欒淑華劉 君*

（1 沈陽市化工學(xué)校，遼寧 沈陽 110122；2 遼寧省中醫(yī)藥研究院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110034）

中藥寬體金錢蛭抗凝血有效部位的提取工藝研究

欒淑華1劉 君2*

（1 沈陽市化工學(xué)校，遼寧 沈陽 110122；2 遼寧省中醫(yī)藥研究院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110034）

目的 研究中藥寬體金錢蛭抗凝血有效部位的提取工藝。方法 分別采用不同濃度的乙醇、正己烷、正丁醇、生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液、不同濃度乙醇等溶劑提取寬體金錢蛭，以家兔全血凝固的時間為指標(biāo)，比較了幾種提取液對凝血時間的影響；采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝。結(jié)果 幾種提取液中，生理鹽水的抗凝時間最長；正交試驗(yàn)結(jié)果表明，提取次數(shù)為顯著性影響因素。結(jié)論 根據(jù)實(shí)際情況，將寬體金錢蛭的提取工藝確定為加生理鹽水提取2次，第1次加5倍量，提取2 h，第2次加3倍量，提取2 h。

水蛭；寬體金錢蛭；提取工藝；抗凝血；有效部位

寬體金錢蛭Whhmania pigra Whitman，又稱螞蟥，為中藥水蛭的藥用品種之一。中國藥典項(xiàng)下水蛭有三個品種，分別為水蛭科動物寬體金錢蛭（螞蟥）Whhmania pigra Whitman、水蛭（日本醫(yī)蛭）Hirudo nipponica Whitman、柳葉螞蟥（尖細(xì)金錢蛭）Whhmania acranulata Whitman的干燥全體。具有破血痛經(jīng)，逐瘀消癥之功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，水蛭中主要含有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等成分，具有抗凝血、抗血栓、抗腫瘤等作用[2]。水蛭Hirudo nipponica Whitman中主要的抗凝血成分為水蛭素，是一種含有65個氨基酸殘基的多肽，相對分子質(zhì)量為7000左右[2]，水蛭素被認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凝血酶抑制劑，作用強(qiáng)于肝素。目前對水蛭（日本醫(yī)蛭）Hirudo nipponica Whitman這個品種的研究較多，但對寬體金錢蛭這個品種化學(xué)成分及相關(guān)的研究報導(dǎo)較少，而寬體金錢蛭為中藥水蛭藥用的主流品種，在臨床上應(yīng)用較廣[3]。另有研究指出，水蛭與寬體金錢蛭2個品種的動物的食性不同，因而受其影響，二者所含的有效成分不同。醫(yī)用水蛭類主要是靠吸吮動物的血液為生，所以水蛭素主要是存在于其口部的唾液中，但寬體金錢蛭的食性醫(yī)用水蛭類不同，不是靠吸血為生，而是以捕食水中的小動物及吸吮螺體、蚌殼的體液為生[4]，故而很多人認(rèn)為在寬體金錢蛭中不含有水蛭素，而目前也確實(shí)沒有從寬體金錢蛭中提出水蛭素的報導(dǎo)?，F(xiàn)代藥理研究表明，寬體金錢蛭也具有抗凝血、抗血栓及抗血小板聚集等作用[2]。本研究以寬體金錢蛭作為研究對象，探討其抗凝血有效部位的最佳提取工藝。

1 材 料

1.1 藥材：寬體金錢蛭新鮮藥材購于徐州，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)陳煥亮教授鑒定為寬體金錢蛭（Whitmania pigra Whitman）。

1.2 儀器與試劑：恒溫玻璃水?。〒P(yáng)州盛凱化工設(shè)備有限公司）；（牛）血清白蛋白、凝血酶試劑（由中國食品藥品檢定研究院提供）；（牛）纖維蛋白原（上海谷研實(shí)業(yè)有限公司）；pHS-25型酸度計(jì)（上海光學(xué)儀器廠）；試劑均為分析純。

1.3 動物：中國白兔，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

2 方 法

2.1 不同提取物抗凝活性比較

2.1.1 不同提取液的制備：取寬體金錢蛭干品藥材，粉碎過三號篩。取適量用5倍量正己烷溶液冷浸過夜，離心（4000轉(zhuǎn)/分），取上清液，沉淀部分再用3倍量的正己烷溶液冷浸過夜，離心（4000轉(zhuǎn)/分），取上清液，合并二次的上清液，備用（Ⅰ）。同法制備正丁醇提取液（Ⅱ）、蒸餾水提取液（Ⅲ）、0.02 moL/L（pH=6.8）的磷酸鹽緩沖液提取液（Ⅳ）和生理鹽水提取液（Ⅴ）、30%乙醇提取液 （Ⅵ）、50%乙醇提取液（Ⅶ）、75%乙醇提取液（Ⅷ）、95%的乙醇提取液（Ⅸ）。將提取液分別濃縮成1 mL相當(dāng)于含寬體金錢蛭藥材1 g。

2.1.2 不同提取液抗凝活性篩選：以家兔全血凝固時間作為考察指標(biāo)，分別考察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ提取液對凝血時間的影響。

取家兔，從頸總動脈插管采血，采用試管法，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，對照組采用生理鹽水，取試管40支，先分別加入以上的各種提取溶液及生理鹽水各0.1 mL，每組4支，再每管加入新鮮手兔血0.9 mL，立即開始計(jì)時，置（37±0.5）℃恒溫水浴中，每隔15 s傾斜1次，觀察血液是否凝固，至血液成為凍膠狀不再流動為止，記錄各管的凝固時間。經(jīng)方差分析確定的提取溶媒。

