張何，黃桂蘭，袁鈴，李騰

(防化研究院，國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205)

液相色譜–核磁共振聯(lián)用技術(shù)研究進(jìn)展

張何，黃桂蘭，袁鈴，李騰

(防化研究院，國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205)

介紹了液相色譜–核磁共振（LC–NMR）聯(lián)用技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r。討論了LC–NMR技術(shù)應(yīng)用中面臨的問題和解決方法，評(píng)述了LC–NMR和LC–SPE–NMR兩種工作模式。介紹了LC–NMR在天然產(chǎn)物分析、生物代謝、異構(gòu)體的鑒定和多聚物分析領(lǐng)域的應(yīng)用情況，對(duì)其發(fā)展動(dòng)態(tài)進(jìn)行了展望。

液相色譜；核磁共振；綜述

核磁共振技術(shù)是有機(jī)結(jié)構(gòu)鑒定中適用性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的分析方法，其局限性主要體現(xiàn)在核磁共振要求高純度的樣品，如果被分析物質(zhì)是混合物，會(huì)對(duì)1H譜圖產(chǎn)生嚴(yán)重的信號(hào)干擾和重疊，給解譜工作帶來困難，甚至無法解析。因此對(duì)混合物的分析，一般要先進(jìn)行分離和純化。色譜技術(shù)是目前最常用的分離手段，按照流動(dòng)相不同分為氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、超臨界流體色譜(SFC)、毛細(xì)管電泳色譜(CEC)等，其中以液相色譜在分離復(fù)雜的混合物方面的應(yīng)用最為廣泛，適用于70%以上的化合物分離。如果把液相色譜出色的分離能力同核磁共振技術(shù)有效的結(jié)構(gòu)解析能力結(jié)合到一起，實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)，不僅能簡化樣品前處理過程，提高自動(dòng)化程度，縮短檢測(cè)時(shí)間，而且能夠建立相關(guān)化合物色譜和核磁數(shù)據(jù)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系［1–5］，在分子分離鑒定領(lǐng)域有非常大的應(yīng)用潛力。

液相色譜–核磁共振(LC–NMR)聯(lián)用技術(shù)始于20世紀(jì)80年代［6］，但LC–NMR聯(lián)用技術(shù)的普及程度遠(yuǎn)不及已經(jīng)成熟的LC–MS和LC–MS–MS技術(shù)。要實(shí)現(xiàn)LC–NMR聯(lián)用需要克服兩大難點(diǎn)：一是NMR的低檢測(cè)靈敏度與LC分離容量兼容的問題，二是LC洗脫溶劑給NMR檢測(cè)帶來嚴(yán)重干擾的問題。經(jīng)過幾十年的NMR儀器和實(shí)驗(yàn)方法的發(fā)展，現(xiàn)已出現(xiàn)了更高場(chǎng)強(qiáng)的NMR儀器，設(shè)計(jì)出了更先進(jìn)的NMR探頭，發(fā)展了功能更豐富的脈沖序列技術(shù)，很大程度上解決了LC–NMR聯(lián)用中NMR靈敏度低、干擾過多等傳統(tǒng)問題，使得LC–NMR的相關(guān)應(yīng)用在近年的報(bào)道中迅速增多，技術(shù)更加實(shí)用化。筆者對(duì)LC–NMR的工作模式、存在的問題和解決方法進(jìn)行了評(píng)述，并簡單介紹了LC–NMR在天然產(chǎn)物鑒定［7–12］、藥物代謝［13–17］、異構(gòu)體研究［18–20］和多聚物分析［21］等領(lǐng)域的應(yīng)用情況。

1 LC–NMR工作模式

LC與NMR在線聯(lián)用的方式可以為LC與內(nèi)置樣品流動(dòng)檢測(cè)池的NMR探頭直接聯(lián)用(LC–NMR)；樣品從LC到全自動(dòng)固相萃取儀，再到NMR探頭的在線聯(lián)結(jié)(LC–SPE–NMR)。常規(guī)探頭與內(nèi)置流動(dòng)檢測(cè)池探頭的結(jié)構(gòu)對(duì)照如圖1所示［8］。

圖1 常規(guī)NMR探頭(a)和連續(xù)流動(dòng)NMR液相探頭(b)的構(gòu)造對(duì)比

1.1 LC–NMR直接在線聯(lián)用

LC–NMR在線聯(lián)用的通用配置有進(jìn)樣器、泵、色譜柱、檢測(cè)器、核磁共振儀[22]，配置液相探頭的NMR系統(tǒng)通過接口與常規(guī)的LC系統(tǒng)聯(lián)用。其主要有3種工作模式，即：連續(xù)流動(dòng)操作(on-flow)、停流操作(stop-flow)、環(huán)路收集(loop collection)和環(huán)路分析(loop analysis)。

