肖運(yùn)柱，楊 鍵，張 偲，龍麗娟

(1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RNAM海洋微生物中心廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510301；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

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海洋細(xì)菌有機(jī)磷酸酐水解酶在大腸桿菌中的分泌表達(dá)研究

肖運(yùn)柱1,2，楊 鍵1,2，張 偲1,2，龍麗娟1,2

(1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RNAM海洋微生物中心廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510301；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

為了考察一種海洋細(xì)菌來(lái)源的有機(jī)磷酸酐水解酶OPAA4301在大腸桿菌中胞外分泌表達(dá)生產(chǎn)的可能性，筆者分別從信號(hào)肽和發(fā)酵條件兩方面對(duì)該酶在大腸桿菌中的產(chǎn)量及細(xì)胞定位情況進(jìn)行觀測(cè)和優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海洋細(xì)菌有機(jī)磷酸酐水解酶OPAA4301在大腸桿菌中可不依賴信號(hào)肽少量分泌至培養(yǎng)基上清中。以胞外酶產(chǎn)量為指標(biāo)，對(duì)誘導(dǎo)劑和甘氨酸添加量進(jìn)行優(yōu)化，確定適宜的誘導(dǎo)劑濃度為0.8 mmol/L，適宜甘氨酸添加量為10 g/L。在優(yōu)化條件下，重組酶蛋白的細(xì)胞定位主要由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞外，胞外酶活提高108.8倍，達(dá)0.28 U/mL，相當(dāng)于重組蛋白胞外生產(chǎn)能力為0.72 g/L。本研究為重組海洋細(xì)菌有機(jī)磷酸酐酶的工程化發(fā)酵生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

海洋細(xì)菌；有機(jī)磷酸酐水解酶；蛋白質(zhì)分泌表達(dá)；大腸桿菌；甘氨酸

有機(jī)磷化合物是一類含有碳-磷鍵或磷酸的有機(jī)衍生物，其中以磷酸酯或磷酸硫醇類化合物最常見(jiàn)，該類化合物能特異性磷酸化乙酰膽堿酯酶活性中心的絲氨酸，對(duì)生物體具有急性毒性效應(yīng)[1]。有機(jī)磷化合物廣泛應(yīng)用于殺蟲(chóng)劑、阻燃劑、增塑劑和石油添加劑等領(lǐng)域，由于大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用，在水體、土壤、食物、空氣和近岸海洋等區(qū)域都能檢測(cè)到有機(jī)磷化合物殘留，它已成為全球主要有機(jī)污染物之一[2-3]。環(huán)境微生物已進(jìn)化出多種可降解有機(jī)磷化合物的酶，這類酶可催化水解有機(jī)磷化合物中磷酸三酯鍵，從而將有機(jī)磷化合物轉(zhuǎn)化成無(wú)毒或毒性較小的物質(zhì)，具有生態(tài)修復(fù)應(yīng)用前景[4]。有機(jī)磷酸酐水解酶(EC 3.1.8.2)是微生物生產(chǎn)的主要有機(jī)磷降解酶源之一，已報(bào)道的有機(jī)磷酸酐水解酶主要分離自嗜鹽細(xì)菌Alteromonas屬，可以水解有機(jī)磷神經(jīng)毒劑沙林(sarin)、索曼(soman)和塔崩(tabun)等，并且能催化水解有機(jī)磷化合物的P-F、P-O和P-CN鍵[5-8]。

大腸桿菌是酶蛋白表達(dá)首選異源宿主之一。相較于其他物種宿主，大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白一般產(chǎn)量高，容易實(shí)現(xiàn)異源蛋白的超表達(dá)。然而，大腸桿菌主要以生產(chǎn)胞內(nèi)蛋白為主，且存在形成無(wú)活性包涵體、存在內(nèi)毒素及分離成本高等問(wèn)題。實(shí)現(xiàn)大腸桿菌胞外生產(chǎn)重組蛋白可在多方面彌補(bǔ)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)現(xiàn)存的不足[9]：可減少胞內(nèi)蛋白酶對(duì)重組蛋白的降解作用[10]；在分泌胞外的過(guò)程中可促進(jìn)重組蛋白的正確折疊，減少包涵體的產(chǎn)生[11]；還可以大幅降低重組蛋白生產(chǎn)下游分離純化成本。目前，常用的大腸桿菌胞外分泌表達(dá)重組蛋白的手段主要包括兩個(gè)方面，一是在蛋白N端插入信號(hào)肽序列，通過(guò)經(jīng)典分泌途徑如Sec系統(tǒng)、Tat系統(tǒng)等，將重組蛋白泵出細(xì)胞質(zhì)[12]；二是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加提高細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)，如蔗糖、Triton X-100和甘氨酸等，促進(jìn)重組蛋白的釋放[13]。

