徐海軍,張存娟,周寧娟,蘇 慧,孫 新(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科,西安 700;楊凌示范區(qū)醫(yī)院兒科;第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科;通訊作者,E-mail:sunxin6@fmmu.edu.cn)

脂聯(lián)素對(duì)低氧條件下大鼠肺微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NO生成的促進(jìn)作用及其機(jī)制

徐海軍1,2,張存娟1,周寧娟1,蘇 慧3,孫 新1*
(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科,西安 710032;2楊凌示范區(qū)醫(yī)院兒科;3第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科;*通訊作者,E-mail:sunxin6@fmmu.edu.cn)

目的 重組人球狀脂聯(lián)素(APN)促進(jìn)低氧條件下大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs)NO的生成,探討其潛在的分子機(jī)制研究。 方法 原代培養(yǎng)SD大鼠PMVECs,傳至第3代經(jīng)免疫組化法鑒定細(xì)胞傳至第3代鑒定細(xì)胞;PMVECs分4組,常氧組(210 ml/L O2,37 ℃);低氧組(20 ml/L O2);低氧+APN組(20 ml/L O2+APN 1 μg/ml),低氧+APN+L-NAME組(20 ml/L O2,+APN 1 μg/ml+L-NAME 1 μg/ml)處理,各組細(xì)胞同時(shí)處理(加藥)后,培養(yǎng)12 h收集上清,硝酸還原法測(cè)NO濃度,RT-PCR測(cè)定eNOS mRNA的基因表達(dá)Western blot檢測(cè)AMPK/p-AMPK、PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt、eNOS/p-eNOS蛋白表達(dá)。 結(jié)果 鑒定細(xì)胞為PMVECs。與常氧組比較,低氧組NO濃度、eNOS mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.01);與低氧組比較,低氧+APN組低氧誘導(dǎo)的NO濃度、eNOS mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01);L-NAME可阻斷NO的產(chǎn)生和eNOS mRNA的表達(dá)。各組AMPK、PI3K、Akt、eNOS總蛋白表達(dá)量無(wú)差異;與常氧組比較,低氧組中AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化表達(dá)水平下降(P<0.05);與低氧組比較,低氧+APN組AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化表達(dá)水平增加(P<0.05);與低氧+APN組比較,低氧+APN+L-NAME組AMPK、PI3K、Akt磷酸化表達(dá)水平?jīng)]有變化(P>0.05);L-NAME可阻斷eNOS磷酸化的表達(dá)(P<0.01)。 結(jié)論 低氧條件下APN可促進(jìn)PMVECs生成NO,其可能機(jī)制是AMPK/PI3K/Akt/eNOS/NO信號(hào)通路的激活。

脂聯(lián)素； 肺微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞； 信號(hào)通路； 一氧化氮

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是起源于肺動(dòng)脈、最終影響心臟的微小血管疾病[1],主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈阻力持續(xù)性升高、平滑肌增生、原位血栓形成,損害肺細(xì)小動(dòng)脈和肺動(dòng)脈壓力持續(xù)上升的惡性肺血管疾病[2],最終死于右心室容量超負(fù)荷導(dǎo)致的右心衰竭。低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxia pulmonary hypertension,HPH)是PAH中最常見類型,低氧引起PMVECs的功能障礙,主要表現(xiàn)為PMVECs生成一氧化氮(NO)減少,后者目前被認(rèn)為是最重要的舒血管因子[1]。所以,增加PMVECs NO的生成,促進(jìn)和改善低氧誘導(dǎo)PMVECs功能障礙是治療低氧性肺動(dòng)脈高壓的關(guān)鍵。

脂聯(lián)素(APN)是脂肪細(xì)胞分泌的一種重要的脂肪因子,研究已經(jīng)證實(shí),低脂聯(lián)素血癥是心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,動(dòng)物研究表明增加APN濃度能夠改善肥胖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,降低血壓[3]。APN能夠改善血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS功能障礙和提高血管對(duì)NO的生物利用度[4]。

目前,APN研究的重點(diǎn)主要集中在高血壓和心肌疾病上,是否對(duì)肺動(dòng)脈高壓有作用還不清楚。本課題組前期通過(guò)SD大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓模型,證實(shí)了APN對(duì)大鼠肺動(dòng)脈PMVECs具有獨(dú)立的保護(hù)作用[5]。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究APN通過(guò)促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的PMVECs NO生成,降低血管緊張度,達(dá)到降低肺動(dòng)脈高壓的作用,并探討其潛在的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

