廖 媛，簡 燚，羅克樞

(1.成都市第六人民醫(yī)院病理科，四川 成都 660003；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院病理科，四川 成都 610083)

增殖細胞核抗原67與胸腺激酶1在宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中的表達

廖 媛1，簡 燚2，羅克樞2

(1.成都市第六人民醫(yī)院病理科，四川 成都 660003；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院病理科，四川 成都 610083)

目的 探討增殖細胞核抗原67(proliferating cell nuclear antigen 67，Ki-67)和胸腺激酶1 (thymidine kinase 1，TK1)在宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌中的表達及其相關性。方法 應用免疫組化方法檢測Ki-67、TK1在40例宮頸癌、40例宮頸上皮內瘤變和20例正常宮頸上皮中的表達。結果 宮頸癌組織中Ki-67、TK1陽性細胞數(shù)高于宮頸上皮內瘤變和正常宮頸上皮組織，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；高級別上皮內瘤變(CINⅡ-Ⅲ)Ki-67、TK1高于低級別上皮內瘤變(CINⅠ)，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)；相關分析表明，在宮頸上皮內瘤變和宮頸癌中Ki-67和TK1的表達有一定相關性；TK1和Ki-67在宮頸癌復發(fā)或轉移組高于無復發(fā)或轉移組。結論 Ki-67與TK1對于宮頸上皮內瘤變的分級預后有很好的指導作用。TK1 對判斷宮頸上皮內瘤變的病變程度及宮頸癌是否有復發(fā)傾向具有參考價值，且優(yōu)于 Ki-67。

宮頸上皮內瘤變；宮頸癌；增殖細胞核抗原67；胸腺激酶1

隨著人們生活方式的改變，宮頸癌變的發(fā)病率逐漸升高，宮頸癌已經成為當前婦女主要的惡性腫瘤疾病。對宮頸癌進行早期診斷和治療，可以有效提高患者的治療效果，實現(xiàn)對患者病情的控制。Ki-67和TK1作為腫瘤增殖指數(shù)可以指導宮頸癌患者分級和預后，提高對患者CIN的分級和鑒別診斷效果。本文就Ki-67、TK1在正常宮頸上皮、CIN及宮頸癌中的應用進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取成都軍區(qū)總醫(yī)院2012年1月至2015年12月的正常宮頸上皮、CIN及宮頸癌患者標本80例，患者年齡 23～69 歲，平均 39.8歲。對患者進行標本檢測和分析，由兩名有經驗的病理醫(yī)師進行診斷分類:慢性宮頸炎20例；低度鱗狀上皮內病變(LSIL)20例；高度鱗狀上皮內病變(HSIL)20例；其中CINⅡ10例，CINⅢ10例；宮頸癌40例。在收集標本時均對宮頸癌患者進行隨訪，除外2015年宮頸癌患者標本10例，對有無復發(fā)轉移進行分類。

1.2 方法 所有標本均經過10%甲醛溶液處理，石蠟包埋，進行連續(xù)切片，厚度保持在4 μm。每個標本分別制作Ki-67、TK1標記和陰性對照，采用SP法，DAB染色。單克隆抗體Ki-67和TK1分別購置于北京中杉和華瑞同康公司。結果判讀標準:Ki-67陽性表達顯示為棕黃色顆粒，定位于細胞核；TK1陽性表達主要定位于細胞漿。比較每個標本的陽性細胞數(shù):在顯示著色區(qū)域選取5個高倍鏡視野，對每個視野選取100個上皮腫瘤細胞進行計數(shù)，取平均值進行比較。無陽性細胞即陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 16.0 進行統(tǒng)計學處理。取各個標本的陽性細胞數(shù)計算平均值；各組間計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗，相關分析采用Speraman檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ki-67在不同組織中的表達 Ki-67在正常宮頸上皮的基底細胞核中也有表達，CIN的異型細胞核和大多數(shù)的宮頸癌細胞核，均呈中-強的棕黃色染色，見圖1。宮頸癌組織中Ki-67陽性細胞數(shù)高于宮頸上皮內瘤變和正常宮頸上皮組織，差異有統(tǒng)計學意義(均P< 0.05)，見表1。

