劉新歌，馬曉靜，何洪波，姚日生

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥230009)

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槐糖脂合成的廉價(jià)底物替代研究進(jìn)展

劉新歌，馬曉靜，何洪波，姚日生

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥230009)

槐糖脂是一類主要由酵母菌合成的、目前發(fā)酵水平最高的生物表面活性劑。由于其優(yōu)良的理化活性和生物活性，近些年得到了廣泛的關(guān)注。發(fā)酵成本較高是制約槐糖脂大規(guī)模應(yīng)用的最主要因素，廉價(jià)底物替代是降低其生產(chǎn)成本的有效途徑。本文中，筆者從槐糖脂的合成通路出發(fā)，對槐糖脂合成在廉價(jià)底物選擇和替代效果方面的研究進(jìn)行綜述，文中主要將廉價(jià)底物分為還原糖、脂肪酸類、烴、工業(yè)副產(chǎn)品和木質(zhì)纖維素五大類，分析各自的優(yōu)缺點(diǎn)。最后，對槐糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)行了展望，提出了木質(zhì)纖維素類材料在槐糖脂合成中的重要潛在價(jià)值。

槐糖脂；合成代謝；碳源；廉價(jià)底物

槐糖脂(sophorolipids,SLs)是一類主要由非致病性酵母菌分泌的混合物，分為酸型和內(nèi)酯型兩類[1]?；碧侵鳛橐环N新型生物表面活性劑，因其具有產(chǎn)量高、生物可降解、環(huán)境友好、抗菌、抗腫瘤活性以及低毒性等優(yōu)點(diǎn)，近年來備受關(guān)注[2-5]。

與化學(xué)表面活性劑相比，槐糖脂生產(chǎn)需要較高的生產(chǎn)成本(2～5 C=/kg)，這限制了它的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用，而生產(chǎn)成本中的10%～30%來源于發(fā)酵底物——碳源[6]?；碧侵铣芍兴峁┑奶荚捶N類不同，合成途徑也有所差異。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中親水性碳源和疏水性碳源同時(shí)存在時(shí)，槐糖脂的產(chǎn)量最高。選擇價(jià)格低廉的工農(nóng)業(yè)廢棄物替代槐糖脂合成所需的疏水性和親水性碳源是降低其成本的最有效途徑之一。更重要的是，隨著人類資源問題和環(huán)境問題的日益突出，通過微生物將廢棄資源及可再生資源轉(zhuǎn)化為生物表面活性劑及其他相關(guān)代謝產(chǎn)品，部分替代化石資源和動(dòng)植物資源，是可持續(xù)發(fā)展的必然。

圖1 以不同種類碳源為底物時(shí)槐糖脂的合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of sophorolipid with different carbon sources

目前，在槐糖脂發(fā)酵研究中，可替代碳源的廉價(jià)底物主要涉及還原糖類、脂肪酸類、烴類、工業(yè)副產(chǎn)品以及木質(zhì)纖維素五大類。由于槐糖脂生物合成途徑的不同，其結(jié)構(gòu)和積累速率有所差異，因此，不是所有的廉價(jià)底物都能帶來生產(chǎn)成本的降低。本文就相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)分析，以期為槐糖脂的應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 槐糖脂的生物合成

槐糖脂的生物合成通路如圖1所示。由圖1可知：當(dāng)?shù)孜餅檫€原糖、糖蜜、蜂蜜、甘油以及木質(zhì)纖維素等時(shí)，其均可轉(zhuǎn)化為還原糖，借助糖酵解途徑(EMP)，分解為丙酮酸，然后在丙酮酸脫羧酶的作用下生成乙酰CoA，進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)，為菌體的生長提供能量。當(dāng)?shù)孜餅闊N、醇、醛、油脂、酯化油脂、脂肪酸和酯化脂肪酸等時(shí)，均可以脂肪酸形式存在。當(dāng)培養(yǎng)基中只含有親水性底物時(shí)，乙酰CoA通過從頭合成轉(zhuǎn)化為脂肪酸；當(dāng)培養(yǎng)基中僅有疏水性底物時(shí)，脂肪酸通過β-氧化轉(zhuǎn)化為乙酰CoA；當(dāng)兩種必需物質(zhì)(活化后的葡萄糖和脂肪酸)同時(shí)存在時(shí)，脂肪酸在細(xì)胞色素P450單加氧酶(CytP450)催化下，轉(zhuǎn)化為ω-/ω-1羥基脂肪酸，并和葡萄糖在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ的作用下將1個(gè)葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到ω-/ω-1羥基脂肪酸生成葡萄糖酯，在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ的作用下和另一個(gè)葡萄糖分子生成酸型槐糖脂。最后，在乙?；D(zhuǎn)移酶/內(nèi)酯酯酶的作用下，生成乙?；幕碧侵琜7-9]。

綜上所述，盡管發(fā)酵培養(yǎng)基提供的碳源底物有所不同，但是它們最終均可轉(zhuǎn)化為活化的葡萄糖和脂肪酸，進(jìn)而開始槐糖脂的合成，但其產(chǎn)量、合成效率和生產(chǎn)成本必然會受到底物轉(zhuǎn)化路徑的影響。因此，考察和比較不同廉價(jià)底物替代效果的途徑之一就是探索底物向葡萄糖和脂肪酸轉(zhuǎn)化的途徑和效率。

2 槐糖脂合成的廉價(jià)底物替代

本文中，筆者將可用于槐糖脂發(fā)酵生產(chǎn)的廉價(jià)底物分為五類，分別是還原糖類、脂肪酸類、烴類、工業(yè)副產(chǎn)品及木質(zhì)纖維素類，并對此五類進(jìn)行綜述。

