付昌盛 劉榮森 羅蕓 歐龍 李穎超 張賢華 王珺 杜巖

內(nèi)毒素對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖及IL-8分泌的影響

付昌盛 劉榮森 羅蕓 歐龍 李穎超 張賢華 王珺 杜巖

目的：觀察不同濃度的內(nèi)毒素(lipopolysaccharides，LPS)對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響及IL-8的分泌情況。方法：本實(shí)驗(yàn)共分為七組，牙周膜成纖維細(xì)胞(hum an periodon tal ligam ent fibroblasts，hPDLFs)組、PDLFs+10μg/m l堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic Fibroblast Grow th Factor，BFGF)組、1μg/m l LPS組、10μg/m l LPS組、100μg/m l LPS組、200μg/m l LPS組、500μg/m l LPS組。各組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，MTT法觀察細(xì)胞增殖變化。取培養(yǎng)24h，96h的細(xì)胞上清液進(jìn)行IL-8 ELISA 檢測(cè)。結(jié)果：與空白組牙周膜成纖維細(xì)胞相比，24h：1μg/m l LPS、10μg/m l LPS、100μg/m l LPS組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。200μg/m l LPS、500μg/m l LPS組促進(jìn)IL-8分泌，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。96h：與牙周膜成纖維細(xì)胞相比，1μg/m l LPS、10μg/m l LPS組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。100μg/m l LPS、200μg/m l LPS組促進(jìn)IL-8分泌，100μg/m l LPS、200μg/m l LPS組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。500μg/m l LPS組抑制IL-8分泌，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞增殖變化：BFGF促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖。1μg/m l LPS、100μg/m l LPS組與正常牙周膜成纖維生長(zhǎng)增殖無(wú)差異。10μg/m l LPS可以促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖。200μg/m l LPS、500μg/m l LPS明顯抑制PDLFs增殖。結(jié)論：不同濃度的內(nèi)毒素對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖、IL-8分泌合成釋放有調(diào)節(jié)作用。

內(nèi)毒素；牙周膜成纖維細(xì)胞；IL-8

牙周膜成纖維細(xì)胞(hum an periodon tal ligam ent fibrob lasts，hPDLFs)，作為牙周膜中最主要的細(xì)胞成分之一，在牙周病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用[1]。在牙周炎各階段，它既有修復(fù)作用，又可以影響生成分泌各類炎癥因子[1]，是研究牙周炎發(fā)病機(jī)制的重要細(xì)胞之一。白介素-8(IL-8)在牙周炎的免疫反應(yīng)中起到中樞作用，作為一種能趨化中性多形核白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子，它能夠介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)[2]，對(duì)于研究?jī)?nèi)毒素耐受對(duì)牙周組織的炎癥和免疫反應(yīng)的影響具有非常重要的意義。

內(nèi)毒素即脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞劑效關(guān)系及IL-8分泌的研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察牙周膜成纖維細(xì)胞在不同濃度內(nèi)毒素刺激下其細(xì)胞增殖以及IL-8分泌合成釋放的研究。對(duì)內(nèi)毒素刺激下PDLFs模型的建立進(jìn)行探索，為治療控制牙周炎發(fā)生發(fā)展提供資料。

1．材料和方法

1．1 材料DMEM培養(yǎng)基(GE，美國(guó))；10%胎牛血清(FBS)、0．25%胰蛋白酶(thermo,美國(guó))；100U/m l青霉素、100U/m l鏈霉素(灝洋，中國(guó))；PBS溶液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；5% MTT溶液(R&D公司，美國(guó))；內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、Tris溶液、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma,美國(guó))；I型膠原酶、角蛋白單抗、波形絲蛋白單抗體、SABC免疫組化試劑盒、IL-8 ELISA 試劑盒(博士德生物工程有限公司，中國(guó))；針頭濾器0．22μm(m illipore，美國(guó))；去離子水。

1．2 牙周膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

1．2．1 納入排除標(biāo)準(zhǔn)選擇解放軍總醫(yī)院口腔頜面外科因正畸要求拔除的12-16歲的健康的無(wú)齲病、牙髓病、根尖周病、牙周疾病，未進(jìn)行過(guò)治療的前磨牙。所有患者無(wú)全身系統(tǒng)性疾病，無(wú)吸煙史，半年內(nèi)未服用過(guò)抗生素。所得牙齒均征得患者及家長(zhǎng)同意，并簽署知情同意書(shū)。該實(shí)驗(yàn)已得到解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。(倫理委員會(huì)審批批號(hào)：倫理第S2015-097-02號(hào))