圖1 不同組織中Ki-67的表達(PV9000×400)a:正常宮頸上皮組織；b:CINⅠ組織；c:CIN組織；d:宮頸癌組織

組別例數(shù)Ki-67TK1正常宮頸上皮2015.6±6.78.6±3.2CINⅠ(LSIL)2014.0±6.1#12.5±4.6#CINⅡ-Ⅲ(HSIL)2049.4±14.3#*41.4±12.7#*宮頸癌4047.2±26.2#73.9±19.6#

#與正常宮頸上皮相比，P< 0.05；*與CINⅠ相比，P< 0.05

2.2 TK1在不同組織中的表達 TK1主要表達于CIN基底細胞層和近基底細胞的胞漿，呈強或中等程度棕黃色著色，在宮頸癌中大多數(shù)腫瘤細胞呈強或中等強度的表達。在宮頸正常鱗狀上皮，表現(xiàn)為胞漿著色明顯減弱或無胞漿著色，見圖2。宮頸癌組織中TK1陽性細胞數(shù)高于宮頸上皮內瘤變和正常宮頸上皮組織，差異有統(tǒng)計學意義(均P< 0.05)，見表2。

2.3 Ki-67、TK1與宮頸病變相關性分析 經Spearman秩相關分析，Ki-67與TK1在宮頸上皮內瘤變與宮頸癌表達情況中呈正相關(r=0.768，P< 0.05)；Ki-67與宮頸上皮內瘤變、宮頸癌表達呈正相關(r=0.748，P= 0.000)；TK1與宮頸上皮內瘤變、宮頸癌表達呈正相關(r=0.882，P= 0.000)。

2.4 TK1和Ki-67 表達與宮頸癌復發(fā)轉移的關系

將出現(xiàn)復發(fā)或轉移的宮頸癌患者12例與無復發(fā)轉移的宮頸癌患者18例患者分組比較，結果顯示:復發(fā)或轉移組TK1、Ki-67表達的陽性細胞數(shù)均明顯高于無復發(fā)或轉移組，差異均有統(tǒng)計學意義(卡方值<0.05、P< 0.05)。

圖2 不同組織中TK1的表達(PV9000×400) a:正常宮頸上皮組織；b:CINⅠ組織；c:CINⅢ組織；d:宮頸癌組織

組別nTK1Ki-67復發(fā)或轉移組1268.5±15.0#55.7±17.8#*無復發(fā)或轉移組1843.6±12.339.6±12.5

#與無復發(fā)或轉移組比較，P< 0.05； *與TK1比較，P< 0.05

3 討論

宮頸癌的形成、浸潤和轉移是非常復雜的病變過程，與多個基因和抑癌基因的表達、調控以及細胞凋亡有關。宮頸上皮不典型增生-原位癌，這系列癌前病變的連續(xù)過程統(tǒng)稱為宮頸上皮內瘤變CIN 。根據不典型增生的程度和范圍，CINⅠ級相當于低級別鱗狀上皮內瘤變，CINⅡ和Ⅲ相當于高級別鱗狀上皮內瘤變。各級CIN可有發(fā)展成浸潤性癌的趨向，級別越高發(fā)展為浸潤癌的機會越多。除了在光鏡下觀察細胞的形態(tài)學變化，還需要尋找有助于區(qū)別宮頸鱗狀上皮良性反應性增生和CIN病變的檢測，尤其是CIN病變的免疫組化標記物，以減少不必要的誤診和漏診。