2.1 還原糖類底物

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的可用于槐糖脂合成的還原糖主要包括單糖(葡萄糖、果糖和甘露糖等)和多糖(蔗糖、乳糖、麥芽糖和棉籽糖等)兩大類。其中，葡萄糖是槐糖脂合成中最常用的親水性碳源，可與多種疏水性碳源配合用作槐糖脂發(fā)酵的復(fù)合碳源，也是槐糖脂廉價(jià)底物替代的參照對象。以還原糖為替代底物的槐糖脂合成研究情況總結(jié)于表1。由表1不難發(fā)現(xiàn)，以還原糖作為唯一碳源產(chǎn)槐糖脂的評價(jià)性研究主要集中在20世紀(jì)90年代初期[10-13]，因研究體系較簡單，并未有人對其生物合成途徑進(jìn)行系統(tǒng)的分析論證。

表1 以還原糖為替代底物的槐糖脂合成研究概覽

注：a—氮源為酵母粉(yeast extract)；b—槐糖脂產(chǎn)量由產(chǎn)率換算而得。

當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，微生物吸收培養(yǎng)基中的葡萄糖，經(jīng)EMP分解為丙酮酸，其中一部分通過糖異生途徑合成新的葡萄糖分子；另一部分在丙酮酸脫氫酶的作用下，生成乙酰CoA，部分乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)，為菌體的生長代謝提供能量，部分則通過從頭合成轉(zhuǎn)化為脂肪酸。當(dāng)以單糖(非葡萄糖)為碳源時(shí)，其合成途徑與葡萄糖相同，但槐糖脂積累速率相對較滯后，其主要是底物進(jìn)入糖酵解途徑的方式和速率不同。糖酵解路徑通常為葡萄糖→6-磷酸葡萄糖→6-磷酸果糖→1,6-二磷酸果糖→3-磷酸甘油醛+磷酸二羥丙酮→1,3-二磷酸甘油酸→D-3-磷酸甘油酸+ATP→D-2-磷酸甘油酸→磷酸烯醇式丙酮酸→丙酮酸+ATP。

以果糖、半乳糖和甘露糖為例，其進(jìn)入糖酵解途徑為①D-果糖→1-磷酸果糖→甘油醛→3-磷酸甘油醛+磷酸二羥丙酮；②D-半乳糖→1-磷酸半乳糖→1-磷酸葡萄糖→6-磷酸葡萄糖；D-甘露糖→6-磷酸甘露糖→6-磷酸果糖。由此可見，單糖是通過轉(zhuǎn)化成為葡萄糖糖酵解過程中的某一中間體來進(jìn)入糖酵解的，不同酶的催化速率、轉(zhuǎn)化效率以及中間體種類不同，均會影響其糖酵解的效率，最終影響槐糖脂的累積速率。當(dāng)以多糖(二糖/三糖)為碳源時(shí)，首先需要通過酶水解將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的單糖進(jìn)而參與到槐糖脂的合成。還原糖種類不同，微生物將其轉(zhuǎn)化為新的葡萄糖分子的途徑和步驟不同，即丙酮酸的生成效率不同，槐糖脂的積累速率也不同。

還原糖種類的改變基本不影響槐糖脂的結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)橐环矫?，不同種類的還原糖都是通過轉(zhuǎn)化為葡萄糖糖酵解途徑的某一中間體而進(jìn)入糖酵解途徑，其最終都是以丙酮酸為起點(diǎn)，轉(zhuǎn)化為活化的葡萄糖分子或脂肪酸；另一方面，培養(yǎng)基中所添加的親水性碳源大部分用于微生物的生長代謝，僅有小部分通過轉(zhuǎn)化為活化的葡萄糖分子以直接結(jié)合 (direct incorporation) 的方式成為槐糖脂分子的組成部分[8]。

1984年，G?bbert等[10]首次研究了不同還原糖對酵母產(chǎn)槐糖脂的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)?shù)孜餄舛认嗤瑫r(shí)，所得槐糖脂均具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，且單糖(單糖>三糖>二糖)更利于槐糖脂的積累(表1)。由表1可知：葡萄糖是最適合槐糖脂合成的一種還原糖(0.325 g/g)；除葡萄糖外，以甘露糖為底物時(shí)，槐糖脂產(chǎn)率最高為0.245 g/g；以麥芽糖為底物時(shí)，槐糖脂產(chǎn)率最低，為0.100 g/g。隨后，Klekner等[11]和Zhou等[12]先后研究了復(fù)合碳源(還原糖和油脂同時(shí)添加)對槐糖脂合成的影響，并對酵母粉(YE)添加量(0.25%～2.00%)、油脂種類(葵花油、橄欖油、紅花油和菜籽油)以及還原糖種類(蔗糖、乳糖和半乳糖)等影響因素進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：酵母粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和復(fù)合碳源的配比均會對還原糖合成槐糖脂造成一定影響。Klekner等[11]發(fā)現(xiàn)，分別以蔗糖和葵花油為親水性和疏水性碳源時(shí)，當(dāng)酵母粉添加量為0.25%時(shí)，槐糖脂產(chǎn)量最高，達(dá)到33.0 g/L。