1．2．2 人牙周膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定無(wú)菌條件下刮除根中1/3牙周膜進(jìn)行培養(yǎng)，加入0．2%I型膠原酶進(jìn)行震蕩消化，10%胎牛血清高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)后，CO2恒溫箱孵育。每3天換液，直至細(xì)胞爬出，培養(yǎng)2-3周，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%進(jìn)行傳代。培養(yǎng)3-6代牙周膜成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。牙周膜成纖維細(xì)胞鑒定同本實(shí)驗(yàn)室組[3]。

1．3 溶液配制LPS溶液：按說(shuō)明用PBS配置成1μg/m l LPS、10μg/m l LPS、100μg/m l LPS、200μg/m l LPS、500μg/m l LPS，針頭濾器過(guò)濾，備用。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BFGF)：按說(shuō)明用Tris溶液溶解成10μg/m l的BFGF溶液備用。

1．4 分組本實(shí)驗(yàn)共分為7組，每組6個(gè)樣本。第一組PDLFs、第二組PDLFs+10μg/m l BFGF、第三組1μg/m l LPS、第四組10μg/m l LPS、第五組100μg/m l LPS、第六組200μg/m l LPS、第七組500μg/m l LPS、觀察各組牙周膜成纖維細(xì)胞在不同濃度的LPS微環(huán)境下細(xì)胞生長(zhǎng)增殖以及IL-8分泌合成釋放情況。

1．5 MTT檢測(cè)牙周膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖將第5代牙周膜成纖維細(xì)胞4×103/m l每孔接種于96孔板，PDLFs接種培養(yǎng)24h，鏡下觀察牙周膜成纖維細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)狀態(tài)良好，于24h、48h、72h、96h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)其牙周膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。方法：吸凈培養(yǎng)液，PBS溶液漂洗2遍，每孔加MTT溶液20μl。37度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，吸凈MTT液。每孔依次加150μl二甲基亞砜，振蕩10m in，使結(jié)晶物能夠充分融解。酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀于490nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度(OD值)，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1．6 IL-8 的檢測(cè)將第5代牙周膜成纖維細(xì)胞4×103/m l每孔接種于96孔板，PDLFs接種培養(yǎng)24h，鏡下觀察牙周膜成纖維細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)狀態(tài)良好，取24h、96h細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心后-80度保存，采用ELISA法檢測(cè)IL-8因子的分泌合成釋放情況。ELISA法檢測(cè)步驟如下：配置標(biāo)準(zhǔn)品，加入樣品標(biāo)準(zhǔn)品至96孔板，空白組為樣品稀釋液。酶標(biāo)板封膜后37度反應(yīng)90m in。甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，每孔加抗體工作液，空白孔除外。酶標(biāo)板封膜后37度反應(yīng)60m in。一倍洗滌液洗3次，每次浸泡1m in。加入親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物工作液(空白孔除外)。酶標(biāo)板封膜反應(yīng)30m in。一倍洗滌液洗5次，每次浸泡1-2m in。每孔加入90ul顯色液，37度避光20-25m in。每孔加入100μl終止液，酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定吸光度值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖采取重復(fù)測(cè)量方差分析，IL-8因子的分泌合成釋放采用組間單因素方差分析后與對(duì)照組比較。

2．結(jié)果

2．1 細(xì)胞增殖情況(見(jiàn)表1，圖1-4) BFGF刺激的牙周膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)呈線性上升，證明PDLFs與BFGF有著良好的應(yīng)答關(guān)系。與PDLFs組相比，1μg/m l LPS組、100μg/m l LPS組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)；10μg/m l LPS組促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．01)；200μg/m l LPS組、500μg/m l LPS組抑制牙周膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．01)。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。200μg/m l LPS、500μg/m l LPS組促進(jìn)IL-8分泌，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．01)。

圖1 96h,500μg/m l LPS組(×200)

圖2 96h,正常PDLFs組(×200)

圖3 96h,BFGF組(×200)

圖4 MTT法檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力

表2 不同濃度LPS刺激細(xì)胞后各組IL-8分泌測(cè)量OD值(n=6)

表1 MTT法檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力(n=6)

2．2 與牙周膜成纖維細(xì)胞相比，IL—8分泌合成釋放情況(見(jiàn)表2，表3，圖5，圖6)

2．2．1 (24h)與正常牙周膜成纖維細(xì)胞組相比1μg/m l LPS、10μg/m l LPS、100μg/m l LPS組無(wú)

2．2．2 (96h) 與正常牙周膜成纖維細(xì)胞組相比1μg/m l LPS、10μg/m l LPS組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。100μg/m l LPS、200μg/m l LPS組促進(jìn)IL-8分泌，100μg/m l LPS、200μg/m l LPS組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。500μg/m l LPS組抑制IL-8分泌，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．01)。