LC–NMR的通用配置包括一個(gè)常規(guī)的HPLC系統(tǒng)、聯(lián)用接口和配備流動(dòng)探頭的NMR系統(tǒng)［22］。

1.1.1 連續(xù)流動(dòng)操作模式

連續(xù)流動(dòng)操作也稱作在流模式，即樣品從檢測(cè)器流入核磁探頭后保持流動(dòng)狀態(tài)，液相色譜正常工作，流動(dòng)探頭中的檢測(cè)腔為圖1(b)所示的內(nèi)徑為2～4 mm的玻璃管，玻璃管兩端連接LC導(dǎo)管作為流體的進(jìn)口和出口。在這種模式下，樣品進(jìn)入LC系統(tǒng)，經(jīng)色譜柱分離后，流經(jīng)檢測(cè)器(如紫外、DAD等)，進(jìn)入到核磁探頭中，被檢測(cè)采集信號(hào)，再從探頭流出，收集或作廢液處理。核磁數(shù)據(jù)的采集與色譜運(yùn)行同時(shí)開始，連續(xù)進(jìn)行，可得到一系列檢測(cè)信號(hào)。信號(hào)的處理結(jié)果是橫軸為化學(xué)位移，縱軸為洗脫時(shí)間的二維堆積圖或等高線圖[23]。這種模式存在幾個(gè)問題：(1)短時(shí)采樣使得靈敏度變差。在常規(guī)的流速下，組分在檢測(cè)線圈中保持的時(shí)間很短，使得NMR的采樣時(shí)間受限，造成NMR譜的信噪比很差，通常只使用于檢測(cè)靈敏度高的1H和19F核。(2)流速慢造成色譜峰擴(kuò)散。若將流速降低3～10倍，將延長組分在在檢測(cè)線圈中保持的時(shí)間，NMR的采樣時(shí)間也得以增加，使得NMR信噪比可以增強(qiáng)，但流速減慢導(dǎo)致的擴(kuò)散會(huì)影響色譜峰形。

1.1.2 停流操作模式

停流操作所使用的探頭與連續(xù)流動(dòng)模式相同，不同之處在于樣品流經(jīng)檢測(cè)器進(jìn)入核磁探頭之后，液相色譜流動(dòng)相停止流動(dòng)。最早的停留操作模式是一種基于“時(shí)間分割”［24］的工作模式：HPLC先開始運(yùn)行，起初的流動(dòng)方向與在線模式的方向相同；當(dāng)檢測(cè)器檢測(cè)到目標(biāo)組分時(shí)，停流延遲計(jì)數(shù)器被激活，完成等待時(shí)間后，流動(dòng)相停止流動(dòng)，此時(shí)NMR被激活，開始采集信號(hào)；信號(hào)采集完畢后，再開啟流動(dòng)，完成NMR信號(hào)采集的組分流出探頭。下一個(gè)組分按同樣操作方式采集。在此模式下采集的NMR譜與常規(guī)NMR譜相同。和連續(xù)流動(dòng)模式相比，停留操作測(cè)試得到的核磁共振信號(hào)更強(qiáng)，改善了連續(xù)流模式中短時(shí)采樣導(dǎo)致的信噪比差的問題，但由于沒有組分的富集過程，對(duì)于低濃度的樣品組分，需要高的NMR檢測(cè)靈敏度。這是因?yàn)橥１煤螅疵撘褐械暮罄m(xù)組分很容易橫向擴(kuò)散造成峰展寬嚴(yán)重，從而降低了分離效率。

1.1.3 環(huán)路收集模式／峰存貯模式

環(huán)路收集模式也稱為峰存貯(peak parking)模式，屬于停流操作的一種，分收集和分析兩個(gè)階段。首先是收集，在這一階段，當(dāng)HPLC檢測(cè)器檢測(cè)到一個(gè)組分峰時(shí)，環(huán)路延遲計(jì)數(shù)器被激發(fā)，將此組分收集到某一環(huán)路中，直至延遲完畢，切換閥將通道切換至下一個(gè)環(huán)路，收集下一個(gè)組分。此操作均可自動(dòng)和手動(dòng)進(jìn)行。第二階段是環(huán)路分析，在液相泵的驅(qū)動(dòng)下，一個(gè)環(huán)路中的組分流入探頭的檢測(cè)池內(nèi)，停泵，開始NMR采樣；采樣結(jié)束后，重啟液流，將下一個(gè)環(huán)路的組分推入探頭分析［22］。這樣的好處是將組分分開后分別存儲(chǔ)在不同的環(huán)路中，沒有停流操作帶來的色譜峰展寬，并且使得NMR的檢測(cè)時(shí)間不受到限制。而且檢測(cè)時(shí)，狀態(tài)穩(wěn)定，更容易獲得高信噪比和高分辨率的譜圖，實(shí)現(xiàn)一維譜和二維譜檢測(cè)，大大增加了在復(fù)雜樣品中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰的幾率。不足之處是樣品進(jìn)入管路之后被管路里的溶液稀釋，濃度下降，檢測(cè)信號(hào)變?nèi)酢?/p>

1.2 LC–SPE–NMR在線聯(lián)用

2013年，Lorena等［25］展示了HPLC–UV–SPE–NMR的在線聯(lián)用，LC分離采用普通的流動(dòng)相溶劑分離，以紫外檢測(cè)器監(jiān)測(cè)組分出峰，再利用自動(dòng)固相萃取(SPE)儀捕捉富集HPLC分離的組分，SPE柱用氮?dú)獯蹈珊?，再用氘代乙腈洗脫進(jìn)入核磁液相探頭分析。HPLC–UV–SPE–NMR工作系統(tǒng)的組成為液相色譜系統(tǒng)、紫外檢測(cè)器、固相微萃取系統(tǒng)和核磁共振儀等4部分。