Hommel等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，C.apicola可以在以葡萄糖、果糖或蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長并合成槐糖脂，且疏水性碳源十六烷的添加可顯著提高槐糖脂的產(chǎn)量。值得注意的是，當(dāng)以半乳糖或麥芽糖為唯一碳源時(shí)，槐糖脂的產(chǎn)量很低，且十六烷的添加也無明顯促進(jìn)作用。Zhou等[12]的研究表明，C.bombicola不能在乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中代謝存活，而當(dāng)以“乳糖+橄欖油”為復(fù)合碳源時(shí)，酵母可以存活且槐糖脂產(chǎn)量達(dá)到46.5 g/L，但以“半乳糖+橄欖油”為復(fù)合碳源時(shí)，槐糖脂產(chǎn)量僅為24.4 g/L，降低了47.5%。隨后，采用1 L發(fā)酵罐進(jìn)行了C.bombicola產(chǎn)槐糖脂的放大實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基配方為100 g/L葡萄糖、10.5%菜籽油(體積分?jǐn)?shù))和4 g/L酵母粉，經(jīng)過8 d的發(fā)酵培養(yǎng)，葡萄糖和菜籽油的轉(zhuǎn)化率為80%，槐糖脂的產(chǎn)量達(dá)到90～110 g/L[13]；而在相同條件下，以乳糖和菜籽油為底物進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，乳糖和菜籽油的轉(zhuǎn)化率僅為45%，遠(yuǎn)低于葡萄糖和菜籽油。由此可見，葡萄糖仍然是槐糖脂發(fā)酵的理想碳源。

2.2 脂肪酸類底物

脂肪酸是指具有或包含脂肪酸結(jié)構(gòu)的物質(zhì)統(tǒng)稱，是槐糖脂發(fā)酵的重要底物，一般作為次級碳源參與合成代謝。具有脂肪酸結(jié)構(gòu)的碳源主要包括油脂、酯化油脂、脂肪酸及其衍生酯四類，根據(jù)碳鏈長度的不同分為短鏈脂肪酸、中鏈脂肪酸和長鏈脂肪酸。脂肪酸對槐糖脂發(fā)酵影響的研究也備受關(guān)注。

在槐糖脂生物合成通路中，當(dāng)以脂肪酸類物質(zhì)為唯一碳源時(shí)，該類物質(zhì)可以通過TCA途徑合成葡萄糖，為生物代謝提供能量并為槐糖脂合成提供直接底物；也可以直接在單加氧酶細(xì)胞色素P450的作用下合成ω-/ω-1羥基脂肪酸，為槐糖脂的合成提供脂肪酸類直接底物。脂肪酸類底物替代葡萄糖/油酸合成槐糖脂的能力受其所含脂肪酸碳鏈長度的影響，天然槐糖脂分子中脂肪酸碳鏈長度主要為16和18。一般來說，較長碳鏈的脂肪酸或帶有支鏈的脂肪酸需要通過β-氧化降解，而較短的脂肪酸則需要延長至16或18碳，用于槐糖脂的有效合成[14]。

目前，在槐糖脂合成的廉價(jià)底物替代研究中，作為可替代性碳源的脂肪酸類底物主要有紅花油、玉米油、大豆油、葵花油、菜籽油、棕櫚油、椰子油、葡萄籽油、橄欖油、亞麻籽油和胚芽油等植物油，魚油、牛油等動(dòng)物油，硬脂酸、硬脂酸甲酯、向日葵脂肪酸甲酯、棕櫚油脂肪酸甲酯、亞麻籽脂肪酸甲酯、豆油脂肪酸甲酯、油菜籽脂肪酸乙酯、豆油脂肪酸乙酯、豆油脂肪酸丙酯和硬脂酸殘余、牛油脂肪酸殘余、椰子油脂肪酸殘余等脂肪酸及其衍生酯類等，這些脂肪酸為底物的研究總結(jié)見表2。由表2分析可知：以油脂為廉價(jià)底物合成槐糖脂的研究主要集中在1992—2009年期間，此后鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。Cooper等[15]的研究表明，相比于單一碳源，親水性和疏水性碳源組成的復(fù)合碳源更利于槐糖脂的合成，且其配比也會影響槐糖脂的產(chǎn)量。當(dāng)培養(yǎng)基中僅含有葡萄糖或紅花油時(shí)，槐糖脂不能合成；當(dāng)酵母粉添加量為0.5%、葡萄糖和紅花油的比例分別為1∶ 2、1∶ 1或2∶ 1時(shí)，槐糖脂的產(chǎn)量可分別達(dá)到10.0、30.0和18.0 g/L；而當(dāng)酵母粉添加量為1 g/L時(shí)，無論在何種碳源條件下，槐糖脂的產(chǎn)量均很低，僅為1～10 g/L。隨后，Pekin等[28]以玉米油、葡萄糖和蜂蜜為復(fù)合碳源，獲得了不低于400 g/L的槐糖脂產(chǎn)量。Kim等[33]以菜籽油和葡萄糖為復(fù)合碳源體系也得到了365.0 g/L的槐糖脂。值得注意的是，Asmer等[16]使用流加培養(yǎng)的方式培養(yǎng)T.bombicola時(shí)發(fā)現(xiàn)，以油酸為唯一碳源時(shí)，槐糖脂產(chǎn)量為77.0 g/L，而當(dāng)油酸和葡萄糖配合使用時(shí)，產(chǎn)量降至33.0 g/L，且兩種槐糖脂的組成和比例也不相同。

對于油脂和酯化油脂類替代底物，來源于植物油的油脂和酯化油脂替代效果優(yōu)于來源于動(dòng)物油替代底物，且酯化油脂和葡萄糖共體系的效果優(yōu)于油脂和葡萄糖，可能原因?yàn)槌Ｓ弥参镉椭蠧16～C18飽和或不飽和的脂肪酸含量較高。另外，酵母粉添加量、油脂種類和碳源種類(親水性碳源、疏水性碳源)及其配比、培養(yǎng)條件等也會影響槐糖脂的合成[8,33]。

