徐紅云， 陳 弟， 劉 海， 劉春林， 李 紅， 馬眾仙， 李宜錚， 楊寶瑞， 楊文波

感染性角膜炎的病原菌譜回顧性分析

徐紅云， 陳 弟， 劉 海， 劉春林， 李 紅， 馬眾仙， 李宜錚， 楊寶瑞， 楊文波

目的 分析感染性角膜炎的病原菌譜特征，提供感染性角膜炎早期診斷及治療的依據(jù)。方法 收集云南省第二人民醫(yī)院眼科 2011 年 1 月至 2015 年 12 月，確診為感染性角膜炎患者的角膜潰瘍刮片或術(shù)中切除的角膜潰瘍組織標(biāo)本資料，對普通細(xì)菌及真菌培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，評價(jià)感染病原菌譜的分布特征及危險(xiǎn)因素。結(jié)果 1 046 例（只眼）的角膜潰瘍標(biāo)本培養(yǎng)陽性率為 35.3%。分離的病原菌以真菌為主（53.1%），其次是革蘭陽性球菌（31.2%）、革蘭陰性桿菌（11.1%）及革蘭陽性桿菌（4.6%）；而真菌中以鐮刀霉屬構(gòu)成比最高，為 69.4%，其次是曲霉屬（21.9%）；革蘭陽性球菌以凝固酶陰性葡萄球菌為主（50.4%）。結(jié)論 該院感染性角膜炎以真菌性角膜炎多見，主要病原菌是絲狀真菌，以鐮刀霉屬的感染為主。

感染性角膜炎 ； 病原菌 ； 絲狀真菌 ； 分布特征

感染性角膜炎是眼科常見病、多發(fā)病，是眼病致盲的主要因素[1]。大約 1/2 的感染性角膜炎是由真菌引起的真菌性角膜炎。感染多見于戶外工作者，與植物性外傷有關(guān)[2]。發(fā)達(dá)國家病原以單純皰疹病毒最為常見，發(fā)展中國家則以細(xì)菌和真菌感染更為常見。近年來由于類固醇和軟性接觸鏡、抗菌藥物的廣泛使用，造成眼部微生態(tài)環(huán)境失衡，導(dǎo)致真菌性角膜炎較以往增多。因此實(shí)驗(yàn)室的病原學(xué)檢查仍是早期診斷和臨床藥物治療角膜炎的重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集本院 2011 年 1 月至 2015 年 12 月，臨床診斷為感染性角膜炎患者 1 046 例（病毒性角膜炎除外），患者來自云南省內(nèi)各州市及周邊省市，其中 819 例（78.3%）從事野外工作或農(nóng)業(yè)勞作。患者有眼部不適或疼痛，畏光、視力下降、流淚、眼瞼痙攣等眼部刺激癥狀；體格檢查有不同程度的角膜水腫或角膜潰瘍病灶，房水混濁，纖維素樣滲出或伴有前房積膿等體征；病史如外傷、手術(shù)或全身感染等；感染性角膜炎依據(jù)患者病史、臨床表現(xiàn)、眼科激光共聚焦顯微鏡檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果（包括角膜刮片物的直接涂片和培養(yǎng)）[3-5]等進(jìn)行診斷。

1.2 標(biāo)本采集

嚴(yán)格無菌操作，由醫(yī)師在進(jìn)行表面麻醉后，用刀片刮取潰瘍基底組織和邊緣組織，標(biāo)本均在手術(shù)時(shí)或治療時(shí)采集，標(biāo)本采集后立即送檢。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

