金沅武，趙媛，孟祥嬌

（1.山東省淄博礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院 腫瘤血液科，山東 淄博 255120；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250062）

E2F-1與小細(xì)胞肺癌多藥耐藥及預(yù)后的相關(guān)性*

金沅武1，趙媛1，孟祥嬌2

（1.山東省淄博礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院 腫瘤血液科，山東 淄博 255120；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250062）

目的探討E2F-1在小細(xì)胞肺癌（SCLC）多藥耐藥中的作用及其與預(yù)后的關(guān)系。方法檢測(cè)92例SCLC患者腫瘤組織中E2F-1的表達(dá)，分析E2F-1 mRNA表達(dá)對(duì)患者生存時(shí)間的影響，培養(yǎng)人SCLC敏感細(xì)胞株H69和多藥耐藥細(xì)胞株H69AR，分為E2F-1過表達(dá)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞藥物敏感性。結(jié)果SCLC組織中E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低表達(dá)組患者中位生存時(shí)間與高表達(dá)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；E2F-1過表達(dá)組H69細(xì)胞對(duì)阿霉素、順鉑和依托泊苷的IC50值與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而E2F-1干擾組H69AR細(xì)胞對(duì)阿霉素、順鉑及依托泊苷的IC50值與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論E2F-1在SCLC組織中呈高表達(dá)，下調(diào)E2F-1可增強(qiáng)多藥耐藥細(xì)胞株H69AR對(duì)化療藥物敏感性。

小細(xì)胞肺癌；E2F-1；RNA干擾；多藥耐藥

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）占原發(fā)性肺癌的16%～25%[1]，臨床上以全身化療作為SCLC治療重點(diǎn)，但易發(fā)生化療耐藥而影響患者預(yù)后[2]。研究表明，細(xì)胞增殖和凋亡失衡是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生多藥耐藥的重要原因[3]。E2F-1作為細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F家族重要成員，是調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡過程的關(guān)鍵性啟動(dòng)子[4]，通過多種途徑參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡過程[5]。本研究分析SCLC患者腫瘤組織中E2F-1的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，利用小分子RNA干擾抑制其表達(dá)，觀察對(duì)SCLC多藥耐藥的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2006年3月-2011年3月在山東省淄博礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院診治的SCLC患者92例。其中，男性42例，女性50例，平均年齡（53.8 ±9.7）歲。所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查確診，確診前均未接受放化療治療。臨床分期：61例為廣泛期，31例為局限期。所有患者行依托泊苷聯(lián)合順鉑化療方案，治療5～6個(gè)周期后完全緩解或部分緩解（化療敏感）30例，穩(wěn)定或進(jìn)展（化療耐藥）62例。所有患者留取腫瘤組織及其癌旁組織保存于-70℃液氮中以備檢，本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

人SCLC敏感細(xì)胞株H69和多藥耐藥細(xì)胞株H69AR均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Trizol總RNA提取試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司，E2F-1、E2F-1干擾系列及模擬序列、陰性對(duì)照序列及內(nèi)參引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，活細(xì)胞計(jì)數(shù)法試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人SCLC敏感細(xì)胞株H69和多藥耐藥細(xì)胞株H69AR分別用含15%胎牛血清和20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在5%二氧化碳CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時(shí)，將細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度5×105個(gè)/ml，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同，將人SCLC敏感細(xì)胞株H69細(xì)胞分為3組：①E2F-1過表達(dá)組。通過質(zhì)粒重組、病毒包裝構(gòu)建E2F-1啟動(dòng)子溶瘤病毒Ad-E2F-1，正向引物：5'-GTTTCATCCGGACAAAGCC-3'，反向引物：5'-CTCGAGGATATCATCGAG-3'；②陰性對(duì)照組。以CMV啟動(dòng)子調(diào)控下的復(fù)制缺陷性腺病毒Ad-EGFP作為對(duì)照，正向引物：5'-AGCTGGACG GCGACGTAAAC-3'，反向引物：5'-CACGAACTCCAG CAGGACATG-3'；③空白對(duì)照組。不做任何處理。將多藥耐藥細(xì)胞株H69AR細(xì)胞分為3組：①E2F-1干擾組，轉(zhuǎn)染E2F-1-siRNA正向引物：5'-TTTGCTCTT AAGGGAGATCTGAA-3'，反向引物：5'-ACUAUGGU GGCAGAGUCAGdTdT-3'；②陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組正向引物：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUT T-3'，反向引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；③空白對(duì)照組，不做任何處理。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)腫瘤及其癌旁組織和不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中E2F-1基因表達(dá) 取腫瘤及其癌旁組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用Trizol總RNA提取試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行提取，利用分光光度計(jì)對(duì)總RNA純度進(jìn)行檢測(cè)，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得模板單鏈cDNA，以cDNA為模板用PCR試劑盒進(jìn)行PCR。E2F-1正向引物：5'-CCCAACTCCCTCTACCCT-3'，反向引物：5'-CTCCCATCTCATATCCATCCTG-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向引物：GGGAGCCAAAG GGTCAT-3'，反向引物：5’-GAGTCCTTCCACGATAC CAA-3'。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性60 s，92℃變性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸30 s，共36次循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法獲得腫瘤及其癌旁組織和不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中E2F-1基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的藥物敏感性 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24h細(xì)胞，接種于96孔板中，分別將化療藥物阿霉素、順鉑及依托泊苷加入到培養(yǎng)基中，進(jìn)行稀釋，使阿霉素濃度分別為12.5、25.0、75.0和100.0 μg/ml，順鉑分別為50、100、200、300和400 μg/ml，依托泊苷分別為100、200、400、600和800 μg/ml，分別加入到不同孔中，并設(shè)置對(duì)照孔，每個(gè)樣品均設(shè)置5個(gè)反應(yīng)復(fù)孔。將CCK-8加入各孔，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，利用酶標(biāo)檢測(cè)儀對(duì)各孔450 nm處吸光度（A值）進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各組細(xì)胞存活率=（不同藥物濃度A值均值—空白孔A值均值）/不含藥物陽(yáng)性對(duì)照組A值均值，根據(jù)不同藥物濃度下的細(xì)胞存活率，繪制對(duì)數(shù)曲線，獲得細(xì)胞生存率為50%時(shí)的藥物濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.4 隨訪方法 所有SCLC患者進(jìn)行隨訪，方式包括電話及門診復(fù)查；內(nèi)容包括一般檢查、臨床癥狀及影像學(xué)檢查。隨訪截止日期2016年3月31日，隨訪時(shí)間5～120個(gè)月，其中，66例患者死亡，26例患者生存，未出現(xiàn)失訪病例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，利用Kaplan-Meier法對(duì)SCLC組織中E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)患者生存時(shí)間的影響進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E2F-1基因在SCLC組織及其癌旁組織中的表達(dá)