筆者前期從南海沉積物細(xì)菌Pseudoalteromonassp.SCSIO 04301中鑒定了一條可編碼有機(jī)磷酸酐水解酶活性的基因opaa4301，確定該基因催化水解有機(jī)磷化合物的功能由古老肽酶家族蛋白進(jìn)化而來(lái)，純酶催化水解對(duì)氧磷的比活力為0.39 U/mg[14]。

本研究中，筆者側(cè)重探討該基因在大腸桿菌中的異源分泌表達(dá)，以期為該酶的工程化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

菌株P(guān)seudoalteromonassp.SCSIO 04301，克隆宿主EscherichiacoliTOP10、表達(dá)宿主E.coliRosseta(DE3)、表達(dá)載體pET-22b(+)均保藏于熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基

細(xì)菌基因組和質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技有限公司；蛋白電泳試劑、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和氨芐青霉素鈉，上海生工生物工程股份有限公司；蛋白胨和酵母提取物，英國(guó)Oxoid 公司；EasyTaq? PCR SuperMix DNA聚合酶、TransStart? FastpfuDNA聚合酶和pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

以Pseudoalteromonassp.SCSIO 04301基因組DNA為模板，分別使用兩對(duì)引物22bOPAA4301-F：GAAGGAGATATACATATGGATAAATTAGCGGTGTT、22bOPAA4301-R：GTGGTGGTGGTGGTGATCTAAGTGTAGATCACGGGTCATA；22bSPOPAA4301-F：GAAGGAGATATACATATGAAATACCTGCTGCCGAC、22bSPOPAA4301-R：GTGGTGGTGGTGGTGATCTAAGTGTAGATCACGGGTCATA擴(kuò)增Pseudoalteromonassp.SCSIO 04301中有機(jī)磷酸酐水解酶基因opaa4301，下劃線部分為同源臂序列，用于與載體片段進(jìn)行無(wú)縫連接。以pET-22b(+)質(zhì)粒為模板，使用引物22b-F(CACCACCACCACCACCACTGAGAT)/22b-R(ATGTATATCTCCTTCTTAAAG)和22bSP-F(CACCACCACCACCACCACTGAGAT)/22bSP-R(ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACA)反向擴(kuò)增質(zhì)粒pET-22b(+)獲得線性載體片段pLET-22b(去除信號(hào)肽)和pLET-22bSP(包含信號(hào)肽)。PCR反應(yīng)均使用高保真DNA聚合酶，擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 kb/30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并切膠回收目的片段。

擴(kuò)增獲得的具有同源臂有機(jī)磷酸酐水解酶基因opaa4301分別與線性載體進(jìn)行無(wú)縫連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒分別命名為pET22b-opaa4301和pET22bSP-opaa4301，如圖1所示。無(wú)縫連接反應(yīng)體系：2×Assembly Mix 5.0 μL，目的片段1.0 μL，線性載體3.0 μL，雙蒸水1.0 μL。50 ℃水浴保溫15 min后將反應(yīng)液置于冰上冷卻數(shù)秒。連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化至E.coliTOP10細(xì)胞，氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR篩選及基因測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 重組載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram for the recombinant plasmids construction

1.3 基因opaa4301在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET22b-opaa4301和pET22bSP-opaa4301轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主E.coliRosseta(DE3)。將重組菌在直形瓶中37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以1%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL氨芐青霉素)中。在37 ℃、180 r/min搖床中劇烈振蕩培養(yǎng)2～3 h至OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，降溫至25 ℃，180 r/min搖床繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h。每隔8 h檢測(cè)有機(jī)磷酸酐水解酶胞內(nèi)、胞外酶活力，并進(jìn)行蛋白膠檢測(cè)。