2.2 寬體金錢蛭的提取工藝考察：分別以加溶媒量、提取時間、提取次數(shù)作為考察因素，進(jìn)行三因素三水平（L934）正交試驗(yàn)。經(jīng)不同提取液抗凝活性篩選，確定生理鹽水為最佳的提取溶媒。 取寬體金錢蛭新鮮藥材，加生理鹽水（N.S.）適量，勻漿后，分成9份。按以下提取方法進(jìn)行試驗(yàn)。見表1。

表1 工藝考察因素水平表

考察指標(biāo)：①采用福林酚法（lowry法），測定每份提取液的蛋白質(zhì)含量。②按凝血酶滴定法，測定每份提取液的抗凝血酶活性。

評分標(biāo)準(zhǔn)：規(guī)定蛋白含量的滿分為40分，抗凝血酶活性的滿分為60分，所測得的蛋白質(zhì)最高含量為每克藥材含蛋白質(zhì)32.04 mg，定為40分，其他值計(jì)分方法：蛋白含量/32.04×40；抗凝血酶活性最高含量為12，定為60分，其他值計(jì)分方法：效價/12×60，二項(xiàng)指標(biāo)總和滿分為100分。

2.3 蛋白質(zhì)含量測定：采用福林酚法（lowry法）測定蛋白質(zhì)含量，溶液配制方法及試驗(yàn)方法參照中國藥典2015年版四部，通則0731，第二法，方法一。

2.4 抗凝血酶活性測定：采用凝血酶滴定法，試驗(yàn)方法參照中國藥典2015年版一部[5]。

3 結(jié) 果

3.1 不同提取液對家兔全血凝固時間的影響：結(jié)果見表2。

表2 各提取液對家兔全血凝固時間的影響（）

表2 各提取液對家兔全血凝固時間的影響（）

組別結(jié)果(s)凝血時間(d)P空白組195 182 177 165179.75±12.42Ⅰ465 378 490 415437.00±50.19**P＜0.01Ⅱ320 265 234 212257.75±46.85*P＜0.05Ⅲ455 462 420 480454.25±25.14**P＜0.01Ⅳ420 457 413 498447.00±39.10**P＜0.01Ⅴ705 764 698 744727.75±31.52**P＜0.01Ⅵ296 354 312 305316.75±25.68*P＜0.05Ⅶ387 435 322 349373.25±49.05**P＜0.01Ⅷ560 479 531 510520.00±34.17**P＜0.01Ⅸ356 412 389 365380.50±25.20**P＜0.01

各組測定結(jié)果與對照組比較，差異均顯著（P＜0.05，0.01），其中生理鹽水組（N.S.）的血液凝固時間最長，故采用生理鹽水（N.S.）作為提取溶媒。

3.2 提取工藝正交試驗(yàn)考察結(jié)果：見表3。

表3 正交試驗(yàn)及結(jié)果

3.3 對結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表4。

表4 方差分析[F（2,2）=19.0]

3.4 結(jié)論：根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，影響寬體金錢蛭鮮品提取工藝因素順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)＞加水量＞提取時間，提取次數(shù)為主要影響因素，提取時間及加水量為次要影響因素。綜合考慮，提取工藝確定為采用N.S.提取二次，第1次加5倍量，提取2 h，第2次加3倍量，提取1 h。

4 討 論

4.1 寬體金錢蛭藥材的加工方法為新鮮藥材捕捉后洗凈，用沸水湯死，曬干或低溫干燥?，F(xiàn)代有研究表明，高溫易使其中的蛋白質(zhì)及肽類成分被破壞，但中醫(yī)臨床一般是采用其干品藥材或滑石粉炮制品，依然認(rèn)為其療效甚佳，故在干品藥材及炮制品中也應(yīng)存在抗凝血的活性物質(zhì)。本試驗(yàn)以其干品藥材為研究對象，探討其抗凝血的有效部位。

4.2 水蛭的抗凝酶活性因其食性的不同而有差異，寬體金錢蛭作為非吸血類的水蛭，其抗凝血酶活性與吸血的水蛭類如日本醫(yī)蛭相比有較大的差異[6]，故采用凝血酶活力滴定法測定寬體金錢蛭的抗凝活性較低，而且可能誤差較大，所以在工藝考察過程中，采用蛋白質(zhì)含量與抗凝血酶活性雙重的考察指標(biāo)對不同工藝提取液進(jìn)行考察。

[1] 張嵐.水蛭的提取工藝研究[J].黑龍江醫(yī)藥,2014,25(1):80-81.

[2] 王蒙萌.水蛭的化學(xué)成分及藥理作用[J].黑龍江中醫(yī)藥,2008, 36(2):47-48.

[3] 瞿新燕.水蛭的抗凝血作用研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013, 19(13):1582-1583.

[4] 梁進(jìn)權(quán).水蛭抗凝抗血栓活性及其與品種、提取方法的關(guān)系[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2009,7(9):1096-1097.

[5] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015:83-84.

[6] 張彬,汪波,龔元,等.幾種水蛭抗凝血物質(zhì)提取及活性分析[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,51(4):92-96.

R282.710.5

B

1671-8194（2017）10-0037-03

遼寧省教育廳課題項(xiàng)目（2006B058）

*通訊作者