SCLC組織中E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.95±0.10），高于癌旁組織中的（0.53±0.08），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=40.829，P=0.000）。

2.2 SCLC組織中E2F-1 mRNA與臨床病理特征的關(guān)系

SCLC組織中E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與年齡和性別比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與臨床分期和化療敏感性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見附表。

2.3 SCLC組織中E2F-1 mRNA對(duì)患者預(yù)后的影響

以SCLC組織中E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的P25值為界值，將患者分為低表達(dá)組（23例）和高表達(dá)（69例），Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達(dá)組患者中位生存時(shí)間53.0個(gè)月，高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間22.0個(gè)月；Log-Rank檢驗(yàn)顯示，兩組患者生存時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.517，P= 0.001）。見圖1。

附表 臨床病理特征與SCLC組織中E2F-1 mRNA的關(guān)系

圖1 SCLC組織中E2F-1 mRNA對(duì)患者生存時(shí)間的影響

2.4 E2F-1基因在不同轉(zhuǎn)染組H69和H69AR細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，H69細(xì)胞中，E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在E2F-1過表達(dá)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.824，P=0.000），E2F-1過表達(dá)組高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；H69AR細(xì)胞中，E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在E2F-1干擾組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=38.672，P= 0.000），E2F-1干擾組低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。見圖2、3。

2.5 上調(diào)H69細(xì)胞中E2F-1基因表達(dá)對(duì)化療藥物敏感性的影響

H69細(xì)胞對(duì)阿霉素IC50值在E2F-1過表達(dá)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.964，P=0.000），E2F-1過表達(dá)組高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；H69細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值在E2F-1過表達(dá)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.752，P=0.000），E2F-1過表達(dá)組高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；H69細(xì)胞對(duì)依托泊苷的IC50值在E2F-1過表達(dá)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.281，P=0.000），E2F-1過表達(dá)組高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。見圖4。

2.6 抑制H69AR細(xì)胞中E2F-1基因表達(dá)對(duì)化療藥物敏感性的影響

H69AR細(xì)胞對(duì)阿霉素IC50值在E2F-1過表達(dá)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.753，P=0.000），E2F-1過表達(dá)組低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；H69AR細(xì)胞對(duì)順鉑IC50值在E2F-1過表達(dá)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=80.681，P= 0.000），E2F-1過表達(dá)組低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；H69AR細(xì)胞對(duì)依托泊苷IC50值在E2F-1過表達(dá)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=64.375，P=0.000），E2F-1過表達(dá)組低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。見圖5。

圖2 E2F-1基因在不同轉(zhuǎn)染組H69細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 E2F-1基因在不同轉(zhuǎn)染組H69AR細(xì)胞中的表達(dá)