1.4 SDS-PAGE分析重組蛋白定位

取2.0 mL發(fā)酵8 h的發(fā)酵液，5 000 r/min、4 ℃離心20 min。獲得發(fā)酵上清液和細(xì)胞沉淀。發(fā)酵上清液過(guò)0.45 μm濾膜，加入三氯乙酸至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，4 ℃沉淀過(guò)夜后10 000 r/min、4 ℃離心30 min收集沉淀，冰凍預(yù)冷的丙酮洗滌沉淀重復(fù)3次。收集沉淀于40 ℃烘干，即得胞外總蛋白。細(xì)胞沉淀用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)緩沖液重懸，冰上放置預(yù)冷20 min，超聲破碎后12 000 r/min離心5 min，獲得胞內(nèi)上清和不溶細(xì)胞沉淀。

上述胞外總蛋白和不溶細(xì)胞沉淀使用少量8 mol/L尿素助溶后加入50 μL 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)緩沖液。取各細(xì)胞組分溶液20 μL，加入5 μL 的上樣緩沖液，沸水處理10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，考馬斯亮藍(lán)R-250染料染色。

1.5 酶活測(cè)定

通過(guò)測(cè)定有機(jī)磷酸酐水解酶水解對(duì)氧磷生成對(duì)硝基苯酚的量來(lái)檢測(cè)酶活性[15]。取稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液25 μL，加入200 μL 50 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.5)和25 μL 5 mmol/L對(duì)氧磷母液(溶于丙酮)，反應(yīng)體系為250 μL。55 ℃水浴40 min，迅速放入沸水浴中終止反應(yīng)。12 000 r/min離心上述反應(yīng)液5 min，取200 μL上清液在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。對(duì)照管的處理以同樣量的甘氨酸-NaOH緩沖溶液取代酶液，其余操作與測(cè)定管相同。有機(jī)磷酸酐水解酶酶活力單位(U)定義：在55 ℃、pH 8.5的條件下，每分鐘水解1.0 μmol底物即產(chǎn)生1.0 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。有機(jī)磷酸酐水解酶酶活力計(jì)算見(jiàn)式(1)。

有機(jī)磷酸酐水解酶酶活力=

(1)

式中：A405為反應(yīng)液405 nm吸光值；0.000 7為對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；250為反應(yīng)總體積(μL)；N為酶液稀釋倍數(shù)；0.010 5為對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；1 000為單位換算倍數(shù)；25為吸取酶液的體積(μL)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.6 發(fā)酵條件對(duì)重組菌產(chǎn)酶性能的影響

1.6.1 IPTG濃度對(duì)產(chǎn)酶性能的影響

將構(gòu)建好的不含信號(hào)肽的重組菌株E.coliRosseta (DE3)-pET22b-opaa4301接種到含50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)得種子液。種子培養(yǎng)液按1%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL新鮮LB培養(yǎng)基的搖瓶中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6，分別加入不同濃度的IPTG(終濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L)誘導(dǎo)，25 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。測(cè)定菌懸液的OD600、有機(jī)磷酸酐水解胞內(nèi)酶活及胞外酶活。

1.6.2 甘氨酸添加對(duì)產(chǎn)酶性能的影響

將不含信號(hào)肽的重組菌株E.coliRosseta (DE3)-pET22b-opaa4301的種子液按1%接種量接種到50 mL LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素終質(zhì)量濃度50 μg/mL)中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，添加不同濃度的甘氨酸(0、5、10、15、20、25和30 g/L)，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)2 h，然后加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，于25 ℃、180 r/min搖床中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌液的OD600、有機(jī)磷酸酐水解酶總酶活及胞外酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)磷降解酶OPAA4301的胞外分泌表達(dá)不依賴信號(hào)肽的引導(dǎo)

