李巧麗，趙 哲，徐建妙

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014)

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仿生法制備氧化硅載體固定化蘇氨酸脫氨酶及其酶學(xué)性質(zhì)

李巧麗，趙 哲，徐建妙

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014)

通過共沉淀法制備無機(jī)氧化硅載體，然后將其應(yīng)用到蘇氨酸脫氨酶的固定化研究中。用掃描電子顯微鏡對氧化硅載體進(jìn)行表征，優(yōu)化了固定化條件，當(dāng)n(Si)：n(N)為1∶ 1、偏硅酸濃度為0.03 mol/L、酶添加量為0.16 mg/mL 時(shí)，固定化的效率最高。接著對固定化酶和游離酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：固定化酶和游離酶的最適pH都是9.0，最適溫度都是45 ℃，而相對于游離酶，固定化酶在pH 9.0～10.0和溫度35～50 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性更好。固定化酶的米氏常數(shù)為7.48 mmol/L，重復(fù)使用15次后，酶活力保持80%以上。說明仿生氧化硅制備的固定化蘇氨酸脫氨酶具有酶活回收率高、力學(xué)強(qiáng)度高和操作穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。

氧化硅; 蘇氨酸脫氨酶; 固定化; 酶學(xué)性質(zhì)； 納米材料

酶的固定化技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，由于其能有效地保持酶的活性，增加酶的穩(wěn)定性，許多藥物中間體都是利用固定化酶來制備生產(chǎn)的，如1-苯乙醇、6-氨基青霉烷酸和L-2-氨基丁酸等[1]。在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，由于溫度、pH、穩(wěn)定性及力學(xué)強(qiáng)度的問題使得固定化酶的使用受到限制。近年來，納米材料因其良好的生物相容性、比表面積大、載酶量突出、顆粒直徑小和傳質(zhì)阻力小等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于酶的固定化研究，同時(shí)，它通過改善酶的適應(yīng)性和穩(wěn)定性，使酶能持續(xù)高效地進(jìn)行催化反應(yīng)[2-3]。在納米材料中研究最多的是通過仿生法制備SiO2為固定化載體的固定化技術(shù)[3]。這種方法通過模擬天然生物產(chǎn)生SiO2的過程，在溫和條件(接近中性和20 ℃)下添加含胺類物質(zhì)誘導(dǎo)氧化硅前體在體外快速產(chǎn)生SiO2顆粒，同時(shí)通過對制備過程的控制以獲得形態(tài)粒徑各異的SiO2載體。Betancor等[4]通過將乙酰膽堿酯酶包埋在仿生SiO2納米顆粒中，所制得的固定化酶酶活回收率達(dá)100%，固定化效率90%，而且力學(xué)穩(wěn)定性良好。Forsyth等[5]將脂肪酶包埋在偏硅酸縮合形成的SiO2顆粒中，提高了固定化酶的穩(wěn)定性，且固定化效率接近100%。仿生法由于其制備條件溫和、快速、低成本、易于控制以及對環(huán)境友好等特點(diǎn)比其他固定化方法具有優(yōu)勢，使得其在食品和制藥工業(yè)上具有極大的應(yīng)用前景[6-7]。

本研究中，筆者以蘇氨酸脫氨酶作為仿生SiO2納米顆粒的固定化對象，催化L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2-丁酮酸，且以磷酸吡哆醛(PLP)作為輔酶。利用掃描電子顯微鏡(SEM)表征固定化顆粒的形態(tài)特征，同時(shí)通過條件優(yōu)化，考察仿生氧化硅固定化顆粒的催化活性、操作穩(wěn)定性以及儲存穩(wěn)定性，以期為工業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員構(gòu)建的E.coliBL21(DE3)/PET28b(+)-F168V；無水偏硅酸鈉、三乙烯四胺(TETA)，百靈威科技有限公司；L-Thr，阿拉丁公司。

恒溫水浴搖床、磁力攪拌器，美國Crystal公司；X-22型冷凍高速離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；ME104E型電子天平，Mettler-Toledo儀器有限公司；TM-1000型電子掃描電鏡(SEM)，日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化酶的制備

