覃小礦，馬曙軒，侯云生，王孟鍵

（1.柳州市婦幼保健院輸血科，廣西柳州545001；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院輸血科，北京100045；3.柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西柳州545001)

·短篇報道·

X-連鎖無丙種球蛋白血癥患兒ABO血型一例

覃小礦1，馬曙軒2，侯云生3，王孟鍵2

（1.柳州市婦幼保健院輸血科，廣西柳州545001；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院輸血科，北京100045；3.柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西柳州545001)

基因檢測；X-連鎖無丙種球蛋白血癥；ABO血型

在兒科患者血型鑒定中經(jīng)常會遇到正反定型不符的情況，臨床上會考慮是否為抗原減弱或抗體減弱并針對性的增加試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。但如果先從患兒的病歷資料入手，大致分析其正反不符的原因可減少試驗(yàn)的盲目性，最后加以血型基因型檢測進(jìn)行確證得出正確結(jié)果。本文就最近工作中遇到的一例由X-連鎖無丙種球蛋白血癥導(dǎo)致的ABO正反定型不符進(jìn)行分析檢測，通過血型基因檢測確認(rèn)患兒血型，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料患兒，田某某，男，14歲4個月17 d，以“咳嗽5 d，咯血3 d”入院。查體：體溫(T) 37.5℃，心率(P)90次/min，呼吸(R)22次/min，血壓(BP) 120/70 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，雙肺呼吸音粗，未聞及干濕啰音。左腕關(guān)節(jié)稍腫脹，無活動受限，伸側(cè)皮膚可見一直徑約2 cm大小紅色陳舊性瘢痕，無滲出。初步診斷：咯血原因待查；X-連鎖無丙種球蛋白血癥；肺炎；左側(cè)橈骨慢性骨髓炎；鼻竇炎。入院后申請備O型RHD(+)紅細(xì)胞2 U，輸血前檢測中發(fā)現(xiàn)患兒ABO血型正反定型不一致。

1.2 血型鑒定方法

1.2.1 卡式及試管法復(fù)核嚴(yán)格按照卡式法及試管法操作流程進(jìn)行復(fù)核血型，試劑卡選用美國奧森多公司血型鑒定試劑卡(批號：ABR132A)，3%～5%標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞(A1細(xì)胞和B細(xì)胞)選用江陰力博公司生產(chǎn)(批號：20160428)，采用強(qiáng)生全自動血型分析儀(ORTHOAUTOVUE Innova)進(jìn)行復(fù)核。

1.2.2 吸收放散試驗(yàn)取1 mL受檢者紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，加20滴相對應(yīng)的經(jīng)標(biāo)化的抗血清(抗-A和抗-B，效價為64)，37℃孵育10 min后放置4℃冰箱吸收2 h，離心取上清液檢測吸收前后抗體效價的變化，再用冷鹽水洗滌數(shù)次，當(dāng)末次上清液相應(yīng)抗血清效價為0時，提示洗滌充分。取洗凈的紅細(xì)胞加半量0.9%生理鹽水，于56℃水浴中放散，振蕩數(shù)次，10 min后取出，3 500 r/min離心5 min，取上清液為放散液，加相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液1滴，觀察結(jié)果。

1.2.3 血型基因檢測采用TIATamp Blood DNA Kit(天根公司)提取標(biāo)本基因組DNA，并檢測DNA濃度，最佳濃度為30～50 ng/μL，按照人類ABO血型基因分型PCR-SSP檢測試劑盒(天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)操作說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每孔加入患兒DNA提取液(10 μL)及dNTP-Buffer稀釋液(110 μL)的混合液各10 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像后分析其SSP基因結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 患兒血型正反定型結(jié)果血清學(xué)方法判定患兒正定型為O型，反定型為AB型，正反定型不符，排除了人為技術(shù)試劑等原因后，重新采集患兒的標(biāo)本進(jìn)行試管法檢測，與之前的結(jié)果一致，見表1。

表1 患兒血型正反定型結(jié)果

2.2 患兒血清吸收放散結(jié)果吸收前后標(biāo)化的抗-A和抗-B的效價不變，均為64；放散后的放散液與A1、B、O細(xì)胞均不反應(yīng)，提示顯示患兒紅細(xì)胞上無A、B抗原，血漿中亦無抗-A、抗-B抗體。

2.3 患兒血型基因結(jié)果通過對患兒的DNA進(jìn)行PCR-SSP分析后，得到相應(yīng)的孔位及目的條帶，顯示5、7、10孔位為陰性，故患兒血型基因型檢測為O1O2，表型為O型，見圖1。

圖1 患兒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

通常情況下，影響血型正反定型不符的原因有很多，根據(jù)蘭炯采等[1]推薦，主要分為幾個大類：(1)紅細(xì)胞抗原減弱或消失；如ABO亞型，白血病導(dǎo)致抗原減弱等；(2)紅細(xì)胞額外反應(yīng)，如自身凝集素，類B等；(3)混合凝集，如近期輸異型血導(dǎo)致；(4)血清定型減弱或無反應(yīng)，如新生兒或者老年人，低丙種球蛋白等；(5)血清額外反應(yīng)如冷自身抗體或同種抗體等。大部分的ABO正反定型不符都可以通過分析以上的原因，查閱相關(guān)資料，結(jié)合病史分析，設(shè)計(jì)針對性的試驗(yàn)如洗滌紅細(xì)胞、增加反應(yīng)時間和血清量、酶處理紅細(xì)胞、吸收放散試驗(yàn)、唾液型物質(zhì)測定等方法通常能獲得滿意的結(jié)果，但如果筆者先從患兒病歷診斷分析入手，可增加試驗(yàn)的針對性，減少試驗(yàn)的盲目性。

