周宋元，黃穎，徐元宏

（安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 檢驗科，安徽 合肥 230022）

MALDI-TOF MS技術(shù)在鑒定臨床少見非發(fā)酵菌中的應(yīng)用

周宋元，黃穎，徐元宏

（安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 檢驗科，安徽 合肥 230022）

目的評價基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)在快速鑒定臨床少見非發(fā)酵菌中的應(yīng)用價值。方法選取2013年7月-2016年10月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科分離的67株臨床少見非發(fā)酵菌，包括痰液分離的21株，尿液分離的13株，血液分離的9株，骨髓液分離的9株，分泌物分離的8株，腹透液分離的2株，腦脊液分離的1株，膽汁分離的1株，其他體液分離的3株。以16S核糖體RNA（16SrRNA）序列分析為金標準，比較MALDI-TOF MS與Vitek2 Compact鑒定系統(tǒng)鑒定的準確性。結(jié)果67株臨床少見非發(fā)酵菌中，MALDI-TOF MS將66株（98.5%）鑒定到種水平，1株（1.5%）鑒定到屬水平；Vitek2 Compact鑒定系統(tǒng)將59株（88.1%）鑒定到種水平，8株（11.9%）未能鑒定；67株少見非發(fā)酵菌均擴增到16SrRNA目的基因片段并成功測序，67株（100.0%）都成功鑒定到種水平。以16SrRNA序列分析為金標準，MALDITOF MS和Vitek2 Compact鑒定系統(tǒng)正確鑒定到種水平準確性分別為98.5%（66/67）和88.1%（59/67）。結(jié)論與傳統(tǒng)的細菌生化反應(yīng)方法相比，MALDI-TOF MS技術(shù)操作簡便、耗時短、費用低，鑒定結(jié)果與16SrRNA序列分析的符合率高，可以提高臨床對少見非發(fā)酵菌鑒定的準確率。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜；非發(fā)酵菌；鑒定

臨床上分離的常見非發(fā)酵菌以銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等為主[1-2]，對較少分離的非發(fā)酵菌目前用傳統(tǒng)的生化反應(yīng)方法鑒定，影響因素較多，鑒定結(jié)果不理想?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年來應(yīng)用于臨床病原微生物快速鑒定的一項新技術(shù)，不同的細菌經(jīng)MALDI-TOF MS系統(tǒng)檢測可形成特異性的蛋白圖譜，將待測細菌的蛋白圖譜與已有圖庫進行比對，即可確定細菌種屬。本研究應(yīng)用Vitek2 Compact鑒定系統(tǒng)、MALDI-TOF MS技術(shù)及16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA，16SrRNA）序列分析3種方法對67株臨床少見非發(fā)酵菌進行鑒定比較，以評估質(zhì)譜技術(shù)在鑒定臨床少見非發(fā)酵菌中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 實驗菌株

選取2013年7月-2016年10月于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科分離的67株臨床少見非發(fā)酵菌，包括痰液分離的21株，尿液分離的13株，血液分離的9株，骨髓液分離的9株，分泌物分離的8株，腹透液分離的2株，腦脊液分離的1株，膽汁分離的1株及其他體液分離的3株。剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株。所有菌株轉(zhuǎn)入菌種液置入-80℃冰箱冷凍保存，統(tǒng)一檢測。

1.2 實驗儀器與試劑

VITEK2 COMPACT全自動細菌鑒定儀及配套革蘭陰性細菌鑒定卡（法國生物梅里埃公司），VITEK MS質(zhì)譜儀（法國生物梅里埃公司），細菌DNA抽提試劑盒與聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司），DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司），PCR擴增儀（德國Biometra公司），電泳儀（北京六一儀器廠），凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市江南儀器廠），超速低溫離心機（美國Sigma公司），-80℃超低溫冰箱（日本SANYO公司）。

1.3 質(zhì)控和校準菌株

質(zhì)控：大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 17666；校準：大腸埃希菌 ATCC 8739。菌株均采購于國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心。

1.4 細菌分離培養(yǎng)及鑒定

1.4.1 VITEK2 COMPACT鑒定 按常規(guī)方法[3]進行細菌分離培養(yǎng)，挑取純菌落配0.5麥氏濁度的菌懸液，再用VITEK2 COMPACT全自動微生物鑒定儀及配套的革蘭陰性細菌鑒定卡進行菌種鑒定。

1.4.2 MALDI-TOF MS鑒定 ①靶板制備：取1μl一次性接種環(huán)將新鮮的校準菌株大腸埃希菌ATCC 8739涂在質(zhì)譜儀靶板的校準位點，取新鮮的待測純菌落涂在各個測試靶點上，每個靶點滴加1μl α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液，待菌株完全干燥后上機。②上機分析：在電腦上輸入靶板號與標本號，點擊傳輸?shù)絻x器系統(tǒng)軟件，儀器打開艙門，將靶板放入靶板槽，待儀器門關(guān)閉完成，儀器開始自動分析。軟件自動與數(shù)據(jù)庫（VITEK MS-IVD數(shù)據(jù)庫V2.0版本）中已知菌種的蛋白圖譜進行比對，從而得出最終鑒定結(jié)果。