1)游離蘇氨酸脫氨酶的制備。從甘油管中取1 mL重組大腸桿菌菌液，接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h作為種子液；以1%的接種量將種子液接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)，當(dāng)菌體的OD600為0.6～0.8時(shí)，加入0.12 g/mL IPTG 20 μL，然后28 ℃搖床培養(yǎng)10 h，離心收集菌體，生理鹽水洗滌菌體3次。取1 g濕菌體，懸浮于10 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中(pH 8.0，0.2 mol/L)，在冰浴中超聲破碎10 min，破1 s停1 s，功率240 W，超聲破碎后將破碎液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液即得到粗酶液。

2)酶的固定化。用仿生氧化硅固定化酶的過程中，以無水偏硅酸鈉作為SiO2制備的前體，三乙烯四胺(TETA)作為添加劑[5,8]，以一定的比例將前體和添加劑混合，向溶液中滴加3 mol/L HCl溶液，使溶液pH為7.0±0.1。立即添加一定量的酶液，并將所得的溶液溫和地混勻攪拌15 min，然后8 000 r/min離心5 min，棄上清液，用無菌水重復(fù)洗滌2次，即制得固定化蘇氨酸脫氨酶。

1.2.2 固定化酶制備條件的優(yōu)化

在以無水偏硅酸鈉為前體、三乙烯四胺(TETA)為添加劑的條件下，考察不同的硅氮比(1∶ 0.25、1∶ 0.5、1∶ 1、1∶ 1.5和1∶ 2)對固定化酶的影響；設(shè)置偏硅酸濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06 mol/L這6個(gè)梯度，考察前體的濃度對固定化酶的影響；設(shè)置酶添加量為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20和0.24 mg/mL，考察酶添加量對固定化酶的影響。實(shí)驗(yàn)固定化酶制備條件的優(yōu)化均為單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.3 固定化酶的形態(tài)觀察

固定化酶樣品經(jīng)過前處理后，真空冷凍干燥保存，然后將樣品噴金涂膜后，在真空條件下利用電子掃描電鏡(SEM)檢測[9]。

1.2.4 酶活的測定

用游離蘇氨酸脫氨酶和固定化蘇氨酸脫氨酶對L-Thr進(jìn)行催化反應(yīng)，準(zhǔn)確稱取2 mL游離酶液(10 mg/mL)和2 mL游離酶相對應(yīng)量的固定化酶加入搖瓶中，以反應(yīng)減少的L-Thr來計(jì)算酶的活力。在37 ℃、450 r/min條件下反應(yīng)10 min，用氨基酸分析儀檢測底物L(fēng)-Thr的減少量，計(jì)算酶活。

酶活定義：在37 ℃、pH 8.0條件下每分鐘催化1 μmol的L-Thr所需的酶量定義為1 U。

相對酶活=固定化酶酶活/固定化酶的最高酶活×100%

(1)

酶活回收率=固定化酶的總活力/加入酶液的總活力×100%

(2)

1.2.5 分析方法

采用Sykam全自動氨基酸分析儀，建立氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)程序(25 min)。色譜柱為LCA k06/Na；流速和泵壓為S4300模塊0.25 mL/min、0.5 MPa，S2100模塊0.45 mL/min、4 MPa；溫度為57 ℃；檢測波長為570 nm；進(jìn)樣體積為0.05 mL，稀釋倍數(shù)2 500。

流動相配方Buffer A (1 L)：檸檬酸鈉11.8 g，檸檬酸6.0 g，苯酚0.5 g，辛酸0.1 mL，甲醇65 mL，37%HCl 5.6 mL；pH 3.45。

流動相配方Buffer B (1 L)：檸檬酸鈉19.6 g，硼酸5.0 g，NaOH 3.1 g，辛酸0.1 mL；pH 10.85。

再生液(1 L)：NaOH 20 g。

氨基糖苷類,主要針對抵抗革蘭陰性菌所致的感染,價(jià)格低廉適用范圍廣,在婦產(chǎn)科中得到廣泛應(yīng)用。但是各大醫(yī)院治療時(shí),仍將β-內(nèi)酰胺類抗菌藥作為首選。

茚三酮混合液 (1 L)：茚三酮20 g，苯酚2 g，甲醇600 mL，K-Na Buffer 400 mL，抗壞血酸0.2 g。其中，K-Na Buffer(1 L)：乙酸200 mL，三乙酸鈉272 g，乙酸鉀196 g；pH 5.51。