LC–SPE–NMR在線聯(lián)用方式中，完成LC分離和SPE收集組分后，組分的洗脫進(jìn)入NMR檢測(cè)有兩種方式：第一種是流動(dòng)進(jìn)入檢測(cè)池方式，即探頭中安裝流動(dòng)檢測(cè)池，氘代溶劑將一個(gè)組分從SPE柱洗脫并通過管路流入探頭內(nèi)檢測(cè)池，完成檢測(cè)后，用氮?dú)鈴臋z測(cè)池中吹出組分，用溶劑清洗檢測(cè)池，氮?dú)獯蹈珊螅龠M(jìn)行下一個(gè)組分的分析。這種方式的優(yōu)點(diǎn)是減少樣品轉(zhuǎn)移步驟，因此樣品的損失也更少，但是這種方式的缺點(diǎn)也非常明顯：檢測(cè)池占用了探頭，不能執(zhí)行常規(guī)的核磁管樣品測(cè)試。第二種方式是采用自動(dòng)洗脫液轉(zhuǎn)移裝置(Tube Transfer)將目標(biāo)組分從SPE柱洗脫下來之后轉(zhuǎn)移至核磁管中，之后可以進(jìn)行常規(guī)核磁共振分析操作。相比第一種方式而言，這樣做增加了轉(zhuǎn)移樣品的步驟，過程中可能有樣品的損失，并且時(shí)間成本增加，但是這樣做的好處是不影響常規(guī)的核磁管樣品測(cè)試，而且自動(dòng)進(jìn)樣器可以照常使用，因此更具有實(shí)用價(jià)值［26–31］。

2 LC–NMR存在的問題和解決方法

2.1 NMR檢測(cè)靈敏度問題

NMR與色譜技術(shù)在線聯(lián)用至今未達(dá)到普及的主要瓶頸在于NMR的檢測(cè)靈敏度。相比于質(zhì)譜(MS)、紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)等檢測(cè)器μg級(jí)的檢測(cè)靈敏度，目前NMR常規(guī)室溫探頭檢測(cè)需要的化合物量是mg級(jí)，而分析型的液相色譜的分離容量是μg級(jí)，因此解決LC–NMR在線聯(lián)用的核心是提高NMR的檢測(cè)靈敏度。硬件上提高NMR檢測(cè)靈敏度的途徑有兩個(gè)：(1)提高超導(dǎo)磁體的磁場(chǎng)強(qiáng)度；(2)改進(jìn)探頭的設(shè)計(jì)。表1為不同磁體系統(tǒng)場(chǎng)強(qiáng)及探頭的檢測(cè)靈敏度指標(biāo)，從表1中可見，隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的升高，質(zhì)子的共振頻率增加，各檢測(cè)核的靈敏度指標(biāo)也隨之提高，在使用相同類型探頭的情況下，500 MHz比200 MHz譜儀的1H，19F，13C，31P四種核的檢測(cè)靈敏度提高了3～5倍。2009年，Bruker公司推出了全球首臺(tái)1 000 MHz的超導(dǎo)核磁共振波譜儀，使得NMR進(jìn)入了GHz時(shí)代，磁體的場(chǎng)強(qiáng)達(dá)到了23.5特斯拉，進(jìn)一步提高了各種核的檢測(cè)靈敏度。單純提高磁場(chǎng)強(qiáng)度來提高檢測(cè)靈敏度的效果是有限的，而通過優(yōu)化和改進(jìn)探頭的設(shè)計(jì)，可以顯著地提高檢測(cè)核的靈敏度。通過探頭設(shè)計(jì)提高靈敏度有3種方式：(1)采用大徑的核磁管。如表1所示，對(duì)于相同類型的探頭，隨著所檢測(cè)核磁管管徑的增大，相同濃度的樣品在檢測(cè)線圈范圍內(nèi)檢測(cè)到的核數(shù)量更多，信號(hào)響應(yīng)更強(qiáng)，靈敏度是10 mm ＞ 5 mm ＞ 3 mm。微量探頭通過減少溶劑的體積增加樣品濃度提高靈敏度；超微量探頭的設(shè)計(jì)，可使檢測(cè)樣品的體積低至40 μL，但核的檢測(cè)靈敏度低于常規(guī)的5 mm探頭。(2)探頭線圈位置的優(yōu)化設(shè)計(jì)。表1中，相同場(chǎng)強(qiáng)的1H核在反式檢測(cè)探頭的檢測(cè)靈敏度比相同頻率的寬帶探頭高了一倍以上，其設(shè)計(jì)原理是將1H核檢測(cè)線圈最靠近樣品而具有最高檢測(cè)靈敏度，但代價(jià)是犧牲了其它雜核的檢測(cè)靈敏度。(3)利用超導(dǎo)原理降低電子噪聲。超低溫探頭的設(shè)計(jì)原理是利用低溫的氦氣來冷卻探頭檢測(cè)線圈到25 K，前放電子線圈到70 K附近，可最大程度降低檢測(cè)到的電子噪聲，可使所有檢測(cè)核都比同頻率的常溫探頭的靈敏度提高3～5倍。超低溫微量探頭結(jié)合了超低溫探頭和微量探頭的優(yōu)點(diǎn)，可以在樣品量很少的情況下仍然保持較高的檢測(cè)靈敏度。