所有標(biāo)本（角膜潰瘍物或角膜組織）均進(jìn)行常規(guī)涂片染色，用革蘭染色涂片查細(xì)菌、亞甲藍(lán)染色查真菌 ；標(biāo)本接種于法國生物梅里埃公司的 Bact/ ALRET 3D 血培養(yǎng)儀的小兒瓶（PF 瓶），置于全自動(dòng)培養(yǎng)儀培養(yǎng)，陽性者轉(zhuǎn)種于血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂及沙保弱瓊脂進(jìn)行細(xì)菌及真菌的分離培養(yǎng)，培養(yǎng) 10 d 仍陰性的標(biāo)本盲轉(zhuǎn) ；菌種鑒定采用 VITEK 2-Compact進(jìn)行。標(biāo)本采集、細(xì)菌培養(yǎng)鑒定均嚴(yán)格按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（2014 年版）進(jìn)行。

1.4 質(zhì)控菌株

大 腸 埃 希 菌 ATCC25922、 銅 綠 假 單 胞 菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌 ATCC25923 等均購置于衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué) WHONET5.6 軟件。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的檢出率

1 046 例送檢角膜潰瘍組織標(biāo)本，送檢培養(yǎng)陽性率為 35.3%（369/1 046），而涂片鏡檢真菌陽性率 為 11.9%（124/1 046）， 細(xì) 菌 涂 片 陽 性 率 8.5%（89/1 046）。 培 養(yǎng) 第 1 位 的 病 原 菌 是 真 菌， 檢 出率 為 53.1%（196/369）， 真 菌 中 以 鐮 刀 霉 屬 為 主69.4%（136/196）， 曲 霉 屬 次 之 21.9%（43/196）；第 2 位的病原菌是細(xì)菌，其中革蘭陽性球菌 31.2%（115/369）；革蘭陰性桿菌占 11.1%（41/369）；革蘭陽性桿菌為 4.6%（17/369）。見表1。

2.2 感染性角膜炎病原菌分布特征

感染的病原菌以真菌為主，鐮刀霉屬是真菌性角膜炎的主要病原真菌（69.4%），鐮刀霉屬中 主 要 為 茄 病 鐮 刀 霉 74.3%（101/136）， 串 珠 鐮刀霉次之 13.2%（18/136），其余鐮刀霉屬 12.5%（17/136）；真菌性角膜炎第 2 位的病原菌是曲霉屬（21.9%），曲霉屬中以黃曲霉為主 65.1%（28 / 43），煙曲霉次之 23.3%（10 / 43），其他曲霉 11.6%（5/ 43）。凝固酶陰性葡萄球菌為主要感染的革蘭陽性菌（50.4%），其中以表皮葡萄球菌為主（87.9%，51 / 58），鏈球菌屬中以肺炎鏈球菌為主（55.9%，19 / 34）；不發(fā)酵糖革蘭陰性桿 菌 中以銅綠假單胞菌為主（75.0%，27 / 36），見表1。

表1 369 例培養(yǎng)陽性的感染性角膜炎病原菌分布Table 1 Pathogen distribution of 369 cases of infectious keratitis

2.3 不同病因病原菌的構(gòu)成

外傷所致角膜炎培養(yǎng)陽性率（由植物所致外傷 42.0%、其他 外 傷 35.4%）稍高于其他病因所致的角膜炎，且外傷性角膜炎真菌的檢出率居多，而其他病因以細(xì)菌的檢出為主，見表2。