Casas等[25]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以葡萄糖和不同植物油為復(fù)合底物間歇培養(yǎng)C.bombicola時(shí)，疏水性底物為葵花油時(shí)槐糖脂產(chǎn)量最高，達(dá)到11.0 g/L，其次分別是橄欖油、玉米油、葡萄籽油和椰子油。由于避開了高濃度脂肪酸產(chǎn)生的抑制效應(yīng)，“植物油脂+葡萄糖”比“植物油+葡萄糖”更利于槐糖脂的合成。Davila等[19]以菜籽油乙酯、紅花油甲酯和棕櫚油甲酯分別替代菜籽油、紅花油和棕櫚油時(shí)，所得槐糖脂產(chǎn)量高達(dá)340.0、235.0和240.0 g/L，分別提高了33%、37%和193%。這可能是因?yàn)橹舅峒柞?乙酯易被胞外水解酶水解，末端/近末端氧化率較高。

表2 以脂肪酸為替代底物的槐糖脂合成研究概覽

注：a—不同復(fù)合碳源或其不同配比；b—復(fù)合碳源或不同配比得到的SL產(chǎn)量，且槐糖脂產(chǎn)量由產(chǎn)率換算而得；c—不同碳源及質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

以魚油、牛油和羊油等動(dòng)物油為疏水性碳源時(shí)所得槐糖脂產(chǎn)量比植物油低。Solaiman等[30]發(fā)現(xiàn)在“牛油+葡萄糖”為培養(yǎng)基條件下，槐糖脂產(chǎn)量僅為32.0 g/L，相比于“油酸+葡萄糖”培養(yǎng)基的結(jié)果(100 g/L)下降了68%。Davila等[19]以魚油為底物所得槐糖脂產(chǎn)量為51.0 g/L，略低于其他植物油培養(yǎng)基但優(yōu)于牛油的32 g/L，原因可能是魚油中不飽和脂肪酸含量高于其他動(dòng)物油。

1998年，Daniel等[23]利用單細(xì)胞油脂和菜籽油為復(fù)合碳源獲得了迄今為止最高的產(chǎn)量422.0 g/L。該項(xiàng)研究首次將合成周期短的微生物油脂引入了槐糖脂的合成過程中，不僅提高了槐糖脂產(chǎn)量，而且拓寬了槐糖脂合成的底物范圍，一定程度地降低了原料成本。

對于脂肪酸類底物，含有C16～C18的飽和或不飽和脂肪酸，如油酸或硬脂酸，可直接參與槐糖脂的合成，且產(chǎn)槐糖脂的效果最佳；當(dāng)碳鏈長度少于16或多于20時(shí)，槐糖脂的產(chǎn)量降低。除此之外，脂肪酸衍生物中脂肪酸酯取代基也會影響槐糖脂的產(chǎn)量，如以脂肪酸酯和甘油為共碳源流加培養(yǎng)C.bombicola時(shí)，豆油脂肪酸甲酯>豆油脂肪酸乙酯>豆油脂肪酸丙酯，槐糖脂產(chǎn)量分別為(46±4.0)、(42±7.0)和(18±6.0)g/L[29]。

2.3 烴類底物

表3為以烴類為底物合成槐糖脂的研究結(jié)果總結(jié)。由表3可知，目前用于合成槐糖脂的烴類底物主要是C12～C20的烷烴、烷醇和烷酮，尤其是C12～C20的烷烴。在槐糖脂合成通路中，烴類物質(zhì)首先在脂肪醛脫氫酶/脂肪醇氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為脂肪酸，部分經(jīng)β-氧化生成乙酰CoA，進(jìn)入TCA，為細(xì)胞生長代謝提供能量，并通過糖異生途徑合成葡萄糖；部分在單加氧酶細(xì)胞色素P450的作用下生成羥基脂肪酸，直接用于槐糖脂的合成。

Davila等[19]分別以C12、C14、C16、C18烷烴為單一碳源時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著碳原子數(shù)的增加、碳鏈的增長，則更利于槐糖脂的合成，產(chǎn)量分別為17.0、20.0、95.0和175.0 g/L，且C16和C18合成槐糖脂的效率更高。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因與槐糖脂的自身結(jié)構(gòu)及酶催化特性有關(guān)。CYP52M1催化的脂肪酸羥基化的特異性決定了天然槐糖脂的脂肪酸部分一般為C16或C18，因此，當(dāng)疏水性底物的碳鏈長度不是16或18時(shí)，其產(chǎn)量相對較低。上述結(jié)論在后續(xù)的研究中得到了進(jìn)一步的證明。但槐糖脂的產(chǎn)量仍然與微生物種類、培養(yǎng)模式、培養(yǎng)條件、氮源及其添加量等有關(guān)，因此需根據(jù)具體情況綜合考慮。

表3 以烴類為替代底物的槐糖脂合成研究概覽

注：a—復(fù)合碳源；b—不同復(fù)合碳源對應(yīng)的SL產(chǎn)量，且槐糖脂產(chǎn)量是由產(chǎn)率換算而得；c—碳源及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

Felse等[14]發(fā)現(xiàn)，烴類物質(zhì)的替代效果不僅受碳原子數(shù)量影響，還受其不飽和度的影響。隨著烴類物質(zhì)不飽和程度的降低，槐糖脂產(chǎn)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當(dāng)?shù)孜餅槠咸烟?C18∶ 1時(shí)，槐糖脂產(chǎn)量最高達(dá)到60.0 g/L(底物為葡萄糖+C18∶ 2或C18∶ 3時(shí)產(chǎn)量分別為30.0和23.0 g/L)。這結(jié)果表明，當(dāng)使用C18∶ 1代替C18∶ 0為底物時(shí)，槐糖脂的產(chǎn)量更高。Brakemeier等[35]評價(jià)十二烷醇以及十二烷酮(取代基分別位于第2、3或4位)的替代效果時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種避開槐糖脂合成受碳鏈長度依賴性限制的模式，通過研究發(fā)現(xiàn)，大部分烷醇均可以不經(jīng)修飾直接合成槐糖脂，且烷醇和烷酮的替代效果受取代基的位置影響。以十二烷酮為例，由于受脂肪酸末端/近末端的氧化率影響，當(dāng)取代基位于3位、2位和4位時(shí)，槐糖脂產(chǎn)量依次降低，分別為17.0、15.0和3.0 g/L。