表3 不同濃度LPS刺激細(xì)胞后各組IL-8分泌測(cè)量(pg/m l)(n=6)

圖5 ELISA IL-8標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 LPS刺激細(xì)胞后各組IL-8分泌量*表示與PDLFs組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)

3．討論

內(nèi)毒素是牙周病原菌的重要的毒力因子之一，也是一種潛在的細(xì)胞激活因子，對(duì)牙周組織有較高的毒性及抗原性，是牙周炎的主要病因之一，它可以直接作用于牙周組織細(xì)胞[4,5], 而長(zhǎng)期的LPS刺激可能使機(jī)體對(duì)后續(xù)刺激的反應(yīng)性降低，即產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受[6]。牙周組織處于炎癥狀態(tài)下，內(nèi)毒素耐受可能因機(jī)體不能及時(shí)有效清除入侵細(xì)菌，導(dǎo)致炎癥遷延[7]。牙周膜成纖維細(xì)胞在牙周組織健康中承擔(dān)著重要的角色[1],內(nèi)毒素會(huì)直接影響牙周膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖, 并對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有不同程度的損傷[8]。PDLFs 作為牙周膜主要細(xì)胞之一具有多種細(xì)胞生物學(xué)活性[8], 其損傷會(huì)給牙周組織的健康帶來(lái)嚴(yán)重的危害,阻礙牙周組織的再生與修復(fù)。在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，內(nèi)毒素參與牙槽骨、牙齦、牙周韌帶的炎癥破壞和喪失[9]。避免持續(xù)LPS刺激導(dǎo)致的過(guò)度反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成的損傷，是宿主防御機(jī)制的重要組成部分[10]，維持在一定范圍內(nèi)的內(nèi)毒素含量，維護(hù)牙周組織的健康，避免免疫系統(tǒng)的過(guò)度活化產(chǎn)生大量的炎癥因子，引發(fā)嚴(yán)重的免疫破壞，引起組織損傷，對(duì)于牙周炎的治療和預(yù)后具有重要的意義[11]，值得進(jìn)一步研究。

在牙周炎發(fā)生發(fā)展期間，IL-8承擔(dān)重要作用，作為免疫調(diào)節(jié)因子促使破骨細(xì)胞分化、成熟、維持骨吸收活性，而作為促炎因子參與牙周組織破壞。內(nèi)毒素和其他因子刺激下，中性粒細(xì)胞以及骨代謝體系中的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都有IL-8的生成[12]。因此，IL-8是參與牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程和牙槽骨吸收病理代謝過(guò)程之中因子之一。但其表達(dá)受到多種牙周致病刺激因素的影響[13]。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同濃度LPS對(duì)hPDLFs生長(zhǎng)增殖以及分泌IL-8的影響。牙周膜成纖維細(xì)胞會(huì)隨時(shí)間的生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)平臺(tái)期，本實(shí)驗(yàn)在96h時(shí)細(xì)胞達(dá)到最高峰。在IL-8檢測(cè)時(shí)選取24h細(xì)胞貼壁后細(xì)胞生長(zhǎng)初級(jí)階段，96h細(xì)胞生長(zhǎng)最高峰階段，對(duì)比兩階段的各組細(xì)胞分泌IL-8的情況。本實(shí)驗(yàn)表明短時(shí)間的低劑量的LPS與正常的牙周膜成纖維細(xì)胞分泌IL-8并無(wú)差異，而短時(shí)間高劑量的LPS會(huì)促進(jìn)IL-8的生成。從而促進(jìn)炎癥的加速進(jìn)展，破壞牙周組織。而96小時(shí)100μg/m l LPS, 200μg/m l LPS會(huì)促進(jìn)IL-8的分泌。1μg/m l LPS、10μg/m l LPS與正常牙周膜成纖維細(xì)胞相比無(wú)差別。牙周膜作為免疫應(yīng)答細(xì)胞可以修復(fù)一定范圍的炎癥，從而達(dá)到牙周組織微環(huán)境的平衡。長(zhǎng)時(shí)間的高濃度的LPS刺激下已經(jīng)超過(guò)了PDLFs的調(diào)節(jié)范圍。從而加速牙周炎的發(fā)生發(fā)展。使其促進(jìn)IL-8的分泌從而加速破壞牙周組織，阻礙牙周膜成纖維細(xì)胞的自我修復(fù)。過(guò)高濃度的LPS顯著抑制牙周膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。96h時(shí)500μg/m l LPS組IL-8分泌合成釋放量明顯下降?？赡茉蚴?，高劑量的LPS明顯抑制PDLFs生長(zhǎng)增殖，甚至促進(jìn)PDLFs的凋亡。BFGF明顯促進(jìn)PDLFs生長(zhǎng)增殖，導(dǎo)致IL-8合成釋放也明顯增加，在24h,兩組細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著差異，IL-8亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。96h時(shí)兩者細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有顯著差異，IL-8分泌合成釋放也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BFGF組細(xì)胞增殖明顯高于對(duì)照組、IL-8分泌合成亦高于對(duì)照組。故而說(shuō)明IL-8分泌合成釋放與PDLFs數(shù)量有關(guān)。500μg/m l LPS顯著抑制PDLFs生長(zhǎng)增殖。后期在細(xì)胞凋亡時(shí)IL-8分泌合成釋放會(huì)隨之減少。100μg/m l LPS無(wú)明顯促進(jìn)或抑制牙周膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，且會(huì)促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞分泌IL-8分泌，為較理想的LPS耐受模型的濃度，為后期實(shí)驗(yàn)作為鋪墊。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10μg/m l LPS可以促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，1μg/m l LPS、100μg/m l LPS與正常牙周膜成纖維細(xì)胞增殖無(wú)差別。200μg/m l LPS、500μg/m l LPS抑制牙周膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。96h，IL-8分泌合成釋放實(shí)驗(yàn)觀察：100μg/m l LPS刺激合成分泌釋放IL-8量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常PDLFs組。不同濃度的LPS對(duì)PDLFs增殖、IL-8分泌具有調(diào)節(jié)作用。100μg/m l LPS更適合建立內(nèi)毒素耐受模型，為內(nèi)毒素作用下對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞的影響提供資料。