測得底物L(fēng)-Thr的峰面積以標(biāo)準(zhǔn)曲線y=37 791x+451.01，R2=0.994 06(x為L-蘇氨酸的濃度(mol/L)，y為570 nm處的峰面積)進(jìn)行濃度轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化條件的選擇

2.1.1 添加劑濃度對固定化酶活的影響

在利用仿生法制備SiO2固定化載體的過程中，添加劑的濃度會影響SiO2顆粒的大小和形狀，從而會對固定化酶的催化活力產(chǎn)生影響，因此考察添加劑濃度對固定化酶的影響，以硅氮比作為參考依據(jù)，硅酸濃度設(shè)為0.03 mol/L，設(shè)置不同摩爾比的硅氮比進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：當(dāng)硅氮比低于1∶ 1時(shí)，固定化過程中形成的SiO2顆粒相對較小，其凝結(jié)程度相對較低，致使固定化顆粒的力學(xué)強(qiáng)度偏低；而當(dāng)硅氮比高于1∶ 1時(shí)，SiO2顆粒的凝結(jié)程度增大，固定化顆粒更加致密，形成了較大的顆粒尺寸，抑制系統(tǒng)的傳質(zhì)效應(yīng)使得底物難以進(jìn)一步滲透到顆粒中，導(dǎo)致其相對酶活偏低。當(dāng)硅氮比為1∶ 1時(shí)，固定化酶的相對酶活最高，此時(shí)固定化酶凝結(jié)強(qiáng)度與孔徑大小達(dá)到平衡[10]。

圖1 添加劑濃度對固定化酶的影響Fig.1 Effect of additive concentration on immobilized enzyme activity

2.1.2 偏硅酸濃度對固定化酶活的影響

偏硅酸在溶液中呈陰離子狀態(tài)，而蛋白鏈在pH7.0條件下帶正電荷，向pH 7.0的偏硅酸溶液中加入酶蛋白誘導(dǎo)偏硅酸發(fā)生縮合，并且附著在酶蛋白表面，將其包埋。此時(shí)溶液中的偏硅酸需要處于相對較低的濃度，避免SiO2之間自發(fā)凝聚，影響包埋效果[8]?？疾炱杷釢舛葘潭ɑ富畹挠绊?，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：當(dāng)偏硅酸濃度為0.03 mol/L時(shí)，相對酶活最高，當(dāng)偏硅酸濃度較低時(shí)，不能有效地將酶全部包埋，形成的SiO2顆粒相對較少，造成游離酶的利用率偏低；而當(dāng)偏硅酸濃度大于0.03 mol/L時(shí)，SiO2之間會自發(fā)縮聚形成沉淀，使得偏硅酸的有效利用率降低，從而降低了固定化酶的相對酶活。

圖2 偏硅酸鈉濃度對固定化酶活的影響Fig.2 Effect of sodium metasilicate concentration on immobilized enzyme activity

2.1.3 酶添加量對固定化酶活的影響

納米SiO2對于酶的承載能力是有一定限度的，添加的酶蛋白濃度過高會超過SiO2載體的包埋能力，導(dǎo)致酶蛋白的浪費(fèi)。因此，考察酶蛋白濃度對固定化酶活的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：當(dāng)酶添加量為0.16 mg/mL時(shí)，固定化酶的相對酶活最高。當(dāng)酶的添加量從0.04 mg/mL逐漸增加時(shí)，SiO2載體所包埋的酶量逐漸增加，其相對酶活也隨之增加。當(dāng)酶的添加量達(dá)到0.16 mg/mL時(shí)，載體的包埋限度達(dá)到最大，再繼續(xù)添加酶蛋白，固定化酶的活力趨于穩(wěn)定，不再繼續(xù)上升。

圖3 酶添加量對固定化酶活的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on immobilized activity