表1 不同磁體系統(tǒng)場(chǎng)強(qiáng)及探頭的檢測(cè)靈敏度指標(biāo)1)

2.2 LC分離和NMR需要長時(shí)間累加的矛盾

即便是提高了磁場(chǎng)強(qiáng)度和采用更高靈敏度的超低溫微量流動(dòng)探頭（并且目前商品化的儀器可以達(dá)到秒數(shù)量級(jí)，使得在流模式的LC–NMR可以在樣品流動(dòng)的情況下檢測(cè)樣品的信息），但對(duì)于13C，15N這類低豐度雜核的檢測(cè)，低濃度樣品的一維譜、二維譜的分析測(cè)試，仍然需要NMR長時(shí)間累加。慢流模式和停流模式的LC–NMR雖可以延長分離的組分在檢測(cè)池中停留的時(shí)間，但會(huì)造成色譜峰展寬，影響色譜分辨率。解決LC分離和NMR累加矛盾的方式：一是從色譜分離上解決，二是從NMR進(jìn)樣檢測(cè)方式上解決。這可以通過維持常規(guī)的LC分離、分離組分分別存儲(chǔ)的環(huán)路收集模式或固相萃取柱(SPE)收集模式實(shí)現(xiàn)。從色譜端提高樣品檢測(cè)濃度的方法：一是采用半制備色譜柱，增大一次分離的進(jìn)樣量［32–34］；二是多次LC進(jìn)樣分離后先通過SPE富集，再進(jìn)行NMR檢測(cè)。

2.3 溶劑峰抑制的問題

液相色譜中的流動(dòng)相溶劑如甲醇、乙腈、水等均含質(zhì)子，會(huì)在核磁共振氫譜過程中產(chǎn)生非常強(qiáng)的吸收信號(hào)，這些溶劑產(chǎn)生的NMR信號(hào)高于樣品中目標(biāo)化合物1萬倍以上［4］，會(huì)抑制或掩蓋目標(biāo)化合物的信號(hào)。解決方法是在進(jìn)行1H–NMR檢測(cè)時(shí)，采用溶劑峰壓制的脈沖程序技術(shù)和采用氘代溶劑作為流動(dòng)相。

主要的溶劑峰壓制技術(shù)有三種：預(yù)飽和(pre-saturation)技術(shù)、軟脈沖多重激發(fā)(Soft pulse multiple irradiation)和通過增強(qiáng)縱向弛豫(T1)效應(yīng)的水峰壓制(WET pre-saturation)技術(shù)。溶劑峰壓制技術(shù)的局限性是可能導(dǎo)致其附近的核磁共振信號(hào)丟失。

全程采用氘代溶劑作為流動(dòng)相的問題是成本過于昂貴而難以實(shí)施。解決這個(gè)問題主要圍繞減少氘代洗脫液用量和提高樣品濃度來考慮。一種方法是采用毛細(xì)管HPLC來大幅度減小流動(dòng)相的消耗量，使得全程采用氘代溶劑成為可能，避免溶劑峰壓制技術(shù)造成的目標(biāo)信號(hào)丟失問題［35–36］。另一種方法是采用普通流動(dòng)相溶劑進(jìn)行分離，組分利用固相萃取柱進(jìn)行收集，氮?dú)獯蹈扇軇┖?，用氘代溶劑洗脫后進(jìn)行核磁共振檢測(cè)的LC–SPE–NMR模式。這樣能完成樣品富集和凈化，節(jié)省氘代溶劑用量，提高NMR檢測(cè)靈敏度。

2.4 LC分離組分的識(shí)別收集問題

LC–NMR聯(lián)用的一個(gè)關(guān)鍵問題是混合物經(jīng)LC分離后的組分如何被識(shí)別和收集。在LC的常用檢測(cè)器中，LC–MS是通過總離子流色譜圖來觀察到所分離的組分的，LC–UV 或DAD是通過組分產(chǎn)生紫外吸收響應(yīng)信號(hào)來識(shí)別組分的。而NMR的檢測(cè)原理是原子核的共振，其信號(hào)響應(yīng)譜圖表征了分子的結(jié)構(gòu)信息，作用類似于質(zhì)譜圖，因此NMR作為檢測(cè)器，目前并不具備在一定時(shí)間域內(nèi)對(duì)每一個(gè)化合物產(chǎn)生一個(gè)單一響應(yīng)信號(hào)的功能，也就無法得到類似于總離子流色譜圖這樣的組分分離效果圖。所以在NMR檢測(cè)前需要一個(gè)能識(shí)別每個(gè)組分的“眼睛”，并將分離的組分分別收集后，再分別進(jìn)行NMR檢測(cè)。UV和DAD是最常規(guī)的LC檢測(cè)器，但屬于選擇性檢測(cè)器，價(jià)格便宜，適用于具有紫外吸收的化合物，而對(duì)于無發(fā)色團(tuán)的化合物則是盲區(qū)。MS屬于通用型檢測(cè)器，適用于不同類型化合物，還具有波譜鑒定結(jié)構(gòu)的功能，靈敏度高，LC–MS–NMR聯(lián)用是最理想的組合，但存在設(shè)備購置和使用成本過高的問題。隨著蒸發(fā)光散射檢測(cè)(ELSD)技術(shù)的發(fā)展，ELSD已實(shí)現(xiàn)了商品化，成為一種LC的新型通用型質(zhì)量檢測(cè)器，彌補(bǔ)了常規(guī)紫外檢測(cè)器的缺陷，與同樣適用于無紫外吸收化合物檢測(cè)的示差折光檢測(cè)器(RID)相比，具有靈敏度略高、受溫度影響小和可用于梯度洗脫的優(yōu)點(diǎn)［37–38］，在購買和維護(hù)成本上也比MS便宜許多?？梢灶A(yù)期，LC–ELSD–NMR的聯(lián)用是一種發(fā)展趨勢(shì)。