1.4.3 16SrRNA序列分析 將細菌鑒定系統(tǒng)鑒定過的純菌落接種于配置好的肉湯中，置入35℃溫箱中搖菌（200 r/min）過夜，取過夜菌懸液在室溫下8 000 r/min離心1 min，取沉淀物嚴格按照細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒步驟提取細菌DNA。參照相關(guān)文獻[4]，選用16SrRNA細菌通用引物，配PCR體系50μl，進行擴增。27F正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R反向引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。取PCR產(chǎn)物8μl加入1%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察，確認目標基因擴增成功，PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司，結(jié)果參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會MMl8-A解釋的標準[5]在美國國立生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫中進行比對。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以百分比（%）表示，用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 標準菌株鑒定結(jié)果

質(zhì)控菌株經(jīng)PCR擴增后電泳凝膠系統(tǒng)成像均在1 500 bp處獲得陽性產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小吻合。所測序列與核酸數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)菌株比對分析結(jié)果完全符合。見圖1、2。

2.2 67株實驗菌株電泳結(jié)果

16SrRNA基因PCR擴增后電泳凝膠系統(tǒng)成像均在1 500 bp處獲陽性產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小吻合。見圖3。

圖1 質(zhì)控菌株電泳圖

圖2 大腸埃希菌ATCC 25922蛋白質(zhì)譜圖

圖3 部分實驗菌株電泳圖

表1 Vitek2 Compact、MALDI-TOF MS及16sRNA序列分析鑒定在種水平一致的菌株

2.3 Vitek2 Compact系統(tǒng)、MALDI-TOF MS及16SrRNA序列分析結(jié)果比較

2.3.1 Vitek2 Compact系統(tǒng)與MALDI-TOF MS比較 67株臨床少見非發(fā)酵菌株，其中59株（88.1%）Vitek2 Compact系統(tǒng)與MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果在種水平一致，5株（7.5%）Vitek2 Compact系統(tǒng)與MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果在屬水平不一致；Vitek2 Compact系統(tǒng)無法鑒定的菌株有8株（11.9%），MALDI-TOF MS只鑒定到屬水平的有1株（1.5%）。兩種鑒定技術(shù)比較，經(jīng)配對χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.319，P=0.000），提示兩種鑒定技術(shù)一致性或關(guān)聯(lián)性較好。兩種鑒定技術(shù)優(yōu)勢性比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.800，P=0.371）。見表1～3。

表2 Vitek2 Compact、MALDI-TOF MS及16sRNA序列分析鑒定在屬水平不同的菌株

表3 Vitek2 Compact無法鑒定菌株與MALDI-TOF MS、16sRNA序列分析鑒定菌株比較

2.3.2 進一步鑒定分析 該67株臨床少見非發(fā)酵菌均擴增到16SrRNA目的基因片段并成功測序，67株（100%）都鑒定到種水平。以16SrRNA序列分析為金標準，其中Vitek2 Compact鑒定系統(tǒng)將臨床少見非發(fā)酵菌正確鑒定到種水平準確性為88.1%（59/67），而MALDI-TOF MS正確鑒定到種水平準確性較高，為98.5%（66/67）。見圖4～6。

圖4 人蒼白桿菌蛋白質(zhì)譜圖

圖5 皮氏羅爾斯頓菌蛋白質(zhì)譜圖

圖6 食酸代爾夫特菌蛋白質(zhì)譜圖

3 討論

非發(fā)酵菌是一大群條件致病菌，最近幾年來，由于抗生素的不合理使用導(dǎo)致本來為條件致病菌的非發(fā)酵菌成為重要的臨床致病菌，廣泛播散[6]。目前，傳統(tǒng)的微生物鑒定技術(shù)已經(jīng)很難滿足臨床的需求，檢驗科微生物室急需一種簡便、高效、快速的鑒定方法。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)作為一種新興的微生物鑒定技術(shù)，在國內(nèi)外廣受關(guān)注[7-12]。MALDI-TOF MS技術(shù)于2011年獲得歐洲共同體體外診斷認證，2012年8月獲得中國CFDA注冊證，2013年8月獲得美國FDA認證，意味著應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)的質(zhì)譜儀真正進入臨床微生物和患者診療。許多研究都對MALDI-TOF MS技術(shù)進行評價，認為其在臨床微生物領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，值得期待。MALDI-TOF MS技術(shù)是利用已有的蛋白質(zhì)譜指紋庫中的信息或建立新的蛋白質(zhì)譜指紋庫數(shù)據(jù)，通過比較待測菌株與標準菌株的質(zhì)譜圖而對微生物的種屬進行鑒定[13-14]。