2.2 氧化硅固定化酶的表征

在利用偏硅酸形成SiO2沉淀的仿生學(xué)研究中，以三乙烯四胺(TETA)作為添加劑，在溫和條件(pH=7.0，20 ℃)下加入酶蛋白誘導(dǎo)偏硅酸產(chǎn)生納米級SiO2顆粒(這種添加劑可調(diào)節(jié)氧化硅表面積、粒度、孔隙率等性質(zhì))。利用掃描電子顯微鏡考察了空載體SiO2顆粒和包含蘇氨酸脫氨酶的仿生SiO2納米球的形態(tài)和粒度，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：包含酶的固定化SiO2顆粒相對于空載體顆粒結(jié)構(gòu)更加致密，其在納米級上成網(wǎng)狀分布，平均直徑為200 nm，屬于大孔粒徑(孔徑>50 nm)[10]，這種網(wǎng)狀的大孔SiO2顆粒有利于保護(hù)酶的穩(wěn)定性。

圖4 空載體和固定化酶電鏡照片F(xiàn)ig.4 SEM images of empty silica particles and immobilized threonine deaminase

2.3 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 固定化酶催化反應(yīng)最適pH

調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為7.0～11.0，稱取一定量的固定化酶和游離酶進(jìn)行催化反應(yīng)，以酶活最高者為100%，考察固定化酶的最適pH，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，固定化酶和游離酶在pH 9.0時(shí)，相對酶活都是最高的。當(dāng)pH從7.0逐漸趨近9.0時(shí)，相對酶活逐漸增大，且游離酶相對于固定化酶的適應(yīng)性更強(qiáng)；當(dāng)pH從9.0逐漸增大時(shí)，相對酶活逐漸降低，此時(shí)固定化酶的下降趨勢比游離酶的趨勢平緩。在pH為9.0～10.0時(shí)，固定化酶的相對酶活下降了3.67%，而游離酶下降了24.78%，這表明該酶被固定在載體上后可以明顯提升對pH的耐受性，SiO2載體包埋酶可緩解高pH對酶分子的損害，這對工業(yè)化應(yīng)用具有優(yōu)勢。

圖5 pH對游離酶和固定化酶活力的影響Fig.5 Effects of pH on free enzyme and immobilized enzyme activity

2.3.2 固定化酶催化反應(yīng)最適溫度

在pH為9.0、底物濃度為0.5 mol/L的反應(yīng)體系中，稱取一定量的固定化酶和游離酶加入其中，考察固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度，以酶活最高者為100%，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：固定化酶和游離酶的相對酶活在45 ℃時(shí)，相對酶活都是最高的，當(dāng)溫度從30 ℃逐漸趨近45 ℃時(shí)，相對酶活逐漸增大，此時(shí)固定化酶相對于游離酶的適應(yīng)性更高。當(dāng)溫度從45 ℃開始逐漸升高時(shí)，相對酶活逐漸降低，此時(shí)固定化酶的下降趨勢相對游離酶更快。在溫度為35～50 ℃時(shí)，固定化酶的相對酶活下降了8.8%，而游離酶則降低了26.36%，表明仿生SiO2載體為酶蛋白提供了穩(wěn)定的微環(huán)境，避免了高溫給酶分子帶來的熱變性，使得固定化酶的溫度適應(yīng)范圍有所擴(kuò)大。

圖6 溫度對游離酶和固定化酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on free enzyme and immobilized enzyme

2.3.3 固定化酶與游離酶的Km值比較

取濃度在0～2 mmol/L的L-Thr溶液10 mL，分別取0.2 g固定化酶和2 mL游離酶液(10 mg/mL)，在45 ℃、pH 9.0條件下進(jìn)行反應(yīng)，測定L-Thr的減少量，按Lineweaver-Burk作圖法求出游離酶和固定化酶的Km值和Vmax值，結(jié)果如圖7所示。其中，v為表觀初始反應(yīng)速率，cs為底物濃度。由圖7可知：游離酶的Km值為3.54 mmol/L，而固定化酶的Km值為7.48 mmol/L，表明固定化酶與底物的親和力較游離酶小，因?yàn)槊附?jīng)過SiO2顆粒的包埋后，使得酶與底物之間產(chǎn)生了空間隔離，由于空間隔離以及擴(kuò)散阻力的影響，使得固定化酶的Km值較大。

圖7 游離酶和固定化酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Lineweaver-Burk curves of free enzyme and immobilized enzyme

