陳景容福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014

不同豬瘟病毒株在ST細(xì)胞上的增殖研究

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在做熒光抗體檢測(cè)病毒中和試驗(yàn)時(shí)，用不同毒株檢測(cè)同一份血清樣品經(jīng)常出現(xiàn)不一樣的效果。通過(guò)開(kāi)展豬瘟病毒（兔化弱毒株）和豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）在ST細(xì)胞上的增殖研究，掌握豬瘟活疫苗收獲抗原的最佳時(shí)間，選擇更好的毒株進(jìn)行熒光抗體檢測(cè)病毒中和試驗(yàn)。結(jié)果表明：豬瘟病毒（兔化弱毒株）增值效果差，豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）繁殖速度很快，在接種后30 h就能達(dá)到105.4TCID50/mL，55 h達(dá)到最高峰106.0TCID50/mL，72 h后呈平穩(wěn)狀態(tài)。

ST細(xì)胞豬瘟病毒（兔化弱毒株）豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）

豬瘟是豬的最主要傳染病之一，被國(guó)際獸醫(yī)局（OIE）列為A類(lèi)傳染病。它是豬的一種急性、高度接觸性、熱性傳染病。豬瘟病毒粒子直徑為34～50 nm，有20面體對(duì)稱(chēng)的核衣殼，內(nèi)部核心直徑約30 nm，病毒粒子略呈圓形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纖突結(jié)構(gòu)。豬瘟病毒可引起豬體器官?gòu)浡猿鲅?，呈現(xiàn)出血斑點(diǎn)，其原因主要是使器官的小血管壁變性，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生變形、壞死所致[1]。實(shí)驗(yàn)條件下的豬瘟病毒很穩(wěn)定，但溫度對(duì)培養(yǎng)上清液中的病毒活性有很大的影響，病毒粒子在50℃可以存活3 d，在37℃可存活7 d，在-70℃可存活多年。豬瘟病毒的自然宿主主要是豬和野豬，不能凝集雞、豚鼠、豬、牛和人的紅細(xì)胞。豬瘟病毒可在豬的骨髓、睪丸、肺和腎的細(xì)胞培養(yǎng)物及白細(xì)胞中增殖，最常用的是豬腎細(xì)胞，如PK-15、SK6細(xì)胞等細(xì)胞系，其中最易感的是PK-15、PK-1a和ST等幾株豬腎和豬睪丸細(xì)胞系[2]。

1 材料和方法

1.1 材料ST細(xì)胞、豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）、豬瘟病毒（兔化弱毒株）

1.2 方法

1.2.1 兔化弱毒株豬瘟病毒液的培養(yǎng)、制備將豬瘟病毒（兔化弱毒株）按培養(yǎng)液總量1%接種至ST細(xì)胞單層，搖勻，放置37℃、CO2培養(yǎng)箱孵育1 h后，加入含3%~5%無(wú)BVDV抗體、無(wú)豬瘟抗體的胎牛血清MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)置37℃、CO2培養(yǎng)箱中，分別在培養(yǎng)30、50、55、60、72、96 h各取1 mL病毒液，-15℃以下凍存待檢。

1.2.2 法國(guó)Thiveral株豬瘟病毒液的培養(yǎng)、制備將豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）按培養(yǎng)液總量1%接種至ST細(xì)胞單層，搖勻，放置37℃、CO2培養(yǎng)箱孵育1 h后，加入含3%~5%無(wú)BVDV抗體、無(wú)豬瘟抗體的胎牛血清MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)置37℃、CO2培養(yǎng)箱中，分別在培養(yǎng)30、50、55、60、72、96 h各取1 mL病毒液，-15℃以下凍存待檢。

1.2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)前處理將豬瘟病毒（兔化弱毒株、法國(guó)Thiveral株）待檢品做10倍系列稀釋后，取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度接種ST細(xì)胞單層（96孔細(xì)胞培養(yǎng)板），每孔接種100 μL，每個(gè)稀釋度接種6孔。并設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照用已經(jīng)確認(rèn)過(guò)的豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）的病毒液做6孔對(duì)照，陰性用MEM培養(yǎng)液作對(duì)照。放置37℃、CO2培養(yǎng)箱孵育1 h后，再加入含3%~5%無(wú)BVDV抗體、無(wú)豬瘟抗體的胎牛血清MEM培養(yǎng)液，每孔100 μL。96 h后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。