本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS、16SrRNA序列分析及Vitek2 Compact鑒定系統(tǒng)同時對67株臨床少見非發(fā)酵菌進行鑒定，根據(jù)實驗結(jié)果數(shù)據(jù)分析評價MALDI-TOF MS技術(shù)在快速鑒定臨床少見非發(fā)酵菌中的應(yīng)用價值。實驗提示，MALDI-TOF MS技術(shù)正確鑒定到種水平的鑒別能力高于Vitek2 Compact鑒定方法。而Vitek2 Compact與MALDI-TOF MS方法無法鑒定的疑難細菌，使用16SrRNA序列分析均能成功鑒定。這與葉乃芳等[15]做的90株臨床疑難細菌的質(zhì)譜鑒定與Vitek2 Compact鑒定比較的結(jié)論一致。

本研究收集的少見非發(fā)酵菌標本，數(shù)量較少，有待后續(xù)的研究中收集多家醫(yī)院相關(guān)菌株，進一步評估MALDI-TOF MS技術(shù)在鑒定少見非發(fā)酵菌的應(yīng)用價值。

盡管MALDI-TOF MS技術(shù)在鑒定臨床微生物中已經(jīng)得到廣泛認可，但是還有很多影響其鑒定結(jié)果的因素，如基質(zhì)的選擇、樣品的前處理方式、數(shù)據(jù)庫的完善等，應(yīng)該引起學者日常工作的重視[16]。所以在臨床微生物檢驗中建立規(guī)范化的培養(yǎng)、恰當?shù)臉悠诽幚矸绞胶蜆藴实馁|(zhì)譜分析操作流程，將能提高質(zhì)譜技術(shù)鑒定的準確性。

綜上所述，與傳統(tǒng)的細菌生化反應(yīng)方法相比，MALDI-TOF MS技術(shù)操作簡便、耗時短、費用低，鑒定結(jié)果與16SrRNA序列分析的符合率高，可以提高臨床對少見非發(fā)酵菌鑒定的準確率。臨床上應(yīng)不斷完善細菌蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫，從而進一步提高對細菌的鑒定水平。

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（童穎丹 編輯）

Application of matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry technique for identification of rare non-fermentative bacteria in clinic

Song-yuan Zhou,Ying Huang,Yuan-hong Xu
(Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei,Anhui 230022,China)

ObjectiveTo evaluate the application value of matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)technique in the rapid identification of rare non-fermentative bacteria.MethodsFrom July 2013 to October 2016,67 clinical isolates of rare non-fermentative bacteria were collected from the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,which included 21 strains isolated from sputum,13 strains from urine,9 strains from blood,9 strains from bone marrow,8 strains from secretions,2 strains from peritoneal dialysis fluid,1 strain from cerebrospinal fluid,1 strain from bile,and 3 strains from other body fluids.According to the gold standard of 16SrRNA sequence analysis,the accuracy of the identification system of MALDI-TOF MS and Vitek2 Compact was compared.ResultsIn the 67 strains of bacteria,MALDI-TOF MS technique identified 66 strains(98.5%)to species level and 1 strains(1.5%)to genus level;while Vitek2 Compact identified 59 strains(88.1%)to species level,and 8 strains(11.9%)failed to identify.16SrRNA gene fragments were amplified from the 67 strains of experimental bacteria and successfully sequenced,all of the strains were identified to species level.Using 16SrRNA sequence analysis as thegold standard,the accuracy of MALDI-TOF MS system and Vitek2 Compact system for identification at the species level was 98.5%(66/67)and 88.1%(59/67)respectively.ConclusionsCompared with traditional bacteria biochemical reaction method,MALDI-TOF MS technique is simple,rapid and inexpensive.Its accuracy of identification result is highly consistent with that of 16SrRNA sequence analysis,MALDI-TOF MS technique can improve the accuracy of clinical identification of non-fermentative bacteria.

matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry;non-fermentative bacteria;identification

R371；R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.014

1005-8982（2017）09-0069-05

2016-11-07

徐元宏，E-mail：xyhong1964@163.com；Tel：13505694447