3 討論

感染性角膜炎至今仍是世界性的常見致盲眼病，其主要的病原菌為細(xì)菌、真菌及病毒等，我國細(xì)菌性角膜炎是感染性角膜炎最常見的角膜病[1]， 但 是 近年 來， 隨 著 廣 譜 抗 菌 藥 物、 激 素 及免疫抑制劑的廣泛使用，眼科新的技術(shù)或治療手段的發(fā)展，如長期佩戴角膜接觸鏡、眼科手術(shù)的增加等，使得引起感染性角膜病病原菌譜的構(gòu)成發(fā)生了較大變化，真菌性角膜炎正以其逐年增高的發(fā)病率日益成為發(fā)展中國家最主要的致盲性眼病[6]， 北 京 同 仁 醫(yī) 院 調(diào) 查 角 膜 潰 瘍 患 者 中 真 菌 檢出率由 20 世紀(jì) 80 年代的 27.3% 增加至 90 年代的34.8%[7]；山東省眼科研究所統(tǒng)計(jì) 1999－2004 年 6年間真菌性角膜炎所占比例為 61.9%[8]。本院收治的感染性角膜炎患者以外傷，特別是植物外傷居多，感染的病原菌以真菌為多見（53.1%），其主要菌種是鐮刀霉屬為主（69.4%），其次是曲霉屬（21.9%）；細(xì)菌感染占第 2 位，以凝固酶陰性葡萄球菌為主占 50.4%。11.1% 和 4.6% 的感染是由革蘭陰性桿菌和革蘭陽性桿菌引起。由于地理環(huán)境、生活條件、致病菌的生物學(xué)特性等差異，不同地區(qū)其致病菌的構(gòu)成也不同，其菌種因不同地域而分 布 不 一， 據(jù) 文 獻(xiàn) 資 料[7-10]， 發(fā) 達(dá) 國 家 及 氣 候 寒冷地區(qū)（如美國北部及英國）念珠菌屬為最主要病原菌，鐮刀霉屬和曲霉屬為世界范圍內(nèi)常見的病原菌。云南省地屬熱帶亞熱帶地區(qū)，四季如春，降雨充沛，適合真菌的生長，本院的調(diào)查數(shù)據(jù)中真菌性角膜炎病原菌譜與國內(nèi)文獻(xiàn)結(jié)果一致，以鐮刀霉屬和曲霉屬為主，而值得關(guān)注的是少見真菌的檢出，賽多孢子霉屬檢出 5 株（2.6%），4 株尖端賽多孢子霉，1株是多育賽多孢子霉；暗色孢科真菌中的鏈隔孢霉檢出 3 株（1.5%），同時(shí)日常生活環(huán)境中的枯草芽胞桿菌（6/17）及蠟樣芽胞桿菌（4/17）也有檢出，臨床和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)高度重視病原菌菌種的不同。

表2 不同病因感染性角膜炎的病原菌構(gòu)成Table 2 Microbiological etiology of infectious keratitis in terms of predisposing factor [% ( n/n ) ]

感染性角膜炎早期、及時(shí)和規(guī)范的診斷和治療，是保住患者眼球、降低致盲率的主要措施。鐮刀霉及曲霉廣泛分布于自然界土壤、植物碎片中，甚至存在于沙漠及北極地區(qū)。外傷是造成真菌性角膜炎的主要原因，特別是農(nóng)業(yè)性植物角膜外傷及角膜異物。感染性角膜炎患者中，外傷患者真菌的檢出率較高（植物外傷中檢出率為 59.4%和其他外傷中檢出率為 53.1%），真菌經(jīng)過破損角膜侵入后，可在角膜組織內(nèi)生長繁殖，通過產(chǎn)生蛋白溶解酶、真菌可溶性抗原及毒素等作用，促進(jìn)菌絲在角膜中擴(kuò)散，由于角膜產(chǎn)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致組織壞死、潰瘍形成，嚴(yán)重的可導(dǎo)致視力喪失甚至需要眼球摘除[9]，由于真菌性角膜炎發(fā)病相對緩慢，早期僅有刺痛、怕光或異物感等眼部刺激征，患者自覺癥狀輕微，特別是農(nóng)村及邊遠(yuǎn)地區(qū)，缺乏基本醫(yī)療條件的患者往往容易忽視，所以早期及時(shí)診斷和規(guī)范治療對預(yù)后至關(guān)重要。此外凝固酶陰性葡萄球菌感染不容忽視，正常情況下凝固酶陰性葡萄球菌是人體皮膚黏膜正常菌群之一，但在細(xì)菌感染性眼病特別是兒童眼病中占重要位置。而枯草芽胞桿菌及蠟樣芽胞桿菌大量存在于日常生活的環(huán)境中，通常不致病，甚至在正常人的結(jié)膜囊也會(huì)檢出，但眼角膜外傷特別是異物外傷，細(xì)菌進(jìn)入玻璃體內(nèi)大量生長繁殖，其外毒素對眼球具有穿透性損傷或血源性擴(kuò)散，造成嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，嚴(yán)重的導(dǎo)致暴發(fā)性眼內(nèi)炎， 全眼炎[11]，是外傷性致盲的 主要病原菌，應(yīng)該引起臨床及實(shí)驗(yàn)室的高度關(guān)注。