2.3.4 固定酶輔酶PLP的添加量

PLP作為脫氨酶的輔酶，輔助脫氨酶脫去氨基，每個(gè)酶分子結(jié)合兩分子的磷酸吡哆醛，大大提高了底物的轉(zhuǎn)化效率[11-12]。在10 mL反應(yīng)體系中，底物濃度為0.5 mol/L，固定化酶0.2 g，添加輔酶量在0～50 μmol/L時(shí)，考察輔酶PLP的添加量對固定化酶活的影響,結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：當(dāng)添加PLP濃度為0～30 μmol/L時(shí)，酶的催化活性迅速增加，其相對酶活增加了54.06%;當(dāng)添加PLP濃度為30～50 μmol/L時(shí)，酶的催化活性增長速度放緩，其相對酶活增加了9.78%。這說明當(dāng)PLP的濃度達(dá)到30 μmol/L時(shí)，蘇氨酸脫氨酶結(jié)合輔酶的量已趨于飽和。

圖8 添加輔酶PLP對固定化酶的影響Fig.8 Effect of coenzyme PLP on immobilized enzyme

2.3.5 固定化酶的操作穩(wěn)定性研究

固定化酶的操作穩(wěn)定性是很重要的一個(gè)參數(shù)，這直接關(guān)系到固定化酶能不能達(dá)到生產(chǎn)要求，設(shè)置實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系:在pH 9.0、0.2 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液體系中加入底物0.4 mol/L，固定化酶0.02 g/mL，PLP 100 μmol/L，45 ℃反應(yīng)2 h。8 000 r/min離心5 min分離固定化酶，用pH 9.0、0.2 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液洗滌后，再次加入0.4 mol/L底物，進(jìn)行第二次反應(yīng)。以此方式進(jìn)行批次反應(yīng)，每次反應(yīng)結(jié)束后檢測固定化酶的剩余酶活，直到剩余酶活降到80%以下，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知：經(jīng)過15次循環(huán)后，固定化酶的相對酶活保持在80%以上，表明經(jīng)過SiO2包埋后的固定化酶對于溫度和pH的穩(wěn)定性有所提高，這可能由于酶被限制在微小的空間內(nèi)，SiO2載體對于酶的空間結(jié)構(gòu)有一定的支持作用，使得酶不容易變性[13]。另外，在pH保持穩(wěn)定的情況下，蘇氨酸脫氨酶與SiO2以及結(jié)合在SiO2里的胺相互作用，從而為蘇氨酸脫氨酶提供了有利的微環(huán)境，減少了環(huán)境對酶的影響。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明PLP能夠被納米SiO2固定化顆粒吸附，使其能夠重復(fù)利用。在實(shí)驗(yàn)檢測過程中相對酶活的降低，部分原因可歸結(jié)于離心和固定化酶轉(zhuǎn)移的因素。

圖9 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.9 Operational stability of immobilized enzyme

2.3.6 儲存穩(wěn)定性

為了考察固定化酶的穩(wěn)定性，將固定化酶和游離酶保存在4 ℃冰箱內(nèi)。每隔2 d取出相同質(zhì)量的固定化酶，在pH 9.0、0.2 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液及45 ℃條件下測其酶活，以游離酶和固定化酶的酶活最高者為100%，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知：游離酶在儲存了6 d后酶活僅保留了51.5%，而固定化酶的相對酶活仍有89.4 %，儲存10 d后其剩余酶活在85%以上。這說明氧化硅固定化蘇氨酸脫氨酶其儲存穩(wěn)定性有了明顯提高，此結(jié)果與Coradin等[8]的結(jié)果一致，使得此固定化方法在工業(yè)上應(yīng)用具有很大的潛力。

圖10 固定化酶和游離酶的儲存穩(wěn)定性Fig.10 Storage stability of immobilized enzyme and free enzyme

3 結(jié)論

1)通過仿生SiO2固定化方法，優(yōu)化了固定化過程的3個(gè)重要參數(shù)，確定了偏硅酸的最適濃度為0.03 mol/L，添加劑的添加比例為n(Si)∶n(N)=1∶ 1，酶添加量為0.16 mg/mL，此時(shí)固定化的效果最好，固定化酶活回收率93.6%，說明仿生硅載體是固定化蘇氨酸脫氨酶的良好載體。