3 LC–NMR的應(yīng)用

3.1 天然產(chǎn)物分析

天然產(chǎn)物分析是LC–NMR最重要的應(yīng)用領(lǐng)域，這是由于天然產(chǎn)物的特點(diǎn)和LC–NMR分析鑒定能力共同決定的。為了尋找新的化合物，天然植物或動(dòng)物組織的粗提產(chǎn)品都要經(jīng)過多步的分離過程，采用不同的分離方法提純組分，以便進(jìn)行NMR的結(jié)構(gòu)鑒定，而天然產(chǎn)物的粗提液中往往含有大量結(jié)構(gòu)相近、很難分離的化合物，傳統(tǒng)的分離方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而采用LC–NMR則大大簡化了這個(gè)過程。另外，傳統(tǒng)的離線分離方法由于缺乏在線監(jiān)控，容易導(dǎo)致重復(fù)，而LC–NMR可以在分析的早期就對(duì)粗提物進(jìn)行識(shí)別判斷，去掉不想要的或已知化合物，集中精力在可能出現(xiàn)新結(jié)構(gòu)目標(biāo)的分離上。在這方面，更為便利的是LC–MS–SPE–NMR的聯(lián)用。在LC分離后，5%的流出液分離至MS檢測(cè)器，95%的流出液經(jīng)過SPE富集，再用氘代溶劑洗脫，用于NMR分析。一次進(jìn)樣分離即可同時(shí)獲得MS和NMR兩種數(shù)據(jù)，提高了天然產(chǎn)物的分析效率，成為了天然產(chǎn)物研究的重要技術(shù)手段。2012年Alexander等人［39］采用LC–MS和LC–NMR等技術(shù)鑒定野生山葡萄花青素，通過LC–NMR在線聯(lián)用明確鑒定出了樣品中33種花青素的結(jié)構(gòu)信息，特別是面對(duì)順式異構(gòu)體香豆素衍生物結(jié)構(gòu)的鑒定過程中多手性中心對(duì)結(jié)構(gòu)的確定帶來了很大困難的情況下，采用LC–MS和LC–NMR兩種聯(lián)用技術(shù)結(jié)果互相驗(yàn)證，對(duì)順式異構(gòu)體香豆素衍生物結(jié)構(gòu)的最終確定發(fā)揮了重要作用。2013年Johansen等［11］發(fā)展了HPLC–SPE–NMR在線檢測(cè)技術(shù)，使用超低溫探頭可以對(duì)兩組混合的天然產(chǎn)物進(jìn)行區(qū)分，得到的譜圖雜峰信息很少，并且容易區(qū)分。2015年Brkljaca等［12］使用HPLC–NMR 和HPLC–MS 在海洋褐藻中的提取物中，找到4種未報(bào)道的化合物和8種已經(jīng)報(bào)道的化合物，其中5種化合物具有選擇抗菌活性。Brkljaca等人在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路：高效液相色譜時(shí)間切片分離的組分被依次富集在固相萃取柱上，之后被洗脫獲得NMR譜圖，通過數(shù)據(jù)庫對(duì)比，得到多種化合物結(jié)構(gòu)信息。

3.2 藥物代謝研究

LC–NMR的另一個(gè)主要應(yīng)用領(lǐng)域是藥物分析，涉及化學(xué)藥物中雜質(zhì)的定性定量分析、中藥及天然藥物中藥用成分異構(gòu)體的分析及新化合物的結(jié)構(gòu)鑒定、海洋生物及生化大分子的分析、藥物代謝分析等。