Ki-67抗原為細胞核內分裂增殖相關蛋白，主要定位于細胞核，與細胞周期密切相連。與其他反應細胞增殖的指標如細胞增殖核抗原(PCNA)[1]、DNA聚合酶相比，Ki-67半衰期短，細胞脫離增殖周期后迅速降解，能較好地反應細胞的增殖潛能。有研究結果提示，通過Ki-67免疫組化染色檢測到的腫瘤增殖指數(shù)與腫瘤惡性程度、組織學特征和生物學行為緊密相關[2]。本研究中，Ki-67在正常宮頸上皮少部分呈陽性表達，局限于基底細胞層。隨著CIN病變的加重，表達范圍由基底層逐漸向表層擴展，與異型細胞的發(fā)展相一致。在宮頸癌中大多數(shù)的癌細胞均呈陽性表達。這一結果表明在宮頸細胞的癌變過程中，隨著級別的增高，腫瘤細胞的增殖活性逐漸增強，最終得以無限增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，說明Ki-67與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[3，4]。Ki-67作為細胞增殖標記物，除在正常宮頸鱗狀上皮基底層表達外，良性反應性增生與CINⅠ也可表達，故在鑒別診斷增生性病變時，Ki-67最好與其他抗體聯(lián)合。

TK的2種同工酶 TK1、TK2分別定位于細胞質和細胞核。TK1是合成DNA的關鍵酶之一，增殖周期中的TK1均有不同程度的表達。大量試驗研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血液中TK1均不同程度地超過正常水平[5]。Morimot等對肝臟部分切除后大鼠血清TK1進行檢測，發(fā)現(xiàn)在大鼠手術恢復期，其肝臟TK1活性明顯增高，從而證實其在細胞增殖過程中的作用。這使TK1成為腫瘤生長及細胞增殖的標記。而細胞增殖是影響腫瘤預后的關鍵因素之一，因此可推測TK1可能與腫瘤的預后有關[6]。目前文獻中有關TK1與腫瘤預后關系的研究中，多以血清TK1濃度及血清TK1活性作為觀測指標[7]，這2項指標雖然檢測較簡便，但因其可能受到血清蛋白及細胞分解等因素的影響，有一定的局限性，故有學者提出以免疫組化的方法檢測TK1在腫瘤組織的表達情況。目前這種研究方法已被應用于乳腺癌[8]、膀胱癌[9]及肺癌[10]的研究。宮頸癌的發(fā)生就是正常宮頸上皮在各種損傷因子及HPV的作用下，導致黏膜活性大大增強。因此，通過檢測血清及免疫組化方法檢測TK1和正常宮頸上皮細胞的細胞質內 TK1含量和表達強度，就有可能為判斷宮頸癌上皮細胞從良性到惡性變化，從量變到質變的過程和狀態(tài)提供了依據。

本文結果顯示，宮頸癌組織中TK1的陽性表達率明顯高于宮頸上皮內瘤變及正常宮頸上皮組織，提示過表達的TK1可能與宮頸上皮過度增殖和惡性轉化有關；對 TK1的表達情況與宮頸上皮內瘤變的各級分期進行分析，發(fā)現(xiàn)TK1表達與宮頸上皮內瘤變的低級別和高級別表達正逐漸增生，差異有統(tǒng)計學意義，過量表達與宮頸癌發(fā)生有關，對于判斷其進展及預后意義有一定作用[11]。研究表明[12]TK1在中晚期宮頸癌患者放化療前后有降低，說明同步放化療可以降低癌的增殖指數(shù)和增殖活性，TK1能夠正確評估中晚期宮頸癌的治療療效。

有研究發(fā)現(xiàn)，維吾爾族婦女宮頸鱗癌中TK1基因及其相應蛋白的陽性表達明顯高于對照組宮頸組織中的陽性表達，表明此基因與維吾爾族婦女宮頸癌的發(fā)生密切相關。研究證實，淋巴結轉移和腫瘤體積是判定宮頸癌預后的重要因素。研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌腫瘤體積和淋巴結轉移情況與TK1表達呈正相關，表明TK1與宮頸癌發(fā)生發(fā)展及轉移發(fā)生機制密切相關[13]，對判定宮頸癌預后有實際意義。與我們的研究相似，TK1與Ki-67在復發(fā)或轉移組表達率明顯高于無復發(fā)轉移組(P< 0.05)，TK1增殖活性高的復發(fā)轉移率明顯高于Ki-67表達高的宮頸癌患者。本研究還發(fā)現(xiàn)除核周胞漿表達TK1外，部分陽性細胞還可出現(xiàn)核的表達，核陽性的意義及是否與宮頸癌預后有關，還有待擴大樣本進一步研究。