患兒為14歲青春期男孩，近一年來經(jīng)常因“肺炎”靜點(diǎn)抗生素處理，病情反復(fù)；20+d前患“中耳炎”未愈，且患兒自幼時開始表現(xiàn)出抵抗力弱，半年前患兒連續(xù)感染“麻疹”、“水痘”，4歲時曾患有“支原體肺炎”，治療約1個月余，治愈；2011年左手腕骨髓炎史、開窗引流手術(shù)史，否認(rèn)特殊家族遺傳病史。實(shí)驗(yàn)室檢查CD系列提示B淋巴細(xì)胞亞群明顯降低，Ig系列提示IgA、IgG、IgM明顯降低，經(jīng)基因檢測確診為X-連鎖無丙種球蛋白血癥(X-linked agammaglobulin，XLA)，因此懷疑患兒由于體內(nèi)缺乏免疫球蛋白而致反定型無凝集出現(xiàn)。

XLA是由于人類酪氨酸激酶(BTK)基因突變導(dǎo)致前B細(xì)胞進(jìn)一步成熟為B細(xì)胞障礙引起的原發(fā)性免疫缺陷病，為X-連鎖隱形遺傳病。大多患病者都有BTK基因的突變[2]，由于B細(xì)胞發(fā)育受阻，導(dǎo)致體內(nèi)缺乏B細(xì)胞和免疫球蛋白，故體內(nèi)檢測不到相應(yīng)的血型抗體。本病的發(fā)病率(0.5～1.0)/10萬[3]，發(fā)病者均為男性，其中約20%的XLA患者可能并發(fā)關(guān)節(jié)炎，亦可能合并幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎[4-5]。臨床癥狀通常發(fā)生在6個月以后，一旦母源性抗體從嬰兒的血液中消失，易發(fā)生反復(fù)的呼吸道和胃腸道感染[6]。XLA的診斷多依賴臨床和血丙種球蛋白檢測，血IgA、IgG、IgM均明顯降低，CD淋巴細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞缺如，T淋巴細(xì)胞增加，CD4/CD8倒置，靜脈注射免疫球蛋白替代療法是治療該疾病的標(biāo)準(zhǔn)療法。

該患兒已經(jīng)14歲，正定型為O型，反定型尚未出現(xiàn)任何抗體，吸收放散試驗(yàn)提示患兒紅細(xì)胞上無A、B抗原，血清中無抗-A、抗-B抗體。為了弄清患兒的真實(shí)血型，我們采用了基因檢測的方法進(jìn)行確證，結(jié)果證實(shí)患兒確實(shí)為O型，但由于其B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟受阻，導(dǎo)致其血清中無相應(yīng)的血型抗體出現(xiàn)。近來來，血型基因型檢測技術(shù)的快速發(fā)展，解決了我們血型鑒定工作中的很多問題[7-8]。目前針對ABO血型系統(tǒng)基因型檢測方法主要有PCR-DNA測序法、PCR-限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)和PCR-SSCP等[9]，血型基因分型克服了血型血清學(xué)方法的種種限制[10]。因此，在血清學(xué)方法不能確定患兒ABO血型的情況下，可以采用基因?qū)W方法確認(rèn)。臨床診斷常常是我們處理血型正反不符的重要參考資料，結(jié)合臨床病例資料可以合理的分析解釋試驗(yàn)結(jié)果，避免試驗(yàn)的盲目性，增加試驗(yàn)的針對性，有效提高我們處理疑難血型的能力。本例患兒最后通過基因型確定其為O型RHD(+)，配給O型陽性紅細(xì)胞2U主次側(cè)均無凝集和溶血，配血相合，輸注后無輸血反應(yīng)。

[1]蘭炯采,陳靜嫻,馬紅麗,等.推薦ABO疑難血型三步分析法[J].中國輸血雜志,2010,23(3):165-168.

[2]王曉川,王瑩,金兼弘和,等.X連鎖無丙種球蛋白血癥的基因診斷[J].中華兒科雜志,2005,43(6):449-452.

[3]Nasseri S,Sorouri R,Pourpak Z,et al.Molecular characterization of Bruon's tyrosine kinase deficiency in 12 Iranian patients with presumed X-linked agammaglobulinemia[J].Investig Allergol Clin Immunol,2011,21(7):572-574.

[4]Sukumaran S,Marzan K,Shaham B,et al.A child with X-linked agammaglobuinemia and enthesitis-related arthritis[J].Int J Rheumatol,2011,2011:175973.

[5]Toth B,Volokha A,Mihas A,et al.Genetic and demographic features of X-agammaglobulinemia in Eastern and Central Europe:a cohort study[J].Mol Immunol,2009,46(10):2140-2146.

[6]李小琳,付四毛.X-連鎖無丙種球蛋白血癥3例報告并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J].臨床兒科雜志,2014,32(7):690-693.

[7]莊光艷,閆芳,侯玉濤,等.血液病致ABO抗原減弱的血型基因定型研究[J].北京醫(yī)學(xué),2014,6:478-480.

[8]肖建宇,曾榮,史廣耀,等.多重PCR-SSP方法在RHD基因檢測中的應(yīng)用[J].中國輸血雜志,2013,26(12):1202-1204.

[9]朱發(fā)明,傅啟華,金蕾,等.PCR-SSP法檢測A～(1,2)BO～(1,2)血型基因型[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2000,18(5):267-269.

[10]朱祥明,楊通漢,姚富柱,等.基因分型技術(shù)應(yīng)用于疑難ABO血型的分型[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2015,17(6):554-557.

R725.5

D

1003—6350（2017）10—1705—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.10.054

2016-11-28)

馬曙軒。E-mail：masxfwyy@sina.com