2001年Daykin等［40］提出脂蛋白復(fù)合物的分析方法，采用HPLC–NMR 技術(shù)分離檢測(cè)了3種脂蛋白，分離檢測(cè)時(shí)間只耗費(fèi)90 min，并且HPLC分離也沒有造成蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的損傷。2001年Scarfe等［41］研究2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苯胺在鼠體內(nèi)的代謝，通過19F NMR，HPLC–NMR和HPLC–MS分析了鼠尿中的各種代謝物，發(fā)現(xiàn)38%的2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苯胺轉(zhuǎn)化5種代謝物隨尿液排出，并研究了代謝物的轉(zhuǎn)化途徑。2010年Durand 等人［14］通過LC–NMR，NMR，LC–MS等技術(shù)手段，分析了甲基磺草酮為主要成分的農(nóng)藥的生物降解產(chǎn)物，其中LC–NMR識(shí)別出6種代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)，為預(yù)測(cè)其化學(xué)環(huán)境行為提供了依據(jù)。2010年Akiraa等［15］利用LC–NMR技術(shù)鑒定了一種遺傳性高血壓大鼠體內(nèi)牛黃酸代謝物，發(fā)現(xiàn)在遺傳性高血壓大鼠尿液中檢測(cè)到這種與降壓有關(guān)的?；撬岽x物要比正常大鼠尿液中多很多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在病理學(xué)中有重要意義。2013年Braunberger等［16］使用LC–NMR，NMR，LC–MS等技術(shù)鑒定茅膏中黃酮和鞣花酸衍生物，并采用LC–DAD對(duì)衍生物進(jìn)行定量。2015 年Mallikarjun等［17］使用LC–MS／TOF、LC–NMR等技術(shù)鑒定壓力下藥物西拉普利在酸性和堿性條件下的降解產(chǎn)物，并根據(jù)降解產(chǎn)物對(duì)藥物作用機(jī)理做出了概述。

3.3 異構(gòu)體分析

2011年Haroune等［19］使用LC–NMR技術(shù)鑒定爆炸危險(xiǎn)品三過氧化三丙酮(TATP)的構(gòu)象。由于立體構(gòu)象的不同，三過氧化三丙酮可以存在兩種結(jié)構(gòu)。LC–NMR 聯(lián)用實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)液相色譜分離出峰情況可以確定主要構(gòu)象，NMR譜圖顯示主要構(gòu)象化學(xué)位移在δ1.38 附近，次要構(gòu)象化學(xué)位移在δ1.67 和δ1.13附近。通過長時(shí)間測(cè)量流動(dòng)腔中TATP不同化學(xué)位移處積分面積的變化情況可以檢測(cè)兩種構(gòu)象轉(zhuǎn)變的動(dòng)力學(xué)關(guān)系。2015年Baranovsky等［20］使用LC–DAD–SPE–NMR和LC–MS技術(shù)，分離鑒定反應(yīng)混合物中的微量組分，研究了化合物3-甲氧基-14，17-亞乙烯基-16α-硝基-1，3，5(10)三烯基-17β-乙酸(3-methoxy-14，17-etheno-16α-nitroestra-1，3，5(10)-trien-17β-yl acetate)在 NaHCO3存在下的乙醇溶劑分解作用，揭示了內(nèi)酰胺的形成途徑。

3.4 聚合物分析

合成的聚合物是高度復(fù)雜的多組分物質(zhì)，由不同鏈長、不同化學(xué)組分和不同結(jié)構(gòu)的大分子所組成?？紤]到化學(xué)組分、組合和末端功能團(tuán)等因素，合成聚合物的組分相當(dāng)復(fù)雜。

HPLC–NMR技術(shù)是聚合物分析重要的手段之一。通過HPLC的分離不僅能根據(jù)聚合物的分子量對(duì)聚合物進(jìn)行分離，而且能夠區(qū)分相同分子量但是采用不同枝節(jié)方式的聚合物。之后的分析檢測(cè)中，根據(jù)末端官能團(tuán)的差異可以進(jìn)行NMR的鑒定。

2005年Hiller等［42］使用LC–NMR分析了包含不同末端官能團(tuán)的PEO混合物。在采用溶劑峰壓制技術(shù)之后，對(duì)每一個(gè)峰都可以進(jìn)行歸屬和指認(rèn)。并且面對(duì)特異的末端官能團(tuán)，峰的信號(hào)強(qiáng)度還可以作為定量的依據(jù)。

4 結(jié)語

LC–NMR聯(lián)用技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，相比該技術(shù)被提出之時(shí)，無論從儀器分辨率、聯(lián)用的接口技術(shù)，還是去除溶劑信號(hào)干擾能力、提高信號(hào)強(qiáng)度等方面都有了質(zhì)的飛躍和提高。此外，也在相當(dāng)大的程度上擴(kuò)展了LC–NMR聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。相信今后隨著技術(shù)的發(fā)展，從改進(jìn)探頭、設(shè)計(jì)更加合理的檢測(cè)線圈流動(dòng)腔、使用普適性的液相色譜檢測(cè)器、尋求更有效的富集方法等方面進(jìn)一步改進(jìn)LC–NMR聯(lián)用技術(shù)，會(huì)使得LC–NMR聯(lián)用技術(shù)在分離分析和結(jié)構(gòu)鑒定領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

［1］Clarkson C，Sibum M，Mensen R，et al. Evaluation of on–line solid–phase extraction parameters for hyphenated，high–performance liquid chromatography–solid-phase extraction–nuclear magnetic resonance applications［J］. Journal of Chromatography A，2007，1 165: 1–9.

［2］Wasim M，Brereton R G. Application of evolving factor analysis to on–flow LC–NMR data using spectral windows ［J］. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems，2005，78: 51–62.