2.4 工業(yè)副產(chǎn)品類底物

工業(yè)廢棄物作為槐糖脂發(fā)酵生產(chǎn)的替代底物也可以降低槐糖脂的生產(chǎn)成本。目前，生物柴油廢料、煎炸廢油、大豆黑油、工業(yè)脂肪酸廢料和餐館廢油等已被用作疏水性底物來替代常規(guī)使用的疏水性底物用以槐糖脂的生產(chǎn)，具體研究結(jié)果見表4。由表4知，槐糖脂生產(chǎn)所需親水性碳源也可以使用生物柴油副產(chǎn)物甘油、脫蛋白乳清、甘蔗糖蜜和大豆糖蜜等來替代。

脫蛋白乳清濃縮液中含有大量的乳糖和半乳糖，Daniel等[24]利用脫蛋白乳清濃縮液為底物發(fā)酵得到了280 g/L的槐糖脂，而乳糖并未被消耗，且未檢測到β-半乳糖苷酶的活性。葡萄糖也可以用更復(fù)雜的底物，如主要成分是蔗糖、低聚糖和少量單糖的甘蔗糖蜜和大豆糖蜜等替代。Daverey等[40]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以甘蔗糖蜜和豆油/葵花油/橄欖油為復(fù)合碳源時(shí)，槐糖脂的產(chǎn)量分別為23.3、17.5和19.0 g/L。此外，糖蜜還可以同時(shí)替代酵母粉或培養(yǎng)基中的其他氮源，所得槐糖脂產(chǎn)量為53.0 g/L，略低于對照組(酵母粉和尿素)條件下的75.0 g/L[30]。

蜂蜜是葡萄糖和果糖的混合物，也含有一定量的維生素、礦物質(zhì)和氨基酸。2005年，Pekin等[28]對C.bombicola利用土耳其玉米油和蜂蜜產(chǎn)槐糖脂的能力進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以蜂蜜和玉米油為復(fù)合碳源時(shí)，添加葡萄糖可以顯著提高槐糖脂的產(chǎn)量；在間歇培養(yǎng)模式下所得槐糖脂的產(chǎn)量高于400 g/L。這意味著，以多種還原糖組成的復(fù)合體系為親水性碳源更利于獲得高產(chǎn)量槐糖脂，且混合物中每種還原糖的比例也會影響發(fā)酵水平。

表4 以工業(yè)副產(chǎn)品為替代底物的槐糖脂合成研究概覽

甘油是生物柴油的主要副產(chǎn)品之一。Ashby等[37]考察了以生物柴油廢物流和試劑級甘油為親水性碳源合成槐糖脂的替代效果。在相同條件下，槐糖脂產(chǎn)量分別為60.0 g/L 和9.0 g/L，即相比于高純度的甘油，甘油為420 g/L的生物柴油副產(chǎn)物更利于槐糖脂的合成。隨后，他們又以不同酯化后的豆油(甲基酯、乙基酯或丙基酯)和甘油為復(fù)合碳源，利用流加補(bǔ)料培養(yǎng)C.bombicola，分別得到(46±4.0)、(42±7.0)和(18±6.0) g/L的槐糖脂[29]。近年來，F(xiàn)leuracker[38]和Shah等[39]也先后以煎炸廢油和餐館廢油為底物，得到了50.0 g/L和34.0 g/L的槐糖脂。因此，在槐糖脂生產(chǎn)中引入廢物流不僅可以降低槐糖脂合成的原料成本，同時(shí)可以使廢棄物得到高值化利用，減少環(huán)境污染，一定程度上推動(dòng)人類健康和社會發(fā)展。

大豆黑油和工業(yè)脂肪酸殘余是典型可用作槐糖脂發(fā)酵所需疏水性碳源的工業(yè)副產(chǎn)品。大豆黑油是豆油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品，含有65%～75%的脂肪酸和20%～30%的甘油三酸酯，其混合物內(nèi)的脂肪酸組成同豆油、玉米油等植物油相似。Kim等[27]提出以100 g/L葡萄糖和100 g/L大豆黑油為共底物，對C.bombicola進(jìn)行流加培養(yǎng)，7 d后得到90.0 g/L的槐糖脂。隨后，他們發(fā)現(xiàn),當(dāng)選取油酸含量為16.1%的大豆黑油為疏水性碳源時(shí)，在間歇培養(yǎng)模式下槐糖脂的產(chǎn)量為(65.0±7.07) g/L。槐糖脂產(chǎn)量的降低，一方面可能受培養(yǎng)模式的影響，另一方面就是源于大豆黑油內(nèi)脂肪酸組成和比例不同，不同類型的脂肪酸合成槐糖脂的生物途徑和效率不同，這會導(dǎo)致槐糖脂的積累速率不同，從而影響槐糖脂的產(chǎn)量。

