劉文俠　鄭景嬌

摘 要：為測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇的殘留量，建立了高效液相色譜-固相萃取的測(cè)定方法。此方法檢出限低、回收率高、定性可靠、定量準(zhǔn)確，適合于水產(chǎn)品中喹乙醇?xì)埩舻臋z測(cè)。對(duì)采用固相萃取凈化、反相色譜柱分離、紫外檢測(cè)器檢測(cè)、外標(biāo)法定量檢測(cè)水產(chǎn)品樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)行業(yè)；液液萃??；殘留量；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2017.09.137

喹乙醇，又稱“喹酰胺醇”，是一種化學(xué)合成抗菌促生長(zhǎng)的飼料添加劑，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率和利用率，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物飼料添加劑中，它對(duì)魚(yú)類致病菌均有較好的抑制作用，可用于淡水養(yǎng)殖魚(yú)類敗血癥等病癥的防治。但是喹乙醇添加過(guò)量會(huì)引起中毒，且對(duì)大部分動(dòng)物有致畸作用，對(duì)人類也有潛在的“三致”作用。為保證食品安全及我國(guó)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，建立有效的水產(chǎn)品中喹乙醇的測(cè)量方法十分必要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：液相色譜儀（島津HPLC-20AD），配SPD-20AV紫外檢測(cè)器；HU3120B超聲波清洗器（天津恒奧）；VTX3000L漩渦混勻器（日本EYELA公司）；TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；固相萃取儀（上海安譜）。

實(shí)驗(yàn)試劑：喹乙醇（純度99.0%，Dr.Ehrenstorfer公司）。先用少量水溶解，再用色譜純甲醇溶解配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再根據(jù)需要用體積分?jǐn)?shù)為15%的甲醇溶液稀釋成合適的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光保存。

1.2 色譜條件

色譜柱為WondaSil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），色譜柱溫度為35 ℃。流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)為15%的甲醇溶液，流速1.0 mL/min。檢測(cè)器波長(zhǎng)380 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取

稱取混合均勻的勻漿試樣10 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液，超聲提取10 min，以5 000 r/min離心10 min；上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，向提取液中加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的NaCl溶液，用體積分?jǐn)?shù)為15%的甲醇溶液定容至25 mL（實(shí)驗(yàn)過(guò)程盡量避免光線直射）。

1.3.2 凈化濃縮

向定容后的提取液中加入10 mL正己烷，充分混勻后，以5 000 r/min離心10 min，棄取上層溶液，下層凈化溶液待用。

給每個(gè)樣品準(zhǔn)備一根HLB固相萃取小柱，預(yù)先用4 mL甲醇、4 mL水活化小柱，吸取10 mL凈化溶液加入活化后的固相萃取小柱，依次用4 mL0.02 mol/L的HCl溶液、0.1 mol/L的HCl溶液和水淋洗小柱，最后用3 mL體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液。用0.45 μm針頭濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，在色譜條件下分析測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取和凈化方式的選擇

分別按照實(shí)驗(yàn)方法和水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法SC/T 3019—2004規(guī)定的有機(jī)溶劑提取、液液萃取凈化后蒸發(fā)濃縮的方法對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化和濃縮。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)甲醇水溶液提取、正己烷除脂、固相萃取小柱凈化的樣品平均加標(biāo)回收率（90%）比有機(jī)溶劑提取、液液萃取凈化后蒸發(fā)濃縮的方法平均加標(biāo)回收率（70%）高，本實(shí)驗(yàn)方法的樣品重復(fù)性也明顯較好。

本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)于水產(chǎn)品樣品中大量的脂類干擾物的去除，仍采用傳統(tǒng)的正己烷萃取除脂法，為了減少萃取過(guò)程中乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生，在萃取前加入了NaCl溶液，利用NaCl的強(qiáng)電解質(zhì)性增加液體的表面張力，減少乳化現(xiàn)象。液液萃取凈化直接蒸發(fā)濃縮后的草魚(yú)加標(biāo)色譜圖和固相萃取小柱凈化富集的草魚(yú)加標(biāo)色譜圖的比較表明：固相萃取小柱凈化富集的樣品色譜圖干擾峰明顯少于液液萃取凈化直接蒸發(fā)濃縮后的色譜圖。本實(shí)驗(yàn)選擇了甲醇水溶液提取、固相萃取小柱凈化濃縮樣品。