1.2.4 豬瘟病毒間接免疫熒光試驗(yàn)步驟（1）取待檢細(xì)胞單層，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1~2次，每次洗滌時(shí)，每孔加入PBS 200 μL，室溫孵育3~5 min，棄去PBS。（2）每孔加入80%冷丙酮溶液100 μL，2~ 8℃固定30 min，然后棄去丙酮，自然晾干。（3）用PBS洗滌細(xì)胞面1次，然后每孔加入用PBS適當(dāng)稀釋的豬瘟病毒特異性抗體（一抗）50 μL，37℃濕盒作用1 h。（4）重復(fù)步驟（1）。（5）棄去洗液，加入用PBS適當(dāng)稀釋、FTC標(biāo)記的兔抗豬IgG，50 μL/孔，37℃濕盒作用1 h。（6）重復(fù)步驟（1）。（7）在倒置顯微鏡下用藍(lán)色激發(fā)光（波長(zhǎng)490 nm）放大100~ 200倍觀(guān)察。（8）當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔出現(xiàn)典型的特異性胞漿內(nèi)黃綠色熒光，陰性對(duì)照孔未出現(xiàn)特異性黃綠色熒光時(shí)，試驗(yàn)成立；否則，判定試驗(yàn)無(wú)結(jié)果。待檢細(xì)胞孔出現(xiàn)特異性胞漿內(nèi)黃綠色熒光，判為陽(yáng)性；否則判為陰性。

2 試驗(yàn)結(jié)果

豬瘟病毒（兔化弱毒株、法國(guó)Thiveral株）在ST細(xì)胞增殖情況見(jiàn)表1、圖1。從增殖曲線(xiàn)看，豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）增殖速度還是很快的，在接種后30 h就能達(dá)到105.4TCID50/mL，55 h達(dá)到最高峰106.0TCID50/mL，72 h后呈平穩(wěn)狀態(tài)。

圖1 豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）在ST細(xì)胞增殖曲線(xiàn)圖

3 討論

表1 豬瘟病毒（兔化弱毒株、法國(guó)Thiveral株）在ST細(xì)胞增殖效果

豬瘟病毒復(fù)制部位僅限于細(xì)胞漿，而且不產(chǎn)生細(xì)胞病變。細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒的傳播方式呈三種：一是從感染細(xì)胞內(nèi)釋放的病毒粒子經(jīng)培養(yǎng)液感染新的易感細(xì)胞；二是被感染細(xì)胞通過(guò)有絲分裂直接傳給

3.1 豬瘟病毒（兔化弱毒株）在ST細(xì)胞增殖效果試驗(yàn)結(jié)果顯示，效價(jià)小于103.0TCID50/0.1 mL?？赡軐?dǎo)致該結(jié)果的原因主要有以下幾點(diǎn)：（1）豬瘟的血清型一般說(shuō)的單一血清型，但是1976年以來(lái)，美國(guó)、法國(guó)、日本的一些學(xué)者根據(jù)中和試驗(yàn)和單克隆抗體反應(yīng)，證明豬瘟病毒具有血清學(xué)變種。豬瘟病毒的抗原性呈多樣而復(fù)雜，用多克隆抗體做交叉中和反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒株之間抗原性差異很大，除了雙向交叉反應(yīng)外，也有單向交叉反應(yīng)的[4]。因此，豬瘟病毒兔化弱毒株與該試劑盒中豬瘟病毒特異性抗體存在較大差異，兩者之間不容易結(jié)合，導(dǎo)致熒光無(wú)法顯示。（2）該病毒在傳代過(guò)程中丟失。（3）該病毒在該株細(xì)胞上繁殖力差，在10-3倍稀釋后未能達(dá)到最低感染量。而抗原含量小于103.0TCID50/0.1 mL對(duì)做熒光抗體檢測(cè)病毒中和試驗(yàn)是不理想的，因?yàn)榭乖康?，在接種200TCID50抗原，需要用到大量的抗原。因此，該試驗(yàn)未繼續(xù)深入進(jìn)行。