工業(yè)脂肪酸殘余的組成和比例比較復(fù)雜，脂肪酸的碳鏈長度及其飽和程度均會影響槐糖脂的積累速率。Felse等[14]以工業(yè)脂肪酸殘余為研究對象，主要對硬脂酸殘余、牛油脂肪酸殘余和椰子油脂肪酸殘余為底物時(shí)合成槐糖脂的情況進(jìn)行了研究。對于硬脂酸殘余、牛油脂肪酸殘余和椰子油脂肪酸殘余，其中C18∶ 0含量分別為55.7%、13.4%和9.6%，C18∶ 1的含量分別為1.5%、41.4%和27.6%。研究表明：在流加培養(yǎng)條件下，C18∶ 1含量最高的牛油脂肪酸殘余最適合用于槐糖脂的合成，產(chǎn)量高達(dá)120.0 g/L，C18∶ 0和C18∶ 1的總含量最低(37.2%)的椰子油脂肪酸殘余為底物時(shí)，槐糖脂產(chǎn)量僅為40.0 g/L。因此，可以這樣認(rèn)為，當(dāng)以富含C18∶ 0和C18∶ 1的脂肪酸體系為底物時(shí)，其總含量越高，越利于槐糖脂的合成，尤其是C18∶ 1的比例越高，槐糖脂的積累速率越快。

2.5 木質(zhì)纖維素類底物

木質(zhì)纖維素材料是一類尚未被充分利用的、來源廣泛、產(chǎn)量豐富的可再生資源。近年來，隨著資源、能源問題的日益加劇和環(huán)境問題不斷惡化，利用農(nóng)作物秸稈等木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的技術(shù)開發(fā)越來越受各界關(guān)注。迄今，已有很多以稻草秸稈、玉米芯、甘蔗渣等農(nóng)業(yè)廢棄物用于乙醇、丁醇、生物柴油和單細(xì)胞油等化學(xué)品合成的報(bào)道[41-44]，這類技術(shù)不僅可以降低相關(guān)工藝的生產(chǎn)成本，創(chuàng)造額外利益，而且可以廢物利用，實(shí)現(xiàn)資源、能源的可持續(xù)發(fā)展。以木質(zhì)纖維素材料為底物生產(chǎn)槐糖脂的研究相對較少，結(jié)果如表5所示。

表5 以木質(zhì)纖維素材料為替代底物的槐糖脂合成研究概覽

馬曉靜[41]首次論證了脫木素木糖渣替代葡萄糖生產(chǎn)槐糖脂的可行性，結(jié)果表明，脫木素木糖渣水解液可直接被W.domercqiae利用合成一定量的槐糖脂，且水解液的脫毒等操作可以進(jìn)一步優(yōu)化槐糖脂產(chǎn)量。在未脫毒和脫毒處理的脫木素木糖渣水解液培養(yǎng)基中，槐糖脂的產(chǎn)量分別達(dá)到39.1和42.1 g/L。脫木素木糖渣的引入拓寬了槐糖脂合成的廉價(jià)底物替代范圍，極大程度上降低了槐糖脂的生產(chǎn)成本，有助于推動(dòng)其大規(guī)模應(yīng)用。隨后，Samad等[42]以甜高粱渣水解液和大豆油為底物，得到了84.6 g/L的槐糖脂；Konishi等[43]改進(jìn)了玉米芯合成槐糖脂的工藝，降低了酸用量，獲得了43.8 g/L的槐糖脂。筆者所在課題組以SO3微熱爆處理后的稻草秸稈水解液為底物，未經(jīng)脫毒處理的搖瓶培養(yǎng)條件下即可得到54 g/L的槐糖脂，降低槐糖脂生產(chǎn)成本的同時(shí)簡化了木質(zhì)纖維素材料發(fā)酵產(chǎn)槐糖脂的操作步驟[44]。

此外，高粱、玉米芯和稻草秸稈等木質(zhì)纖維素材料自身的纖維素和木質(zhì)素含量不同，且其選用的木質(zhì)素剝離方法也各不相同，致使其水解液中單糖的種類和含量也有所不同，尤其是糠醛、乙酸等發(fā)酵抑制物的種類和含量也有一定差異。一方面，水解液中物質(zhì)的種類和含量的差異會對發(fā)酵產(chǎn)槐糖脂的效率造成一定影響；另一方面，不同的木質(zhì)素剝離方法所帶來的成本上的差異，也必將會影響到木質(zhì)纖維素材料在槐糖脂發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。

總之，木質(zhì)纖維素水解液可用作槐糖脂合成所需親水性碳源。該工藝主要是先利用纖維素酶水解木質(zhì)纖維素得到富含五碳糖和六碳糖的水解液，進(jìn)而替代葡萄糖實(shí)現(xiàn)槐糖脂的合成。但木質(zhì)纖維素的替代仍存在如下問題：①針對不同的廢棄農(nóng)作物秸稈，其利用價(jià)值不同，故原料成本也大不相同；②木質(zhì)纖維素材料多富含木質(zhì)素，使用前需要進(jìn)行脫木質(zhì)素處理以提高水解糖化效果，木質(zhì)纖維素的預(yù)處理無形中增加了替代底物的生產(chǎn)成本；③糖化液在使用前需要進(jìn)行脫毒處理以減少抑制物，以提高木質(zhì)素材料的利用率，這又在一定程度上提高了其生產(chǎn)成本。馬曉靜[41]雖然提出以玉米芯生產(chǎn)木糖所獲的經(jīng)濟(jì)效益來平衡槐糖脂生產(chǎn)中脫木質(zhì)素環(huán)節(jié)的加工成本，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本，但其具體生產(chǎn)成本并未進(jìn)行核算。

3 展望

槐糖脂是一類表面活性、界面活性和生物活性優(yōu)良的生物表面活性劑，較高的生產(chǎn)成本(原料成本)限制了其開發(fā)和應(yīng)用。盡管還原糖、油脂、烴類、脫蛋白乳清、糖蜜、甘油和秸稈等諸多廉價(jià)底物都可用于槐糖脂的合成，但廉價(jià)底物的使用給槐糖脂產(chǎn)量帶來一定的負(fù)面影響。因此，在評價(jià)廉價(jià)底物或廢物流是否能從真正意義上降低槐糖脂生產(chǎn)成本時(shí)，應(yīng)綜合考慮原料成本、產(chǎn)率和生產(chǎn)效率等因素，盡量減少降低底物成本帶來的負(fù)效應(yīng)。在槐糖脂合成的底物替代研究中，木質(zhì)纖維素類底物因來源廣泛、儲存量大、價(jià)格低廉等優(yōu)勢，依然是近期和未來研究的熱點(diǎn)。

[1] DAVILA A M,MARCHAL R,MONIN N,et al.Identification and determination of individual sophorolipids in fermentation products by gradient elution high-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detection[J].J Chromatogr A,1993,648(1):139-149.