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Effectsof lipopolysaccharideson the proliferation and IL-8 secretion of periodontal ligam ent fibroblasts

FUChang-sheng,LIURong-sen,LUO Yun,OU Long,LIYing-chao,ZHANGXian-hua,WANG Jun,DUYan(Departmentof Somatology,Chinese PLAGeneralHospital,Beijing 100853,China)

Objective:To observe the effects of different concentrations of lipopolysaccharides on the proliferation of periodontal ligament fibroblasts and the secretion of IL-8. M ethods:The experiments were divided into seven groups, human periodontal ligament fibroblasts (hPDLFs) group, PDLFs + 10μg/m l basic fibroblast grow th factor (BFGF) group, 1μg/m l LPS group, 10μg/m l LPS group, 100μg/m l LPS group, 200μg/m l LPS group, 500μg/m l LPS group. The cells w ere cultured and MTT assay was used to observe the cell proliferation. The cell supernatant after cultured for 24h and 96h was collected of IL-8 ELISA. Results:Synthesis and release of IL-8: Com pared w ith periodontal ligament fibroblasts group, there were no statistically significant differences in 1μg/m l LPS, 10μg/m l LPS and 100μg/m l LPS groups after cultured for 24h; significant statistical differences were detected in 200μg/m l LPS, 500μg/m l LPS groups. Compared w ith periodontal ligament fibroblasts group, there were no statistically significant differences in 1μg/m l LPS and 10μg/m l LPS group after cultured for 96h; significant statistical differences were detected in 100μg/m l LPS, 200μg/m l LPS, 500μg/m l LPS groups, there was no significant difference between 100μg/m l LPS and 200μg/m l LPS group. Proliferation of human periodontal ligament fibroblasts: there were no statistically significant differences between 1μg/m l LPS, 100μg/m l LPS and controlgroups. The promotion of the proliferation of periodontal ligament fibroblasts was observed in 10μg/m l LPS group. 200μg/m l LPS, 500μg/m l LPS significantly inhibited the proliferation of PDLFs. Conclusion:Different concentrations of lipopolysaccharides can regulate the proliferation of periodontal ligament fibroblasts and the synthesis and release of IL-8. Keywords:lipopolysaccharides; periodontal ligament fibroblasts; IL-8

R781．4

A

1672-2973(2017)02-0082-05

2016-10-09)

付昌盛 解放軍總醫(yī)院口腔科碩士生北京100853

劉榮森 通訊作者解放軍總醫(yī)院口腔科主任醫(yī)師教授北京100853

羅蕓 解放軍總醫(yī)院老年病醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞生物研究室副研究員北京100853

歐龍 解放軍總醫(yī)院口腔科副主任醫(yī)師北京100853

李穎超 解放軍總醫(yī)院口腔科副主任醫(yī)師北京100853

張賢華 解放軍總醫(yī)院口腔科副主任醫(yī)師北京100853

王珺 海軍機(jī)關(guān)門(mén)診部口腔科副主任醫(yī)師北京100841

杜巖 解放軍總醫(yī)院口腔科主治醫(yī)師北京100853