利用SignalP 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)海洋細(xì)菌Pseudoalteromonassp. SCSIO 04301來(lái)源的有機(jī)磷酸酐水解酶OPAA4301進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果推測(cè)該酶N端不存在可引導(dǎo)蛋白分泌的氨基酸序列。為了實(shí)現(xiàn)該酶的異源分泌表達(dá)，考察在其N端添加信號(hào)肽對(duì)其分泌效應(yīng)的影響，分別構(gòu)建OPAA4301融合與不融合PelB信號(hào)肽的重組表達(dá)載體pET22bSP-opaa4301和pET22b-opaa4301，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。在0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h后，分別取發(fā)酵液上清和細(xì)胞裂解液，以對(duì)氧磷為底物檢測(cè)酶活力，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：重組有機(jī)磷酸酐水解酶OPAA4301主要以胞內(nèi)酶形式表達(dá)，N端融合PelB信號(hào)肽會(huì)使重組酶的表達(dá)量下降，總酶活(22bOPAA4301-T)(胞內(nèi)酶活與胞外酶活(E)之和)從0.40 U/mL下降為0.22 U/mL。攜帶信號(hào)肽序列的有機(jī)磷酸酐水解酶OPAA4301未能分泌至大腸桿菌細(xì)胞外，而N端未融合信號(hào)肽的有機(jī)磷水解酶反而能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，其胞外酶活力為2.37×10-4U/mL。這種不通過(guò)信號(hào)肽實(shí)現(xiàn)重組蛋白在大腸桿菌胞外分泌是十分罕見(jiàn)的，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的帶信號(hào)肽的重組菌胞外都能分泌重組酶，而不帶信號(hào)肽的重組質(zhì)粒菌胞外檢測(cè)不到酶活，這樣的結(jié)論不同。

1—22bOPAA4301-E；2—22bSPOPAA4301-E；3—22bOPAA4301-T；4—22bSPOPAA4301-T圖2 重組酶活性分布情況Fig.2 Distribution of recombinant enzyme activity

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1—NTA-Ni 純化后OPAA4301蛋白;2—22bSPOPAA4301胞內(nèi)不溶性蛋白;3—22bOPAA4301胞內(nèi)不溶性蛋白;4—22bSPOPAA4301胞內(nèi)可溶性蛋白;5—22bPOPAA43011胞內(nèi)可溶性蛋白;6—22bSPOPAA4301發(fā)酵液上清;7—22bOPAA4301發(fā)酵液上清;8—含pET22b的E.coli Rosseta (DE3)全細(xì)胞蛋白圖3 重組菌株發(fā)酵上清、胞內(nèi)上清及胞內(nèi)不溶物的 SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of fermentation supernatant, intracellular supernatant and intracellular insoluble protein

2.2 SDS-PAGE分析確定重組酶OPAA4301的細(xì)胞定位

對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)獲得的重組菌22bOPAA4301和22bSPOPAA4301發(fā)酵上清液、胞內(nèi)上清液和胞內(nèi)不溶物進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，無(wú)信號(hào)肽重組菌發(fā)酵胞外上清在約5.0×104處存在重組酶的特異性條帶(第7孔道)，而含有信號(hào)肽的重組菌發(fā)酵上清液中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象，說(shuō)明無(wú)信號(hào)肽重組菌發(fā)酵8 h后可以把重組酶分泌到胞外，而有信號(hào)肽的重組菌在對(duì)應(yīng)位置無(wú)明顯蛋白條帶。SDS-PAGE分析結(jié)果與前述酶活測(cè)定結(jié)果一致，證實(shí)重組大腸桿菌22bOPAA4301可在無(wú)信號(hào)肽引導(dǎo)的情況下分泌有機(jī)磷酸酐水解酶OPAA4301至細(xì)胞外。這種分泌機(jī)制有可能是細(xì)胞內(nèi)的重組蛋白發(fā)生非特異性滲漏到達(dá)細(xì)胞外，細(xì)胞的非特異性滲漏對(duì)重組蛋白的胞外分泌是非常重要的。造成重組蛋白滲漏的原因可能是：在培養(yǎng)過(guò)程中由于細(xì)胞分裂導(dǎo)致重組蛋白滲漏[17]；重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)大量積累導(dǎo)致胞內(nèi)形成高滲透壓，從而產(chǎn)生跨外膜驅(qū)動(dòng)力[18]；重組蛋白的產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞膜產(chǎn)生混亂，從而影響了細(xì)胞膜的選擇滲透性，并可能引起細(xì)胞破裂[19-20]。此外，無(wú)信號(hào)肽和有信號(hào)肽的重組菌胞內(nèi)不溶物的SDS-PAGE圖譜上都沒(méi)有特異性條帶(第2、3孔道)，說(shuō)明重組菌在發(fā)酵過(guò)程中幾乎不形成由于錯(cuò)誤折疊而形成的不溶性包涵體。