SPF級(jí)6-8周齡SD雄性大鼠,生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(軍)2012-0007,體質(zhì)量150-180 g,由解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。澳洲胎牛血清(賽奧美細(xì)胞技術(shù)有限公司,血清產(chǎn)地:澳大利亞),DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibcro公司),內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(50×)(美國(guó)Gibcro公司),10%胰蛋白酶(美國(guó)Gibcro公司),APN(Recombinant Human gAcrp30/Adipolean)(美國(guó)Peprotech公司),CD31抗體(美國(guó)Abcam公司),FITC標(biāo)記的IgG(美國(guó)Abbkine公司),DAPI(上海碧云天生物技術(shù)研究所),NO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所),PVDF膜(美國(guó)Biosharp公司),p-AMPK/AMPK抗體、p-PI3K/PI3K抗體、p-Akt/Akt抗體(美國(guó)Cell Sinaling 公司),p-eNOS/eNOS抗體(美國(guó)BD公司),辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 SD大鼠PMVECs的鑒定和實(shí)驗(yàn)分組

取大鼠肺邊緣剪成1 mm×1 mm小塊組織,制備PMVECs單細(xì)胞懸液,原代培養(yǎng)至第3代,玻片上細(xì)胞匯合至70%以上進(jìn)行鑒定。免疫組化檢測(cè)PMVECs表面標(biāo)志物(CD31)抗原。PMVECs經(jīng)CD31抗體(一抗),4 ℃孵化過(guò)夜,異硫酸熒光標(biāo)記植物凝集素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(二抗)孵育,DAPI核復(fù)染,免疫熒光顯微鏡下鑒定。將第3代PMVECs經(jīng)10%胰蛋白酶消化后的細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度調(diào)整至(2.5-5.0)×105/ml,以5.0×104/cm2密度接種至4個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng),待鋪滿>60%瓶底時(shí),分為常氧組(210 ml/L O2,37 ℃);低氧組(20 ml/L O2);低氧+APN(1 μg/ml)組,低氧+APN(1 μg/ml)+L-NAME(1 μg/ml)組處理,同時(shí)培養(yǎng)12 h。

1.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清NO測(cè)定

將試劑和待檢測(cè)樣品按照NO試劑盒說(shuō)明書要求分別加入各管混勻,靜置10 min,波長(zhǎng)550 min,光徑0.5 cm,雙蒸水調(diào)零,測(cè)各管OD值,根據(jù)公式計(jì)算各組細(xì)胞上清NO濃度。

1.4 RT-PCR測(cè)定eNOS mRNA基因表達(dá)

棄去上清的PMVECs瓶?jī)?nèi)加入1 ml Trizol提細(xì)胞總RNA,RT-PCR法檢測(cè)eNOS mRNA表達(dá),以β-actin作為內(nèi)參。設(shè)計(jì)引物為:Forward:5′-CAAGACCGATTACACGACATTGAGA-3′;Reverse:5′-TGAGGACTTGTCCAAACACTCCAC-3′。反轉(zhuǎn)錄:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s;PCR擴(kuò)增條件:95 ℃,30 s;變性95 ℃,5 s;退火60 ℃,30 s;共40個(gè)循環(huán)。以相對(duì)數(shù)形式表示(2-ΔΔCt),ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin;ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對(duì)照組。

1.5 PMVECs的AMPK/p-AMPK、PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt、eNOS/p-eNOS蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)

棄去上清的PMVECs加入裂解液濃度為1 mmol/L,冰上使細(xì)胞充分裂解,采用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度,取等量蛋白加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合并煮沸10 min,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜PVDF后分別加入一抗p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS單克隆抗體,濃度均為1 ∶1 000,4 ℃過(guò)夜,羊抗兔IgG抗體(二抗)孵育,清洗3遍,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光Western blot條帶,Image J軟件計(jì)算和分析各組目的條帶灰度值比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PMVECs鑒定

倒置相差顯微鏡下PMVECs細(xì)胞邊界清楚,呈典型的“鵝卵石” 樣形態(tài)或“鋪路石”樣排列,胞質(zhì)豐富;CD31表達(dá)呈陽(yáng)性,細(xì)胞膜表面發(fā)紅熒光,經(jīng)DAPI復(fù)染細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光(見圖1)。

A.×200 B.×400圖1 PMVECs免疫組織化學(xué)鑒定Figure 1 Identification of PMVECs by immunohistochemical method

2.2 培養(yǎng)液上清NO的測(cè)定

與常氧組比較,低氧組NO濃度顯著下降(P<0.01);與低氧組比較,低氧+APN組NO濃度顯著增加(P<0.01);與常氧組、低氧組、低氧+APN組比較,低氧+APN+L-NAME組NO濃度顯著下降(P<0.01，見圖2)。