2)固定化酶與游離酶相比，其適應(yīng)性和穩(wěn)定性得到改善。固定化酶的Km為7.48 mmol/L，比游離酶有所升高。在重復(fù)使用15批后，其相對酶活保持在80%以上，而且在4 ℃儲存了10 d以后剩余酶活保持在85%以上，說明固定化酶具有優(yōu)良的操作穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。

采用仿生法制備SiO2對酶蛋白進(jìn)行包埋的固定化方法，制備過程溫和，設(shè)備要求簡單，對環(huán)境友好，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

[1] 李興.酶法合成L-2-氨基丁酸及酶的固定化研究[D].上海:華東理工大學(xué),2013.

[2] 高啟禹,徐光翠,陳紅麗,等.納米材料固定化酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2013,34(6):20-24.

[3] BRUNNER E,LUTZ K,SUMPER M.Biomimetic synthesis of silica nanospheres depends on the aggregation and phase separation of polyamines in aqueous solution[J].Phys Chem Chem Phys,2004,6(4):854-857.

[4] BETANCOR L,LUCKARIFT H R.Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis[J].Trends Biotechnol,2008,26(10):566-572.

[5] FORSYTH C,PATWARDHAN S V.Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica[J].J Mat Chem B,2013,1(8):1164-1174.

[6] SWARTZ J D,MILLER S A,WRIGHT D.Rapid Production of nitrilase containing silica nanoparticles offers an effective and reusable biocatalyst for synthetic nitrile hydrolysis[J].Org Process Res Dev,2009,13(3):584-589.

[7] 李林.仿生氧化硅凝膠固定化β-D-葡萄糖醛酸苷酶的研究[D].天津:天津大學(xué),2008.

[8] CORADIN T,LIVAGE J.Synthesis,characterization and diffusion properties of biomimetic silica-coated gelatine beads[J].Mat Sci Eng C,2005,25(2):201-205.

[9] 侯紅萍,張茜.介孔分子篩SBA-15固定糖化酶的研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2011,11(2):147-151.

[10] LUCKARIFT H R,SPAIN J C,NAIK R R,et al.Enzyme immobilization in a biomimetic silica support[J].Nature Biotechnol,2004,22(2):211-213.

[11] 唐任天,郭永復(fù),陳琦.L-纈氨酸生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制的初步研究[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(英文版),1984(5):70-78.

[12] EISENSTEIN E.Cloning,expression,purification,and characterization of biosynthetic threonine deaminase fromEscherichiacoli[J].J Biol Chem,1991,266(9):5801-5807.

[13] ZHOU L,WANG C,JIANG Y,et al.Immobilization of papain in biosilica matrix and its catalytic property[J].Chin J Chem Eng,2013,21(6):670-675.

(責(zé)任編輯 荀志金)

Preparation of silica carrier immobilized threonine deaminase bybionic method and its enzymatic properties

LI Qiaoli,ZHAO Zhe,XU Jianmiao

(College of Biotechnology and Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

The inorganic silica carrier was prepared by coprecipitation and used to immobilize threonine deaminase. The silica carrier was characterized by scanning electron microscopy.Then immobilization conditions were optimized withn(Si)∶n(N) at 1∶ 1,the concentration of silicic acid at 0.03 mol/L,the amount of enzyme at 0.16 mg/mL.The optimal pH of the immobilized enzyme and the free enzyme was both 9.0,the optimal temperature was 45 ℃.Furthermore,the immobilized enzyme was more stable than the free enzyme under the conditions of pH between 9.0 and 10.0,and temperature between 35 and 50 ℃.TheKmvalue of the immobilized enzyme was 7.48 mmol/L,and the enzyme activity was maintained at 80% after 15 times of repeated application.The results suggested that the immobilized threonine deaminase prepared by bionic silica has high activity recovery,high mechanical strength and stable operation conditions.

silica; threonine deaminase; immobilization; enzymatic properties； nano materials

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.03.003

2017-02-08

浙江省公益性項(xiàng)目(2017C33157)

李巧麗(1991—)，女，湖北孝感人，研究方向：生物化工;徐建妙(聯(lián)系人)，高級工程師，E-mail:xujianmiao@zjut.edu.cn

Q814.2

A

1672-3678(2017)03-0012-06