TK1作為研究細胞增殖程度的新的標志物，其與Ki-67的細胞增殖周期特征不同，主要在S期表達并定位于細胞質，而 Ki-67表達于除G0期外的各期[14]。Ki-67在某些良惡性疾病間的表達有一些交叉，例如淋巴結中正常濾泡中心細胞Ki-67呈強陽性高表達，在炎細胞中Ki-67也要表達，有些良性病變的Ki-67指數(shù)甚至高于某些惡性病變，葉芳萍等研究發(fā)現(xiàn)，良性前列腺增生及正常前列腺組織中幾乎檢測不到TK1和Ki-67，而前列腺上皮內瘤增殖細胞TK1和Ki-67的檢出率為16% ～17%，前列腺癌組織中TK1檢出率高于Ki-67的檢出率。我們的研究也表明TK1[15]比Ki-67更靈敏，能為治療和預后提供有價值的信息。

因此單獨依靠Ki-67來鑒別這些疾病時要慎重。通過本研究及之前相關研究顯示，聯(lián)合檢測TK1和Ki-67更有利于觀測腫瘤的增殖程度、生物學性質以及輔助病理學診斷。另外在方法學檢測的優(yōu)勢上，TK1表現(xiàn)出細胞質定位特征的免疫組化原位檢測要比其他檢測方法更精確[16]。

TK1與Ki-67均與細胞增殖相關，因此兩者存在相關性，在本研究中也得到進一步驗證，但是兩者又不完全一致，在本實驗中部分病例表達TK1，而沒有表達Ki-67；而部分病例僅表達Ki-67而沒有表達TK1。這可能由于TK1主要表達于S期細胞漿，而Ki-67表達于G1、S、G2、M期細胞核，Ki-67表達更廣，而TK1靈敏度更高。所以兩者聯(lián)合標記更能真實反映宮頸癌中增生細胞的表達[17]，為腫瘤的分級預后提供準確的依據。

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The expressions of Ki-67 and TK1 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma

LIAO Yuan，JIAN Yi，LUO KE-shu

(1.Department of Pathology，Chengdu 6th People’s Hospital，Chengdu 660003，China；2.Department of Pathology，Chengdu Military General Hospital，Chengdu 610083，China)

JIAN Yi

Objective To explore the expressions of proliferating cell nuclear antigen 67(Ki-67) and thymidine kinase 1(TK1) in cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma.Methods Immunohistochemical method was used to detect the expressions of Ki-67 and TK1 in 40 cases of cervical carcinoma tissues，40 cases of cervical intraepithelial neoplasia tissues and 20 cases of normal cervical tissues.Results In cervical carcinoma，positive expression rates of Ki-67 and TK1 were significantly higher than those in cervical carcinoma tissues and normal cervical tissues (P< 0.05).In CIN Ⅱ～Ⅲ，numbers of Ki-67 and TK1 positive cells were higher than that in CINⅠ (P< 0.05).Correlation analysis showed that the expressions of Ki-67 and TK1 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer were correlated at certain degree.The expressions of TK1 and Ki-67 in cervical cancer were higher in cases with recurrence or metastasis than those without recurrence or metastasis.Conclusion Ki-67 and TK1 could play an important role in the genesis and development of cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma

Cervical carcinoma； Cervical intraepithelial neoplasia； Proliferating cell nuclear antigen67； Thymidine kinase 1

簡 燚

R737.33

A

1672-6170(2017)01-0055-04

2016-06-18；

2016-11-03)