實(shí)驗(yàn)室的檢查對早期診斷尤為重要，采集患者角膜潰瘍物，直接涂片染色鏡檢，快速而且價(jià)格便宜，可及時(shí)提供臨床結(jié)果；但由于涂片本身的局限性及操作人員的專業(yè)素養(yǎng)，陰性結(jié)果不能排除真菌感染。本院的涂片陽性率僅為 11.9%，而結(jié)合真菌的培養(yǎng)，對真菌性角膜炎具有重要的診斷價(jià)值。病灶組織或刮片培養(yǎng)是目前明確感染病原菌較好的標(biāo)本。由于眼科可供抗真菌的藥物選擇少，如實(shí)驗(yàn)室提供臨床醫(yī)師感染的病原菌及體外藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果，據(jù)藥敏結(jié)果選擇敏感抗菌藥物，可精準(zhǔn)治療減少嚴(yán)重后遺癥。

獲得準(zhǔn)確角膜炎感染的病原菌，應(yīng)高度重視標(biāo)本質(zhì)量，眼科醫(yī)師的取材對培養(yǎng)的陽性率至關(guān)重要，同時(shí)培養(yǎng)基的選擇也是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，本院微生物實(shí)驗(yàn)室與臨床醫(yī)師保持密切聯(lián)系，醫(yī)師所采集的樣本均嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)室規(guī)范進(jìn)行，標(biāo)本經(jīng)處理后接種到血培養(yǎng)瓶中，置于血培養(yǎng)儀培養(yǎng)不少于 10 d，儀器報(bào)陽后轉(zhuǎn)種于血瓊脂、麥康凱和真菌培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，規(guī)范的操作可以提高培養(yǎng)的陽性率。同時(shí)臨床微生物室應(yīng)加強(qiáng)人員的業(yè)務(wù)培養(yǎng)，特別是對少見真菌的識(shí)別和鑒定，分子生物學(xué)的方法對于少見真菌的鑒定也十分必要。

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A retrospective analysis of the pathogens associated with infectious keratitis

XU Hongyun, CHEN Di, LIU Hai, LIU Chunlin, LI Hong, MA Zhongxian, LI Yizheng, YANG Baorui, YANG Wenbo.
（Department of Laboratory Medicine, the Second Hospital of Yunnan Province, Kunming 650021, China）

Objective To study the pathogens associated with infectious keratitis for early diagnosis and treatment. Methods This study was conducted with the patients with conf i rmed diagnosis of infectious keratitis in our hospital during the period from January 2011 through December 2015. The specimens from corneal ulcer were subject to bacterial and fungal culture. The pathogens and associated risk factors of infectious keratitis were analyzed retrospectively. Results Of the 1 046 corneal specimens, 369 (35.3%) were positive for microorganisms. The most frequently isolated microorganism was fungal species (53.1%), followed by grampositive cocci (31.2%), gram-negative bacilli (11.1%), and gram-positive bacilli (4.6%). Of the fungal strains, most were Fusarium (69.4%), followed by Aspergillus species (21.9%). Coagulase negative Staphylococcus accounted for more than half (50.4%) of the gram positive cocci. Conclusions Infectious keratitis is primarily associated with fungal infection, especially fi lamentous fungus such as Fusarium.

infectious keratitis; pathogen; fi lamentous fungus; distribution

R772.21

：A

：1009-7708 ( 2017 ) 03-0260-04

10.16718/j.1009-7708.2017.03.007

2016-08-22

2016-10-13

云南省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650021。

徐紅云（1964—），女，學(xué)士，主任技師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)及耐藥研究。

徐紅云，E-mail: 1391939043@qq.com。