2.3 重組菌產(chǎn)有機(jī)磷酸酐水解酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)劑IPTG添加濃度對(duì)產(chǎn)酶性能的影響

前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)磷酸酐水解酶OPAA4301基因在大腸桿菌中異源表達(dá)時(shí)，其N端不添加信號(hào)肽序列不僅總表達(dá)量較高，還能使一部分的重組酶分泌至細(xì)胞外。為了考察發(fā)酵條件的改變能否進(jìn)一步提高胞外重組酶的產(chǎn)量，本部分從誘導(dǎo)劑和甘氨酸的添加兩方面對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同終濃度的IPTG(0～1.2 mmol/L)，25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，考察IPTG濃度對(duì)重組菌產(chǎn)重組酶22bOPAA4301酶活力的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：在不添加IPTG的情況下，重組菌的表達(dá)存在微量泄露。隨著誘導(dǎo)劑IPTG濃度的增加，重組菌對(duì)有機(jī)磷酸酐水解酶基因的表達(dá)量逐漸上升；當(dāng)IPTG濃度為0.8 mmol/L時(shí)，胞外酶活達(dá)到最高為2.64×10-3U/mL；IPTG濃度為1.0 mmol/L時(shí)，胞內(nèi)酶活達(dá)到最高為0.66 U/mL；當(dāng)IPTG濃度高于1.0 mmol/L時(shí)，大腸桿菌對(duì)重組酶的表達(dá)量有下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)楦邼舛鹊腎PTG對(duì)細(xì)胞具有一定毒性，會(huì)影響大腸桿菌正常生長(zhǎng)繁殖和代謝功能，從而導(dǎo)致重組酶的表達(dá)下調(diào)[21]。

圖4 IPTG濃度對(duì)重組大腸桿菌胞外酶活、 胞內(nèi)酶活和細(xì)胞濃度的影響Fig.4 Effects of IPTG concentration on the extracellular enzyme activity,intracellular enzyme activity and cell concentration of recombinant strain

圖5 甘氨酸濃度對(duì)重組菌胞外酶活、 總酶活和細(xì)胞濃度的影響Fig.5 Effects of glycine concentration on the extracellular enzyme activity,total enzyme activity and cell concentration of recombinant strain

2.3.2 甘氨酸濃度對(duì)有機(jī)磷酸酐水解酶酶活的影響

在大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)重組酶的過(guò)程中，向培養(yǎng)基添加能夠改變細(xì)胞膜通透性的化學(xué)物質(zhì)，如Mg2+、Ca2+、EDTA、甘氨酸和Triton X-100等，能促進(jìn)重組酶透過(guò)細(xì)菌雙層膜向胞外分泌[9,22]，其中，以甘氨酸促進(jìn)大腸桿菌分泌表達(dá)的報(bào)道最為常見(jiàn)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的甘氨酸，考察其對(duì)重組菌株分泌表達(dá)有機(jī)磷酸酐水解酶的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：甘氨酸的添加可顯著促進(jìn)重組酶在大腸桿菌中的胞外分泌，當(dāng)甘氨酸為10 g/L時(shí)，在誘導(dǎo)24 h后,培養(yǎng)基上清中有機(jī)磷酸酐水解酶酶活達(dá)到0.28 U/mL(相當(dāng)于重組酶的分泌表達(dá)產(chǎn)量達(dá)0.72 g/L)，比沒(méi)有添加甘氨酸條件下的胞外酶活提高108.8倍，且胞外重組蛋白占總重組酶表達(dá)量的近80%。添加甘氨酸能促進(jìn)重組蛋白分泌，但會(huì)降低細(xì)胞濃度，10 g/L的甘氨酸添加量可使細(xì)胞濃度下降近1倍，且隨著甘氨酸濃度的增加，發(fā)酵液中細(xì)胞濃度會(huì)進(jìn)一步降低。低濃度的甘氨酸可以作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)重組酶的合成及細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，而當(dāng)甘氨酸濃度過(guò)高，細(xì)胞膜通透性增加超過(guò)細(xì)菌承載能力，降低了細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，表現(xiàn)為細(xì)胞濃度的迅速下降[23-25]。劉軍彤等[26]研究了甘氨酸濃度對(duì)蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活和總酶活的影響，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)加甘氨酸質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶的總酶活和胞外酶活最高；當(dāng)補(bǔ)加甘氨酸質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶的分泌效率最高，但細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯影響。