［3］劉江疆，林金明.高效液相色譜–核磁共振聯(lián)用技術(shù)［J］. 生命科學(xué)儀器，2005，3(3): 3–8.

［4］劉西哲，生寧，李飛高，等.液相色譜–質(zhì)譜–核磁共振聯(lián)用技術(shù)及其在藥物代謝與結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用［J］. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32(12): 972–974.

［5］楊婷婷，段續(xù)，金松子，等. 液相色譜–核磁共振聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2012，27(6): 635–641.

［6］Bayer E，Albert K，Nleder M，et al. On-line coupling of liquid chromatography and high-field nuclear magnetic resonance spectrometry ［J］. Analytical Chemistry，1982，54: 1 747–1 750.

［7］Hooft J，Mihaleva V，Vos R，et al. A strategy for fast structural elucidation of metabolites in small volume plant extracts using automated MS-guided LC–MS–SPE–NMR［J］. Magnetic Resonance in Chemistry，2011，49: 55–60.

［8］Albert K. On-line LC–NMR and related techniques［M］. New York，John Wiley & Sons Inc，2002.

［9］Wubshet G S，Moresco H H，Tahtah Y，et al. High-resolution bioactivity profiling combined with HPLC–HRMS–SPE–NMR: a-Glucosidase inhibitors and acetylated ellagic acid rhamnosides from Myrcia palustris DC［J］. Phytochemistry，2015，116: 246–252.

［10］Iwasa K，Wenhua C，Takahashi T，et al. Biotransformation of Phenolic Tetrahydroprotoberberines in Plant Cell Cultures Followed by LC–NMR，LC–MS，and LC–CD［J］. Journal of Natural Products，2010，73: 115–122.

［11］Johansen K T，Wubshet S G，Nyberg N T. HPLC–NMR revisited: using time–slice high–performance liquid chromatography–solidphase extraction–nuclear magnetic resonance with databaseassisted dereplication［J］. Analytical Chemistry，2013，85: 3 183–3 189.

［12］Brkljaca R，Urban S. HPLC–NMR and HPLC–MS investigation of antimicrobial constituents in Cystophora monilifera and Cystophora subfarcinata［J］. Phytochemistry，2015，117: 200–208.

［13］Singh S，Handa T，Narayanam，et al. A critical review on the use of modern sophisticated hyphenated tools in the characterization of impurities and degradation products［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，69: 148–173.

［14］Durand S，Sancelme M，Pascale B H，et al. Biodegradation pathway of mesotrione: Complementarities of NMR，LC–NMR and LC–MS for qualitative and quantitative metabolic profiling ［J］. Chemosphere，2010，81: 372–380.

［15］Akiraa K，Mitome H，Imachi M，et al. LC–NMR identification of a novel taurine-related metabolite observed in1H NMR-based metabonomics of genetically hypertensive rats［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2010，51: 1 091–1 096.

［16］Braunberger C，Zehl M，Conrad J，et al. LC–NMR，NMR，and LC–MS identification and LC–DAD quantification of flavonoids and ellagic acid derivatives in Drosera peltata［J］. Journal of Chromatography B，2013，932: 111–116.

［17］Narayanam M，Sahu A，Singh S. Use of LC–MS／TOF，LC–MS，NMR and LC–NMR in characterization of stress degradation products: Application to cilazapril ［J］. Journal of Pharmaceuticaland Biomedical Analysis，2015，111: 190–203.

［18］Pursch M，Strohschein S，Handel H，et al. Temperature–dependent behavior of C30interphases: a solid-state NMR and LC–NMR study［J］. Analytical Chemistry，1996，68(2): 386–393.

［19］Haroune N，Crowson A，Campbell B. Characterisation of triacetone triperoxide (TATP) conformers using LC–NMR［J］. Science and Justice，2011，51: 50–56.

［20］Baranovsky A V，Bolibrukh D A，Schneider B. Solvolysis of 14，17-etheno-bridged 16a-nitroestratrienyl acetate and lactam formation pathways studied by LC–NMR and LC–MS Structures of minor products［J］. Steroids，2015，104: 37–48.

［21］Hiller W，Pasch H，Macko T，et al. On-line coupling of high temperature GPC and1H NMR for the analysis of polymers［J］. Magnetic Resonance in Chemistry，2006，183: 290–302.

［22］Hiller W，Sinha P，Hehn M，et al. Online LC–NMR–From an expensive toy to a powerful tool in polymer analysis ［J］. Progress in Polymer Science，2014，39: 979–1 016.

［23］Wasim M，Brereton R G. Application of multivariate curve resolution methods to on-flow LC–NMR［J］. Journal of Chromatography A，2005，1 096: 2–15.

［24］曲峻，羅國安，吳筑平. 高效液相色譜–核磁共振聯(lián)用技術(shù)最新進(jìn)展［J］. 分析化學(xué)，1999，27(8): 976–981.

［25］Silva Lorena M A，F(xiàn)ilho Elenilson G A，Thomasi S S，et al. Use of diffusion–ordered NMR spectroscopy and HPLC–UV–SPE–NMR to identify undeclared synthetic drugs in medicines illegally sold as phytotherapies［J］. Magnetic Resonance in Chemistry，2013，51: 541–548.