3.2 豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）在ST細(xì)胞增殖效果豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）是于1972年由豬瘟強(qiáng)毒Aifort株經(jīng)仔豬原代細(xì)胞中傳代后轉(zhuǎn)到牛肌肉細(xì)胞中增殖，29~30℃?zhèn)鞔?70代得到的溫度變異毒株，是法國(guó)曾經(jīng)廣泛應(yīng)用的疫苗株。因其免疫熒光效果明顯優(yōu)于豬瘟病毒（兔化弱毒株），經(jīng)常被實(shí)驗(yàn)室用于免疫熒光試驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照。

從增殖曲線(xiàn)圖可以看出，豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）主要存在于細(xì)胞的胞漿中。實(shí)驗(yàn)室條件下豬瘟病毒很穩(wěn)定，但溫度對(duì)培養(yǎng)上清液中的病毒活性有很大的影響，病毒粒子在50℃可以存活3 d，在37℃可存活7 d，在-70℃可存活多年[5]。本試驗(yàn)通過(guò)在37℃條件下吸附1 h后直接加營(yíng)養(yǎng)液，最大程度保護(hù)病毒能順利在細(xì)胞中增殖。因此，測(cè)毒結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間段釋放到上清液中的病毒來(lái)分析豬瘟病毒（法國(guó)Thiveral株）的生長(zhǎng)特性。從增殖曲線(xiàn)圖看，55 h達(dá)到最高峰，72 h后呈平穩(wěn)狀態(tài)，說(shuō)明抗原收獲最佳時(shí)間應(yīng)在55~60 h。本試驗(yàn)主要是通過(guò)釋放到上清液的病毒來(lái)測(cè)定病毒含量，而不是測(cè)定與細(xì)胞結(jié)合的病毒；前期滴度較低是因?yàn)樯锨逡翰《竞枯^少，但是隨著被感染的細(xì)胞增多，裝配和釋放到上清液中的病毒逐漸增多，而后達(dá)到一個(gè)高峰期，再慢慢下降。與細(xì)胞結(jié)合的病毒都呈上升趨勢(shì)生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的增加，被感染的細(xì)胞數(shù)量也增加，到72 h、96 h大部分細(xì)胞都被感染，病毒開(kāi)始穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。該試驗(yàn)還需要不斷深入、細(xì)化和重復(fù)，以達(dá)到最佳效果。

[1]冶貴生.SVEC中CSFV差異基因的鑒定、cDNA序列的延伸及shRNA抑制CSFV在PK-15細(xì)胞中增殖的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.

[2]Moenning V.The hog cholera virus[J].Comp Immun Microbiol Infect Disease,1992,15(3):189-201.

[3]Moormann R J M,van Gennip H G P,Miedema G K W,et al.Infectious RNA transcribed from an engineered full-leng cDNA template of the genome of a pestivirus[J].J Virol, 1996,70(2):763-770.

[4]何穎.廣西豬瘟流行毒株生長(zhǎng)特性的初步研究[D].南寧:廣西大學(xué),2004.

[5]Harkness J W.Classical swine fever and its diagnosis:A current view[J].Vet Rec,1985,16:288-293.

The study on the growth between two Hog Cholera Virus strains which germinated on the swine testicle cells

Chen Jingrong
（Fuzhou Dabeinong Biotechnology Co.Ltd.,Fuzhou 350014）

Fluorescent antibody virus neutralization(FAVN)test is accepted as Hog Cholera Virusantibody detection method in the international trade.But sometimes,different samples show diverse results in the FAVN test.In order to master the appropriate harvest time in hog cholera virus vaccine production and choose the optimal strain to do the FAVN test,the growth on the swine testicle cells（ST cells）between Lapinized Hog Cholera Virus and Hog Cholera Virus Thiveral strain were studied in this paper.The results showed that the proliferation of Lapinized Hog Cholera Virus was bad and the proliferation of Thiveral strain was rapid,the titer of virus can reach 105.4TCID50/mL 30 hours after inoculation,106.0TCID50/mL after 55 hours,at steady state was after 72 hours.

ST cells Lapinized Hog Cholera Virus Hog Cholera Virus Thiveral strain

A

1003-4331（2017）03-0009-03