α-KG濃度不再增加，谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率迅速下降。因此，最適谷氨酸質(zhì)量濃度為100 g/L，此時α-KG產(chǎn)量為91.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為91.8%。

圖9 L-谷氨酸濃度對LGOX轉(zhuǎn)化生產(chǎn) α-KG的影響Fig.9 Effects of L-glutamate concentration on α-KG production by LGOX transformation

3 結(jié)論

利用簡易的平板顯色反應(yīng)和高通量篩技術(shù)得到1株高產(chǎn)LGOX的菌株R.opacusFMME1-41，LGOX以廉價L-谷氨酸為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-KG，不需要額外添加輔助因子，底物專一性強(qiáng)，穩(wěn)定性佳。通過發(fā)酵和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，LGOX發(fā)酵酶活提高1.2倍，達(dá)到6.4 U/mL，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-KG周期為20 h，產(chǎn)量為91.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為91.8%。本研究為獲得LGOX提供了新的菌種來源，也為利用該酶催化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG奠定了工業(yè)化的基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Screening and identification of high yield strain of glutamate oxidaseand its enzymatic production of α-ketoglutarate

LIU Jia1，XU Jisi2，LUO Qiuling1，CHEN Xiulai1， LIU Liming1

(1.State Key Laboratory of Food Science & Technology,Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.Huatian Pharmaceutical Co. Ltd.,Zhangjiagang 215633,China)

Using a simple Trinder color reaction,the high yield glutamate oxidase (LGOX) strainRhodococcusopacusFMME 1-41 was obtained from soil.The enzymatic properties ofR.opacusFMME 1-41 were studied.LGOX was an extracellular enzyme,its optimal pH was 6.5 and optimal temperature was 35 ℃.L-glutamate is specific substrate of the LGOX.LGOX could be activated by Mn2+.After medium optimization,LGOX activity could reach 6.4 U/mL for 30 h.A strategy for α-ketoglutaric acid (α-KG) production from L-glutamic acid by LGOX was developed.Under the optimal conditions,the yield of α-KG reached 91.2 g/L with the molar conversion ratio of 91.8% and production intensity 4.56 g/(L·h).

L-glutamate oxidase;Rhodococcusopacus;α-ketoglutarate; enzymatic transformation

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.03.004

2016-10-24

江蘇省科技支撐計劃社會發(fā)展項目(BE2014652)

劉 佳(1988—)，女，山東青島人，助理實(shí)驗師，研究方向：生物工程；劉立明(聯(lián)系人)，教授，E-mail:mingll@jiangnan.edu.cn

Q939.97

A

1672-3678(2017)03-0018-07