3 結(jié)論

本研究首次報(bào)道海洋細(xì)菌Pseudoalteromonassp.SCSIO 04301來(lái)源的有機(jī)磷酸酐水解酶可在大腸桿菌中不依賴信號(hào)肽直接分泌至發(fā)酵液中，同時(shí)通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化將重組酶以胞內(nèi)表達(dá)為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐园獗磉_(dá)為主，胞外重組蛋白產(chǎn)量提高108.8倍，胞外酶蛋白生產(chǎn)能力達(dá)0.72 g/L。今后的研究將集中在兩方面，一是對(duì)重組蛋白分泌機(jī)理的深入探討。在大腸桿菌中通過(guò)不依賴經(jīng)典分泌系統(tǒng)的途徑實(shí)現(xiàn)胞外分泌較為罕見(jiàn)，本文研究的有機(jī)磷酸酐水解酶是一種兼具酯酶和肽酶活性的多功能酶，是否該酶還能破壞大腸桿菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁這有待更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)證實(shí)。二是進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝。本文僅從誘導(dǎo)劑和甘氨酸添加兩個(gè)方面對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)胞外重組蛋白生產(chǎn)能力已經(jīng)大幅提高，我們認(rèn)為該酶的產(chǎn)量還有進(jìn)一步提高的空間。優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程的其他參數(shù)，并進(jìn)行上罐實(shí)驗(yàn)，期望重組蛋白的胞外產(chǎn)量達(dá)克級(jí)以上水平。

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(責(zé)任編輯 管珺)

Expression of a marine bacterial organophosphorusacid anhydrolase inEscherichiacoli

XIAO Yunzhu1,2,YANG Jian1,2,ZHANG Si1,2,LONG Lijuan1,2

(1.Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica,RNAM Center for Marine Microbiology,CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-Resources and Ecology,South China Sea Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510301,China; 2.University of the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

To realize the expression of recombinant marine bacterial organophosphorus acid anhydrolase OPAA4301 inEscherichiacoli,we optimized fermentation production.Two factors,signal peptide and culture condition,were assumed critical in secretion of recombinant enzymes.Our results showed that detectable organophosphorus acid hydrolase was found in the culture supernatant of recombinantE.coliconstructed without signal peptide at the N-terminal of the enzyme.Using the secretory expression level as target,we studied the effects of supplementation of inducer and glycine.The optimized concentrations of inducer and glycine were determined to be 0.8 mmol/L and 10 g/L.Under the optimized conditions,the cellular localization of recombinant enzyme was converted from intracellular to extracellular,and the extracellular enzyme expression level improved by 108.8 folds.The maximum extracellular enzyme activity reached 0.28 U/mL,which is the equivalent of 0.72 g/L for the production capacity of recombinant enzyme.Our study can provide theoretical basis for producing recombinant marine bacterial organophosphorus acid anhydrolase.

marine bacterial; organophosphorus acid anhydrolase; protein secretion and expression;Escherichiacoli; glycine

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.03.001

2017-02-05

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(41406193)；廣東海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(GD2012-D01-002)；中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDA10030404、XDA13020301)

肖運(yùn)柱(1988—)，男，江西吉安人，博士研究生，研究方向：海洋生物學(xué)；龍麗娟(聯(lián)系人)，研究員，E-mail:longlj@scsio.ac.cn.

Q851

A

1672-3678(2017)03-0001-06