李 翔 ，范志強(qiáng)，王建剛，田首元，金弋喬，楊 春，段 俊

· 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

血紅素氧合酶-1在七氟醚后處理心肌缺血再灌注損傷保護(hù)中的作用

李 翔1，范志強(qiáng)2，王建剛3，田首元3，金弋喬1，楊 春1，段 俊2

目的 研究七氟醚后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，探討血紅素氧合酶-1(HO-1)的發(fā)揮作用。方法 健康雄性SD大鼠30只，體重230 g ～260 g，采用隨機(jī)數(shù)字標(biāo)示法分為5組，每組6只。假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)、七氟醚后處理組(SP組)、七氟醚后處理加用鋅原卟啉(ZnPP)組(SP+Zn組)、鋅原卟啉組(Zn組)。S組絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)不結(jié)扎，I/R組、SP組、SP+Zn組、Zn組結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線并再灌注120 min。I/R組、Zn組再灌注前3 min分別單次股靜脈注射生理鹽水1 mL，Znpp(5 μg/kg)稀釋液1 mL并吸入純氧3 min；SP組、SP+Zn組再灌注前3 min分別單次注射生理鹽水1 mL，ZnPP(5 μg/Kg)稀釋液1 mL并吸入2%七氟醚3 min。再灌注滿120 min后，①取抽取動(dòng)脈血用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)血清肌鈣蛋白(cTn-I)含量。②取心尖缺血組織測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。③用蛋白印跡法(Western-blot)測(cè)心尖缺血組織中HO-1含量。結(jié)果 與S組相比，其余各組cTn-I、HO-1、MDA含量均明顯升高，SOD活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與I/R組比較，SP組cTn-I、MDA含量明顯下降，HO-1含量、SOD活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I/R組、SP+Zn組、Zn組兩兩比較cTn-I、HO-1、MDA含量和SOD活性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 HO-1在七氟醚后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

心肌缺血再灌注損傷；七氟醚；缺血后處理；血紅素氧合酶-1

心肌缺血再灌注損傷(myocardium ischemic reperfusion injury，MIRI)防治的研究一直是醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)。七氟醚是新型吸入麻醉藥，具有誘導(dǎo)迅速及蘇醒快而完全，血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，廣泛用于臨床麻醉。已證實(shí)，七氟醚對(duì)MIRI預(yù)處理和后處理均對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[1-4]。而七氟醚后處理因?yàn)椴僮鞲影踩?、?jiǎn)便，避免了缺血后處理要求短暫反復(fù)缺血-再灌注的潛在風(fēng)險(xiǎn)和醫(yī)學(xué)倫理道德的限制，更具有可行性，也更適合臨床應(yīng)用[5]。

人類細(xì)胞經(jīng)過(guò)進(jìn)化，具有多種抗氧化應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制，其中血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)就是重要的保護(hù)機(jī)制之一，HO-1能將前氧化物血紅素降解為一氧化碳(CO)、膽綠素(會(huì)進(jìn)一步被降解為膽紅素)和二價(jià)鐵[6]。通過(guò)降解前氧化物血紅素而產(chǎn)生抗氧化物膽紅素，HO-1 可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。但七氟醚后處理對(duì)心肌的保護(hù)是否通過(guò)HO-1的表達(dá)發(fā)揮作用，目前研究尚罕見，值得進(jìn)一步探討。故本課題擬通過(guò)建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討七氟醚后處理是否能通過(guò)影響心肌細(xì)胞HO-1表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 健康雄性SD大鼠30只，體重230 g～260 g，許可證編號(hào)[SCXK-20140013]，采用隨機(jī)數(shù)字標(biāo)示法分為5組，每組6只。假手術(shù)組(S組)、心肌缺血再灌注損傷組(I/R組)、七氟醚后處理組(SP組)、七氟醚后處理+ZnPP組(SP+Zn組)及ZnPP組(Zn組)。

1.2 動(dòng)物造模 實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，腹腔注射20%烏拉坦5 mL/kg麻醉下，仰臥位固定于恒溫動(dòng)物解剖臺(tái)上，針狀電極插入左前肢、右前肢和右后肢皮下，連續(xù)監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切開，氣管插管后連接動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，潮氣量(2～4) mL/kg，通氣頻率(70～80)次/min，吸呼比維持在1∶3。左側(cè)第4肋間開胸，剪開心包，暴露心臟，于左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)起始部下2 mm處放置6/0絲線備用。穩(wěn)定10 min，待心臟恢復(fù)規(guī)律性跳動(dòng)時(shí)，結(jié)扎LAD，以心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高0.1 mV或T波高聳，心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功的標(biāo)志。結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線，再灌注120 min，以缺血區(qū)心肌變紅，抬高的ST段或T波回落為再灌注成功的標(biāo)志。S組：絲線穿過(guò)LAD但不結(jié)扎；I/R組：結(jié)扎LAD30 min，再灌注120 min，在再灌注前3 min單次注射生理鹽水1 mL，吸入純氧3 min。SP組：在再灌注前3 min單次注射生理鹽水1 mL，吸入2%七氟醚3 min，余同I/R組；SP+Zn組：操作同七氟醚后處理組，但在給予七氟醚前，靜脈注射 HO-1 抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)(5 μg/kg)稀釋液1 mL；Zn組：在缺血心肌再灌注前3 min靜脈注射ZnPP(5 μg/kg)稀釋液1 mL，吸入純氧3 min。實(shí)驗(yàn)期間，鹽水紗布覆蓋切口，保證大鼠肛溫保持在(36.5～37.5)℃。