圖4 上調(diào)H69細(xì)胞中E2F-1基因表達(dá)對(duì)化療藥物敏感性的影響

圖5 抑制H69AR細(xì)胞中E2F-1基因表達(dá)對(duì)化療藥物敏感性的影響

3 討論

SCLC作為常見的肺部惡性腫瘤類型，對(duì)化療敏感，初治緩解率較高，但極易出現(xiàn)多藥耐藥而影響治療效果[6]，目前，發(fā)生化療耐藥的具體機(jī)制尚不清楚，積極尋找導(dǎo)致化療耐藥的特異性分子指標(biāo)，已成為臨床研究重點(diǎn)。有研究指出，惡性腫瘤發(fā)生多藥耐藥與細(xì)胞周期調(diào)控紊亂有關(guān)[7]。E2F-1作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[8]，其異常高表達(dá)與食管癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]、膀胱癌等[11]多種惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程有關(guān)，且影響患者預(yù)后。本研究顯示，SCLC組織中E2F-1mRNA相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，說明E2F-1高表達(dá)可能參與SCLC發(fā)生過程。與臨床病理特征指標(biāo)相關(guān)性分析顯示，SCLC組織中E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與臨床分期和化療敏感性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在局限期、化療敏感的患者組織中呈低表達(dá)，提示E2F-1可能參與SCLC病程進(jìn)展及化療耐藥過程。所有患者接受相同的化療治療方案，Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達(dá)組患者中位生存時(shí)間53.0個(gè)月，高于高表達(dá)組患者，說明E2F-1高表達(dá)可影響患者預(yù)后，提示E2F-1可能通過參與SCLC患者多藥耐藥而影響患者預(yù)后。

為進(jìn)一步探討E2F-1對(duì)SCLC多藥耐藥的影響，本研究分別上調(diào)人SCLC敏感細(xì)胞株H69細(xì)胞中E2F-1表達(dá)，以及抑制多藥耐藥細(xì)胞株H69AR細(xì)胞中E2F-1表達(dá)，結(jié)果顯示，E2F-1過表達(dá)組H69細(xì)胞對(duì)阿霉素、順鉑及依托泊苷的IC50值均高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，說明上調(diào)H69細(xì)胞中E2F-1表達(dá)，可抑制H69細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，而E2F-1干擾組H69AR細(xì)胞對(duì)阿霉素、順鉑及依托泊苷的IC50值均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，說明下調(diào)H69AR細(xì)胞中E2F-1表達(dá)，可增強(qiáng)H69AR細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提示E2F-1與SCLC化療多藥耐藥發(fā)生密切相關(guān)。有研究通過沉默人胃癌耐藥裸鼠皮下瘤中E2F-1基因發(fā)現(xiàn)，E2F-1可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路而降低腫瘤細(xì)胞耐藥性，加速細(xì)胞凋亡[12]。亦有研究指出，抑制E2F-1可抑制耐吉西他濱人胰腺癌細(xì)胞中核糖核苷酸還原酶M2的表達(dá)而增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性[13]。至于E2F-1調(diào)控SCLC多藥耐藥的具體機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，E2F-1在SCLC組織中呈高表達(dá)，與患者對(duì)化療敏感性及預(yù)后有關(guān)，下調(diào)E2F-1可增強(qiáng)多藥耐藥細(xì)胞株H69AR對(duì)化療藥物的敏感性。

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（童穎丹 編輯）

Correlation of E2F-1 with multidrug resistance and prognosis of small cell lung cancer*

Yuan-wu Jin1,Yuan Zhao1,Xiang-jiao Meng2
(1.Department of Cancer Hematology,Central Hospital of Shandong Zibo Mining Group Co.Ltd,Zibo,Shandong 255120,China;2.Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan,Shandong 250062,China)

ObjectiveTo investigate the effect of E2F-1 on multidrug resistance in small cell lung cancer (SCLC)and its relationship with the prognosis.MethodsThe expression of E2F-1 in the cancerous tissues of 92 patients with SCLC was detected.The effect of the expression ofE2F1mRNA on survival time was analyzed.The human SCLC sensitive cell line H69 and multidrug resistant cell line H69AR were cultured. The cells were divided into E2F-1 overexpression group,negative control group and blank control group, respectively.The drug sensitivity of the cells in different transfected groups were detected.ResultsThe relative expression level ofE2F1mRNA in the SCLC tissues was higher than that in the adjacent tissues (P< 0.05).The median survival time in the low-expression group was longer than that in the high-expression group (P<0.05).The IC50 values of Doxorubicin,Cisplatin and Etoposide for H69 cells in the E2F-1 overexpression group were higher than those in the negative control group and the blank control group (P< 0.05).The IC50 values of Doxorubicin,Cisplatin and Etoposide for H69AR cells in the E2F-1 interference group were lower than those in the negative control group and the blank controlgroup (P<0.05).ConclusionsE2F-1 is highly expressed in SCLC tissues.Reduced expression of E2F-1 could enhance the sensitivity of multidrug resistant cell line H69AR to chemotherapy.

small cell lung cancer;E2F-1;RNA interference;multidrug resistance

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.011

1005-8982（2017）09-0054-05

2016-09-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81301868）