［26］Capistrano I R，Wouters A，F(xiàn)oubert K，Balde A M，et al. Phytochemical characterisation of a cytotoxic stem bark extract of Steganotaenia araliacea and identification of a protoflavanone by LC–SPE–NMR［J］. Phytochemistry letters，2015，12: 119–124.

［27］Fritsche J，Angoelal R，Dachtler M. On-line liquidchromatography–nuclear magnetic resonance spectroscopy–mass spectrometry coupling for the separation and characterization of secoisolariciresinol diglucoside isomers in flaxseed［J］. Journal of Chromatography A，2002，972: 195–203.

［28］Godejohann M，Tseng L H，Braumann U，et al. Characterization of a paracetamol metabolite using on-line LC–SPE–NMR–MS and a cryogenic NMR probe［J］. Journal of Chromatography A，2004，1 058: 191–196.

［29］Hendrawati O，Woerdenbag H J，Michiels Paul J A，et al. Identification of lignans and related compounds in anthriscus sylvestris by LC–ESI–MS／MS and LC–SPE–NMR［J］. Phytochemistry，2011，72: 2 172–2 179.

［30］Tatsis E C，Boeren S，Exarchou V，et al. Identification of the major constituents of Hypericum perforatum by LC／SPE／NMR and／or LC／MS［J］. Phytochemistry，2007，68: 383–393.

［31］Yongjiang Xu，F(xiàn)oubert K，Dhooghe L，et al. Rapid isolation and identification of minor natural products by LC–MS，LC–SPE–NMR and ECD: isoflavanones，biflavanones and bisdihydrocoumarins from ormocarpum kirkii［J］. Phytochemistry，2012，79: 121–128.

［32］Miliauskas G，Miliauskas G，Beek T A，et al. Comparison of analytical and semi-preparative columns for high–performance liquid chromatography–solid-phase extraction–nuclear magnetic resonance［J］. Journal of Chromatography A，2006，1 112: 276–284.

［33］Rinaldi F，Junying Fan，Pathirana C，et al. Semi-preparative LC–SPE-cryoflow NMR for impurity identifications: use of mother liquor as a better source of impurities［J］. Magnetic Resonance in Chemistry，2013，51: 517–522.

［34］Feng Xu，Alexander A J. The design of an on-line semipreparative LC–SPE–NMR system for trace analysis［J］. Magnetic Resonance in Chemistry，2005，43: 776–782.

［35］Hentschel P，Krucher M，Grynbaum M D，et al. Determination of regulatory phosphorylation sites in nanogram amounts of a synthetic fragment of ZAP–70 using microprobe NMR and online coupled capillary HPLC–NMR［J］. Magnetic Resonance in Chemistry，2005，43: 747–754.

［36］Lewis R J，Bernstein M A，Duncan S J，et al. A comparison of capillary-scale LC–NMR with alternative techniques: spectroscopic and practical considerations［J］. Magnetic Resonance in Chemistry，2005，43: 783–789.

［37］Cruz A，Hilbert G，Riviere C，et al. Anthocyanin identification and composition of wild vitis spp.accessions by using LC–MS and LC–NMR［J］. Analytica Chimica Acta，2012，732: 145–152.

［38］王巧娥，丁明玉. 蒸發(fā)光散射檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2006，25(6): 126–132.

［39］蘇本正，都波，石典花. 發(fā)光散射檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器用于人參中皂苷類成分檢測(cè)的比較研究［J］. 藥學(xué)研究，2013，32(6): 333–335.

［40］Daykin C A，Corcoran O，Hansen S H，et al. Application of directly coupled HPLC NMR to separation and characterization of lipoproteins from human serum［J］. Analytical Chemistry，2001，73: 1 084–1 090.

［41］Nicholson J K，Lindon J C，Scarfe G B. High–performance liquid chromatography linked to inductively coupled plasma mass spectrometry and orthogonal acceleration time-of-flight mass spectrometry for the simultaneous detection and identification of metabolites of 2-Bromo-4-trifluoromethyl-［13C］-acetanilide in rat urine［J］. Analytical Chemistry，2001，73: 1 491–1 494.

［42］Hiller W，Brull A，Argyropoulos D，et al. HPLC–NMR of fatty alcohol ethoxylates［J］. Magnetic Resonance in Chemistry，2005，43: 729–735.

Advances of Liquid Chromatography Coupled with Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer

Zhang He，Huang Guilan，Yuan Ling，Li Teng
(State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian， Research Institution of Chemical Defense， Beijing 102205，China)

The development of liquid chromatography–nuclear magnetic resonance (LC–NMR) technology was introduced. The problems encountered in application and comment the working model of LC–NMR and LC–SPE–NMR were discussed. The application of LC–NMR technology in the field of biological metabolism，natural product analysis，isomer identification and polymers analysis was introduced. The development trend of LC–NMR was put forward.

liquid chromatography; nuclear magnetic resonance; review

O657.7

A

1008–6145(2017)02–0117–06

聯(lián)系人：張何；E-mail: pkuxiaoxiaohe@163.com

2016–12–20

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.02.028