[2] 劉躍文,劉冉,陳靜.納米羥基磷灰石與槐糖脂負(fù)載后對宮頸癌細(xì)胞的藥學(xué)活性研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2017(3):1-5.

[3] RAU U,HAMMEN S,HECKMAN N,et al.Sophorolipids:a source for novel compounds[J].Ind Crops Prod,2001,13(2):85-92.

[4] GUILMANOV V,BALLISTRERI A,IMPALLOMENI G,et al.Oxygen transfer rate and sophorose lipid production byCandidabombicola[J].Biotechnol Bioeng,2002,77(5):489-494.

[5] 伏圣秘,張紅蕊,陳靜.十四醇為底物合成新型槐糖脂及其抑菌作用[J].齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,28(2):29-33.

[6] VAN BOGAERT I N A,SAERENS K,DE MUYNCK C,et al.Microbial production and application of sophorolipids[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,76(1):23-34.

[7] CIESIELSKA K,ROELANTS S L K W,VAN BOGAERT I N A,et al.Characterization of a novel enzyme:Starmerellabombicolalactone esterase (SBLE)-responsible for sophorolipid lactonization[J].Appl Microbiol Biotechnol,2016,100(22):1-13.

[8] VAN BOGAERT I N A,DEVELTER D,SOETAERT W,et al.Cerulenin inhibits de novo sophorolipid synthesis ofCandidabombicola[J].Biotechnol Lett,2008,30(10):1829-1832.

[9] HOMMEL R K,WEBER L,WEISS A,et al.Production of sophorose lipid byCandida(Torulopsis)apicolagrown on glucose[J].J Biotechnol,1994,33(2):147-155.

[10] G?BBERT U,LANG S.Sophorose lipid formation by resting cells ofTorulopsisbombicola[J].Biotechnol Lett,1984,6(4):225-230.

[11] KLEKNER V,KOSARIC N,ZHOU Q H.Sophorose lipids produced from sucrose[J].Biotechnol Lett,1991,13(5):345-348.

[12] ZHOU Q H,KOSARIC N.Effect of lactose and olive oil on intra- and extracellular lipids ofTorulopsisbombicola[J].Biotechnol Lett,1993,15(5):477-482.

[13] ZHOU Q H,KOSARIC N.Utilization of canola oil and lactose to produce biosurfactant withCandidabombicola[J].J Am Oil Chem Soc,1995,72(1):67-71.

[14] FELSE P,SHAH V,CHAN J,et al.Sophorolipid biosynthesis byCandidabombicolafrom industrial fatty acid residues[J].Enzyme Microb Technol,2007,42(2):316-323.

[15] COOPER D G,PADDOCK D A.Production of a biosurfactant fromTorulopsisbombicola[J].Appl Environ Microbiol,1984,47(1):173-176.

[16] ASMER H,LANG S,WAGNER F,et al.Microbial production,structure elucidation and bioconversion of sophorose lipids[J].J Am Oil Chem Soc,1988,65(9):1460-1466.

[17] DAVILA A M,MARCHAL R,VANDECASTEELE J P.Kinetics and balance of a fermentation free from product inhibition:sophorose lipid production byCandidabombicola[J].Appl Microbiol Biotechnol,1992,38(1):6-11.

[18] LEE K H,KIM J H.Distribution of substrates carbon in sophorose lipid production byTorulopsisbombicola[J].Biotechnol Lett,1993,15(3):263-266.

[19] DAVILA A M,MARCHAL R,VANDECASTEELE J P.Sophorose lipid production from lipidic precursors:predictive evaluation of industrial substrates[J].J Ind Microbiol,1994,13(4):249-257.

[20] RAU U,MANZKE C,WAGNER F.Influence of substrate supply on the production of sophorose lipids byCandidabombicolaATCC 22214[J].BiotechnolLett,1996,18(2):149-154.

[21] DAVILA A M,MARCHAL R,VANDECASTEELE J P.Sophorose lipid fermentation with differentiated substrate supply for growth and production phases[J].Appl Microbiol Biotechnol,1997,47(5):496-501.

[22] KIM S Y,OH D K,LEE K H,er al.Effect of soybean oil and glucose on sophorose lipid fermentation byTorulopsisbombicolain continuous culture[J].Appl Microbiol Biotechnol,1997,48(1):23-26.

[23] DANIEL H J,REUSS M,SYLDATK C.Production of sophorolipids in high concentration from deproteinized whey and rapeseed oil in a two stage fed batch process usingCandidabombicolaATCC 22214 andCryptococcuscurvatusATCC 20509[J].Biotechnol Lett,1998,20(12):1153-1156.

[24] DANIEL H J,OTTO R T,REUSS M.Sophorolipid production with high yields on whey concentrate and rapeseed oil without consumption of lactose[J].Biotechnol Lett,1998,20(8):805-8078.

[25] CASAS J A,GARCA-OCHOA F.Sophorolipid production byCandidabombicola:medium composition and culture methods[J].J Biosci Bioeng,1999,88(5):488-494.