2.3 eNOS mRNA基因的的表達(dá)水平

與常氧組比較,低氧組eNOS mRNA基因表達(dá)水平顯著下降(P<0.01);與低氧組比較,低氧+APN組eNOS mRNA基因表達(dá)水平顯著增加(P<0.01);與常氧組、低氧組、低氧+APN組比較,低氧+APN+L-NAME組eNOS mRNA基因表達(dá)水平顯著下降(P<0.01，見圖3)。

2.4 AMPK/p-AMPK、PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt、eNOS/p-eNOS的的表達(dá)水平水平

四組AMPK、PI3K、Akt、eNOS總蛋白表達(dá)不變;與常氧組比較,低氧誘導(dǎo)的AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化表達(dá)水平下降(P<0.05);與低氧組比較,低氧+APN組增加低氧誘導(dǎo)的AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化表達(dá)水平(P<0.05);L-NAME可阻斷eNOS磷酸化的表達(dá)(見圖4)。

與常氧組比較，*P<0.01;與低氧組比較，#P<0.01;與其他三組比較，△P<0.01圖2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清NO濃度檢測(cè)(n=7)Figure 2 Concentration of NO in supernatant determined by nitrate reductive enzymatic method(n=7)

與常氧組比較，*P<0.01;與低氧組比較，#P<0.01;與其他三組比較，△P<0.01圖3 用RT-PCR測(cè)定各組細(xì)胞eNOS mRNA基因相對(duì)表達(dá)量(n=7)Figure 3 Expression of eNOS mRNA by RT-PCR(n=7)

3 討論

目前認(rèn)為[7]早期低氧性肺動(dòng)脈收縮反應(yīng)(HPV)和后期合并肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重建(PVR)是HPH最主要的兩個(gè)發(fā)病環(huán)節(jié)。長(zhǎng)期低氧PMVECs功能障礙,最主要表現(xiàn)NO生成減少引起血管舒縮失衡。因此,從源頭上保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,增加NO生成;延緩肺動(dòng)脈血管的重建成為治療HPH的關(guān)鍵。APN是一種內(nèi)源性胰島素增敏劑[8],具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)代謝、 抗炎及保護(hù)心肌細(xì)胞等多種生物學(xué)作用,成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。苗蘭等[9]在2%O2條件下,大鼠PMVECs經(jīng)體外培養(yǎng)12 h后,細(xì)胞存活率降低,生化指標(biāo)改變,細(xì)胞骨架基本完整,PMVECs功能障礙。本實(shí)驗(yàn)在低氧條件下誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生成NO濃度,給予APN后NO明顯增加;在細(xì)胞水平上證實(shí)了APN可能通過(guò)APMK/PI3K/Akt/eNOS/NO通路的激活發(fā)揮對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用,達(dá)到治療肺動(dòng)脈高壓的作用。

1.常氧組； 2.低氧組； 3.低氧+APN組； 4.低氧+APN+L-NAME組;與常氧組比較，*P<0.05;與低氧組比較，#P<0.05;與低氧+APN組比較，△△P<0.01圖4 各組細(xì)胞總AMPK、Akt、PI3K、eNOS水平和磷酸化表達(dá)的表達(dá)的水平 (n=7)Figure 4 Protein levels of AMPK/p-AMPK，PI3K/p-PI3K,Akt/p-Akt and eNOS/p-eNOS detected by Western blot (n=7)

Kajimoto等[10]認(rèn)為,內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“鵝卵石”樣形態(tài),內(nèi)皮細(xì)胞膜表面特異性CD31高表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞為PMVECs呈典型的“鵝卵石”樣,細(xì)胞膜表面特異性CD31高表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌多種生物活性物質(zhì),包括細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子等調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)[11]。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)L-Arg-NO途徑由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成NO[12],NO單純擴(kuò)散進(jìn)入血管平滑肌,平滑肌舒張,緊張度下降使血管舒張。研究[13]表明,低氧減少內(nèi)皮細(xì)胞依賴的eNOS基因表達(dá)和誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,最主要表現(xiàn)為NO生成減少[14]和生物活性下降[15]導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞依賴的平滑肌舒張降低。我們的實(shí)驗(yàn)表明,與常氧組比較,低氧組NO濃度顯著下降(P<0.01),eNOS mRNA基因表達(dá)水平顯著下降(P<0.01),表明低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙;與低氧組比較,低氧+APN組NO濃度顯著增加(P<0.01),eNOS mRNA基因表達(dá)水平顯著增加(P<0.01),表明APN能夠改善低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,增加NO生成;與常氧、低氧、低氧+APN組比較,低氧+APN+L-NAME組NO濃度顯著下降(P<0.01),eNOS mRNA基因表達(dá)水平顯著下降(P<0.01),APN改善低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可被 eNOS 抑制劑 L-NAME 阻斷。Chen等[16]認(rèn)為APN通過(guò)AMPK通路激活eNOS,使其磷酸化,增加NO舒張血管。 Western blot結(jié)果顯示,各組AMPK、PI3K、Akt、eNOS總蛋白表達(dá)不變;與常氧組比較,低氧組AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化水平下降(P<0.05);與低氧組比較,低氧+APN組AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化水平增加(P<0.05);與低氧+APN組比較,低氧+APN+L-NAME組AMPK、PI3K、Akt磷酸化水平?jīng)]有變化(P>0.05);L-NAME可阻斷eNOS磷酸化水平(P<0.01),說(shuō)明APN對(duì)低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用可能是通過(guò)AMPK/PI3K/Akt/eNOS/NO通路實(shí)現(xiàn)。