2.2 SPE小柱條件的優(yōu)化

由于體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液在提取樣品過(guò)程中，會(huì)將水產(chǎn)品中的一些水溶性蛋白質(zhì)、維生素等物質(zhì)溶解，而這些物質(zhì)在反相柱上會(huì)有保留，根據(jù)HLB小柱推薦的方法和楊文軍、張麗英等人的研究結(jié)果，選用0.02 mol/L的HCl溶液和0.1 mol/L的HCl溶液依次淋洗固相萃取小柱，凈化樣品。為了避免HCl溶液對(duì)后續(xù)色譜分離過(guò)程產(chǎn)生影響，楊文軍、張麗英等人在HCl淋洗結(jié)束后加入了體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液緩沖淋洗，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)水產(chǎn)品樣品時(shí)，采用體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液緩沖淋洗和純水緩沖淋洗平均加標(biāo)回收率分別為60%和90%.因此本實(shí)驗(yàn)在洗脫前選擇純水緩沖淋洗。洗脫液選擇具有足夠洗脫能力的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的甲醇溶液洗脫，既將HLB小柱上吸附的喹乙醇全部洗脫，又避免了純甲醇溶液進(jìn)樣時(shí)對(duì)喹乙醇峰形展寬的影響。

2.3 色譜條件的選擇

參考水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法，選擇甲醇-水溶液（15∶85，V/V）作為流動(dòng)相，柱流速1.0 mL/min，等度洗脫，采用SymmetryshieldTMRP18色譜柱分離，標(biāo)準(zhǔn)品出峰峰型對(duì)稱，出峰時(shí)間較早。圖1為0.50 μg/mL喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，圖2為草魚(yú)加標(biāo)樣品和草魚(yú)空白樣品色譜圖。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法的檢出限、定量限

將100 mg/L的喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液利用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度分別為0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L、0.75 mg/L、1.00 mg/L的喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，在色譜條件下測(cè)定，以喹乙醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（ρ），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=5.08×104ρ-54，相關(guān)系數(shù)為r=0.999 9.

國(guó)家藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)方法要求檢出限對(duì)應(yīng)色譜圖S/N大于3；定量限對(duì)應(yīng)色譜圖S/N大于10，且平均加標(biāo)回收率不小于75%.根據(jù)高若梅、田強(qiáng)兵等人對(duì)分析方法的檢出限和測(cè)定下限的研究，將0.05 mg/kg的加標(biāo)樣品按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，結(jié)合平均加標(biāo)回收率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)方法的檢出限為0.02 mg/kg，方法定量限為0.05 mg/kg。

2.5 方法的精密度和回收率

分別稱取10.0 g草魚(yú)、對(duì)蝦和黃鱔陰性樣品各6份于離心管中，加入喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，制成3個(gè)添加水平的加標(biāo)樣品進(jìn)行方法的精密度和回收率測(cè)定，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表1.方法在3個(gè)不同添加水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.8%，7.7%和2.2%，3個(gè)不同添加水平的平均回收率分別為83.2%，93.1%和94.4%.方法的加標(biāo)回收率符合藥物殘留檢測(cè)要求，精密度和回收率能滿足水產(chǎn)品中喹乙醇的測(cè)定，采用本方法對(duì)50份樣品進(jìn)行了測(cè)定，均未檢出喹乙醇。

3 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用部分提取液凈化后直接進(jìn)樣分析的方法，不僅操作簡(jiǎn)單，提高了檢測(cè)效率，還避免了大量使用有機(jī)試劑，減少了對(duì)環(huán)境的污染。而且此方法檢出限低、重現(xiàn)性好、回收率高、定性可靠、定量準(zhǔn)確，可為水產(chǎn)品中喹乙醇藥物殘留量在水產(chǎn)品中的測(cè)定提供準(zhǔn)確的測(cè)量手段，為食品的安全提供了有力保障。

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〔編輯：劉曉芳〕