1.3 血漿肌鈣蛋白(cTn-I)的測(cè)定 再灌注120 min 時(shí)，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2 mL于真空促凝管，靜置10 min后4 000 r/min離心10 min，取上層清液，用大鼠cTn-I酶聯(lián)免疫吸試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(BioSwamp)檢測(cè)。

1.4 心肌組織HO-1的表達(dá) 切取約300 mg的心尖缺血心肌置于-80 ℃冰箱保存。將心肌組織稱質(zhì)量、剪碎、加裂解液(1∶10)，14 000 r/min離心5 min后取上層清液用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果加入蛋白樣品和上樣緩沖液，用電轉(zhuǎn)儀將凝膠上分離到的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%BCA封閉2 h，用兔抗鼠HO-1抗體(稀釋度1∶25 000，ABCAM公司)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(稀釋度1∶550，武漢博士德生物工程有限公司)4 ℃孵育過(guò)夜，次日用過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋度1∶3 500，武漢博士德生物工程有限公司)孵育2 h，洗膜后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值和GAPDH條帶灰度值的比值反映HO-1的表達(dá)。

1.5 心肌組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量測(cè)定 再灌注120 min后，處死大鼠，取結(jié)扎點(diǎn)以下缺血區(qū)心肌組織，加預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液制成10%組織勻漿。黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD含量；硫代巴比妥酸顯色測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA含量。

2 結(jié) 果

2.1 血清 cTn-I含量的比較 與S組比較，其余各組血清cTn-I含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與I/R 組比較，SP 組 cTn-I 含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I/R組、SP+Zn組及Zn組組間cTn-I含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 心肌組織HO-1蛋白的比較 各組心肌HO-1的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與S組比較，其余各組心肌HO-1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與I/R 組比較，SP組心肌HO-1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；I/R組、SP+Zn組及Zn組間HO-1表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.3 心肌組織SOD活性、MDA含量比較 與S組比較，其余各組心肌組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與I/R組比較，SP組心肌組織SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I/R組與SP+Zn組、Zn組比較，心肌組織SOD活性和MDA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌組織cTn-I、HO-1、MDA含量和SOD活性比較(±s)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7]確定了七氟醚的給藥濃度、方式，建立模型穩(wěn)定。在對(duì)結(jié)果的分析當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，相比較于I/R組，SP組的SOD活性明顯升高，MDA含量明顯下降，cTn-I含量也明顯降低。提示經(jīng)過(guò)七氟醚后處理的心肌缺血大鼠在再灌注后心肌損傷程度有明顯減輕。在對(duì)七氟醚后處理的MIRI保護(hù)機(jī)制的研究中，被最早觀察到的是絲裂原活化激酶p42和p44的激活和NO的生成[8]，之后磷脂酞肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3k-AKT)[9]、鈉巴霉素的哺乳動(dòng)物靶子/70KD核糖體蛋白s6激酶和一氧化氮合成酶也被發(fā)現(xiàn)起到了一定作用[10-11]。MIRI損傷程度可通過(guò)心肌組織氧化損傷程度反映，而SOD活性和MDA含量的檢測(cè)能夠有效反映組織氧化損傷程度[12]。SOD是一種源于有機(jī)體、能夠清除氧自由基的特異性酶，也是在生物體內(nèi)清除氧自由基的首要物質(zhì)。因此SOD活性可直接反映機(jī)體對(duì)氧自由基的清除和抗氧化能力。MDA是細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸受到氧自由基攻擊后的標(biāo)志物，其含量變化也可反映機(jī)體組織過(guò)氧化損傷程度。