生理情況下,內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)AMPK/PI3K/Akt/eNOS通路生成NO維持血管的舒張作用;低氧可誘導(dǎo)PMVECs功能障礙,主要表現(xiàn)為NO生成減少,血管舒張功能降低,緊張度增加形成肺動(dòng)脈高壓。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了,APN能夠通過(guò)AMPK/PI3K/Akt/eNOS/NO通路糾正低氧誘導(dǎo)PMVECs功能障礙,增加eNOS mRNA基因表達(dá)和NO生成,血管舒張功能,降低肺動(dòng)脈高壓。

本研究表明,本研究結(jié)果表明,在細(xì)胞水平上,APN具有獨(dú)立地降低低氧性肺動(dòng)脈高壓的作用,其可能的機(jī)制為AMPK/PI3K/Akt/eNOS/NO通路的激活,APN可能成為潛在用于治療低氧性肺動(dòng)脈高壓的輔助藥物。

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Effect of diponectinon on hypoxia-induced pulmonary microvascular endothelial cells and its mechanism

XU Haijun1,2,ZHANG Cunjuan1,ZHOU Ningjuan1,SU Hui3,SUN Xin1*
(1DepartmentofPediatrics，XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China;2DepartmentofPediatrics，HospitalofYanglingDemonstrationDistrict;3DepartmentofGeriatrics，XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:sunxin6@fmmu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the production of NO in rat pulmonary microvascular endothelial cells(PMVECs) under hypoxia，and to explore the underlying molecular mechanisms.MethodsThe third passage of primary culture PMVECs from SD rat were identified by immunohistochemical method and divided into four groups.The PMVECs in four groups were cultured respectively under normoxia condition(210 ml/L O2，37 ℃)，hypoxia condition(20 ml/L O2)，hypoxia condition(20 ml/L O2)+APN (1 μg/ml)，hypoxia condition(20 ml/L O2)+APN (1 μg/ml)+L-NAME (1 μg/ml).Supernatant and cell lysate were collected after culture for 12 h.The concentration of NO in supernatant was determined by nitrate reductive enzymatic method，the expression of eNOS mRNA was detected by RT-PCR，and protein levels of AMPK/p-AMPK，PI3K/p-PI3K,Akt/p-Akt and eNOS/p-eNOS were detected by Western blot in each group.ResultsPrimary culture PMVECs were successfully identified.NO production and expression of eNOS mRNA in hypoxia group decreased significantly compared with normoxia group(P<0.01).NO production and eNOS mRNA expression in hypoxia+ANP group were significantly higher than those in hypoxia group(P<0.01).L-NAME deceased the production of NO and the expression of eNOS mRNA(P<0.01).There was no significant difference in total protein levels of AMPK，PI3K,Akt and eNOS among the four groups.Phosphorylated AMPK，PI3K,Akt and eNOS decreased significantly in hypoxia group compared with normoxia group(P<0.05).Phosphorylated AMPK，PI3K,Akt and eNOS increased significantly in hypoxia+ANP group compared with hypoxia group(P<0.05).Phosphorylated AMPK，PI3K and Akt showed no significant difference between hypoxia+ANP+L-NAME group and hypoxia+ANP group(P<0.05).L-NAME deceased the expression of eNOS phosphorylation(P<0.01).ConclusionAPN can promote the production of NO from PMVECs under hypoxic conditions at the cellular level by the activation of AMPK/PI3K/Akt/eNOS/NO signaling pathway.

adiponectin； pulmonary artery endothelial cell； signaling pathway； nitric oxide

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(81270330,30700345,31371151,31271219);陜西省科技廳國(guó)際合作課題資助項(xiàng)目(2013KW30-02);陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013Kkjxx-89)

徐海軍,男，1980-05生,碩士，E-mail:navy800628@163.com

2017-02-10

R544.1

A

1007-6611(2017)05-0415-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.003