[26] SOLAIMAN D K Y,ASHBY R D,NUNEZ A,et al.Production of sophorolipids byCandidabombicolagrown on soy molasses as substrate[J].Biotechnol Lett,2004,26(15):1241-1245.

[27] KIM H S,KIM Y B,LEE B S,et al.Sophorolipid production byCandidabombicolaATCC 22214 from a corn-oil processing byproduct[J].J Microbiol Biotechnol,2005,15(1):55-58.

[28] PEKIN G,VARDAR-SUKAN F,KOSARIC N.Production of sophorolipids fromCandidabombicolaATCC 22214 using Turkish corn oil and honey[J].Eng Life Sci,2005,5(4):357-362.

[29] ASHBY R D,SOLAIMAN D K Y,FOGLIA T A.The use of fatty acid esters to enhance free acid sophorolipid synthesis[J].Biotechnol Lett,2006,28(4):253-260.

[30] SOLAIMAN D K Y,ASHBY R D,ZERKOWSKI J A,et al.Simplified soy molasses-based medium for reduced-cost production of sophorolipids byCandidabombicola[J].Biotechnol Lett,2007,29(9):1341-1347.

[31] DAVEREY A,PAKSHIRAJAN K.Production,characterization,and properties of sophorolipids from the yeastCandidabombicolausing a low-cost fermentative medium[J].Appl Biochem Biotechnol,2009,158(3):663-674.

[32] KIM Y B,YUN H S,KIM E K.Enhanced sophorolipid production by feeding-rate-controlled fed-batch culture[J].Bioresour Technol,2009,100(23):6028-6032.

[33] 宋丹丹,梁生康,尚玉俊,等.不同碳源培養(yǎng)條件下假絲酵母菌產(chǎn)槐糖脂的結(jié)構(gòu)及性能[J].環(huán)境化學(xué),2015,34(7):1252-1258.

[34] BRAKEMEIER A,WULLBRANDT D,LANG S.Candidabombicola:production of novel alkyl glycosides based on glucose/2-dodecanol[J].Appl Microbiol Biotechnol,1998,50(2):161-166.

[35] BRAKEMEIER A,WULLBRANDT D,LANG S.Microbial alkyl-sophorosides based on 1-dodecanol or 2-,3- or 4-dodecanones[J].Biotechnol Lett,1998,20(3):215-218..

[36] CAVALEROD A,COOPERD G.The effect of medium composition on the structure and physical state of sophorolipids produced byCandidabombicolaATCC 22214[J].J Biotechnol,2003,103(1):31-41.

[37] ASHBY R D,NUEZ A,SOLAIMANDKY,et al.Sophorolipid biosynthesis from a biodiesel co-product stream[J].J Am Oil Chem Soc,2005,82(9):625-630.

[38] FLEURACKER S S J J.On the use of waste frying oil in the synthesis of sophorolipids[J].Eur J Lipid Sci Technol,2006,108(1):5-12.

[39] SHAH V,JURJEVIC M,BADIA D.Utilization of restaurant waste oil as a precursor for sophorolipid production[J].Biotechnol Prog,2007,23(2):512-515.

[40] DAVEREY A,PAKSHIRAJAN K.Production of sophorolipids by the yeastCandidabombicolausing simple and low cost fermentative media[J].Food Res Int,2009,42(4):499-504.

[41] 馬曉靜.槐糖脂合成的氮源代謝調(diào)控及槐糖脂的廉價(jià)底物生產(chǎn)和性質(zhì)研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2012.

[42] SAMAD A,ZHANG J,CHENG D.Sophorolipid production from biomass hydrolysates[J].Appl Biochem Biotechnol,2014,175(4):2246-2257.

[43] KONISHI M,YOSHIDA Y,HORIUCHI J I.Efficient production of sophorolipids byStarmerellabombicolausing a corncob hydrolysate medium[J].J Biosci Bioeng,2015,119(3):317-322.

[44] LIU X G,MA X J,YAO R S.Sophorolipids production from rice straw via SO3micro-thermal explosion byWickerhamielladomercqiaevar.sophorolipid CGMCC 1576[J].AMB Express,2016,6(1):1-11.

(責(zé)任編輯 荀志金)

Advances in sophorolipids production with low-cost substrates

LIU Xinge,MA Xiaojing,HE Hongbo,YAO Risheng

(School of Biological and Medical Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

Sophorolipids (SLs),mainly synthesized by yeasts,are biosurfactants with the highest fermentation level at present.In recent years,SLs have drawn extensive attention for their excellent physiochemical properties and physiologically active functions.Large scale application of SLs is limited by relative high production cost.Application of cheap substrates is an efficient way to reduce the cost.Based on the pathway of SLs biosynthesis,selection and substitution effects of low-cost substrates arereviewed in this paper.Low-cost substrates are mainly divided into reducing sugar,fatty acid,hydrocarbon,industrial effluent flow,and lignocellulosic materials.Finally,industrial production of SLs is addresses and the important potential value of lignocellulosic materials for SLs production is proposed.

sophorolipids; anabolism; carbon source; low-cost substrates

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.03.010

2017-02-13

國家自然科學(xué)基金青年基金(31400049)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2014AA021902)；中國博士后科學(xué)基金(2015T80646)；煙草化學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金(W2015JSKF0493)

劉新歌(1991—),女,黑龍江延壽人,研究方向：生物制藥技術(shù)與工藝；馬曉靜(聯(lián)系人),副教授,E-mail:maxj@hfut.edu.cn；姚日生(聯(lián)系人),教授,E-mail：yaors@163.com

Q546

A

1672-3678(2017)03-0059-10