本次實(shí)驗(yàn)在建造模型時(shí)還引入HO-1抑制劑ZnPP，在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)加入ZnPP的SP+Zn組和Zn組的血清cTn-I含量、組織MDA含量都較SP組升高，SOD活性有明顯下降，與I/R組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外在通過(guò)對(duì)HO-1蛋白含量的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，SP+Zn及Zn兩組的HO-1蛋白含量也比SP組明顯降低，與I/R組差別不大。提示了七氟醚對(duì)MIRI后處理的保護(hù)機(jī)制主要是通過(guò)誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)來(lái)完成的。血紅素氧合酶(HO)在機(jī)體內(nèi)有三種同工酶：HO-1、HO-2、HO-3。其中HO-1是可誘導(dǎo)型，是一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物，也是熱休克蛋白家族中的一個(gè)成員，又稱HSP-32。前文已述，HO-1可通過(guò)將血紅素降解為膽綠素、二價(jià)鐵離子和CO發(fā)揮對(duì)組織的抗氧化損傷作用。其中，膽綠素可進(jìn)一步還原為膽紅素，二者可以發(fā)揮清除氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物酶的作用[13]。二價(jià)鐵離子則可以通過(guò)調(diào)節(jié)鐵蛋白的方式達(dá)到清除氧自由基的目的[14]。雖然NO、一氧化氮合成酶均可對(duì)MIRI有保護(hù)作用，但是NO的保護(hù)作用卻是兩面性的，NO在低濃度時(shí)有擴(kuò)張冠脈、降低再灌注中性粒細(xì)胞激活的作用，而高濃度的NO卻對(duì)心肌組織有負(fù)性肌力作用，并可與氧迅速反應(yīng)生成大量氧自由基加重?fù)p傷[15]。而HO-1催化生成的CO具有反饋性抑制NO大量合成的作用，從而減輕組織的損傷[14]。

綜上所述，七氟醚后處理作為一種更安全、簡(jiǎn)便且更貼近臨床的方式，對(duì)MIRI有明顯保護(hù)作用，并且通過(guò)HO-1的表達(dá)發(fā)揮作用。但HO-1的表達(dá)升高是被七氟醚通過(guò)什么機(jī)制所誘導(dǎo)還有待進(jìn)一步研究。

[1] 廖錦華，李建玲，嚴(yán)彥念，等.七氟醚預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌活性氧產(chǎn)生的影響及其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制[J].中國(guó)病理生理雜志，2011， 27(8)：1476-1484.

[2] 張英立，呂國(guó)義.七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注時(shí)縫隙連接蛋白43的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2012(32)：239-242.

[3] 張靜，王琛，胡素梅，等.七氟醚后處理對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞脹亡和凋亡的影響：與ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系[J].中華麻醉學(xué)雜志， 2014，34(1)：98-101.

[4] Xie H， Zhang J， Zhu J， et al. Sevoflurane post-conditioning protects isolated rat hearts against ischemia-reperfusion injury via activation of the ERK1/2 pathway[J].Acta Pharmacol Sin， 2014， 35(12)： 1504-1513.

[5] 張靜，余鵬，周志東，等.七氟醚后處理對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注時(shí)AKT/GSK3β/mTOR表達(dá)的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2015(12)：1215-1220.

[6] 童光.HO-1介導(dǎo)心肌細(xì)胞κ-阿片受體激活的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2013.

[7] 陳洪濤，李寶金，雷春亮，等.不同濃度七氟醚后處理對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2012(12)：1216-1219.

[8] 王劍輝.七氟醚后處理對(duì)缺血再灌注心肌保護(hù)作用的臨床研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2010.

[9] Zhao ZQ， Corvera JS， Halkos ME， et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285：H579-588.

[10] Tsang A， Hauenloy DJ， Mocanu MM， et al. Postconditioning： a form of “modified reperfusion” protects myocardium by activating the PI3K-Akt pathway[J].Circ Res，2004，95：230-232.

[11] Bopassa JC， Ferrera R， Gateau-Roesch O，et al.PI3-kinase regulates the mitochondrial transition pore in controlled reperfusion and postconditioning[J].Cardiovasc Res， 2006， 69：178-185.

[12] 劉悅，劉雅，張瑾，等.七氟烷后處理聯(lián)合七氟烷預(yù)處理對(duì)急性心肌缺血再灌注大鼠血漿SOD及MDA的影響[J].河北醫(yī)藥，2011，33(3)：329-331.

[13] Ryter SW，Morse D，Choi AM.Carbon monoxide and bilirubin：potential therapies for pulmonary/vascular injury and disease[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2007，36(2)：175-182.

[14] Dal-Secco D，F(xiàn)reitas A，Abreu MA，et al.Reduction of ICAM-1 expression by carbon monoxide via soluble guanylate cyclase activation accounts for modulation of neutrophil migration[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2010，381(6)：483-493.

[15] 孫瑩.一氧化氮在七氟醚后處理減輕大鼠離體心臟缺血再灌注自噬和凋亡中的作用[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2015.

(本文編輯王雅潔)

山西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.2014011040-9)

1.山西醫(yī)科大學(xué)(太原 030001)；2.山西博愛醫(yī)院；3.山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院

通訊單位：范志強(qiáng)， E-mail：fankm@163.com

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.09.009

1672-1349(2017)09-1048-03

2017-02-21)

引用信息：李翔 ，范志強(qiáng)，王建剛,等.血紅素氧合酶-1在七氟醚后處理心肌缺血再灌注損傷保護(hù)中的作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(9)：1048-1050.